Methodenartikel

Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels

DOI:

10.3791/60138

⸱

26 oktober 2021

 , 
1Poxvirus and Rabies Branch, Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een immunohistochemisch testprotocol voor de detectie van rabiësvirusantigeen als een alternatieve diagnostische test voor formaline-gefixeerde weefsels.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de primaire diagnostische modaliteiten voor hondsdolheid is de detectie van viraal ribonucleoproteïne (RNP) complex (antigeen) in de geïnfecteerde weefselmonsters. Hoewel de direct fluorescerende antilichaam (DFA) -test of de directe snelle immunohistochemische test (DRIT) het meest worden gebruikt voor de antigeendetectie, vereisen beide tests verse en / of bevroren weefsels voor afdrukken op dia's voorafgaand aan de antigeendetectie met behulp van antilichamen. Als monsters worden verzameld en gefixeerd in formaline, is geen van beide tests optimaal voor de antigeendetectie, maar testen kunnen worden uitgevoerd door conventionele immunohistochemie (IHC) na inbedding in paraffineblokken en secties. Met deze IHC-methode worden weefsels gekleurd met anti-rabiësantistoffen, secties worden gedeparaffineerd, antigeen opgehaald door gedeeltelijke proteolyse of andere methoden en geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen. Antigenen worden gekleurd met mierikswortelperoxidase / amino-ethylcarbide en counterstained met hematoxyline voor de visualisatie met behulp van een lichtmicroscoop. Naast de specifieke antigeendetectie biedt formalinefixatie andere voordelen, zoals de bepaling van histologische veranderingen, ontspannen omstandigheden voor monsteropslag en -transport (onder omgevingstemperaturen), de mogelijkheid om retrospectieve gevallen te testen en verbeterde biologische veiligheid door de inactivatie van infectieuze agentia.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rabiës is een acute progressieve encefalitis veroorzaakt door de negatieve zin RNA-virussen die behoren tot het geslacht lyssavirus1. Bijna 99% van alle menselijke sterfgevallen veroorzaakt door de infectie met rabiësvirus (RABV), het type lid van het geslacht, wordt overgedragen door honden2. Rabiësdiagnose van verdachte dieren is gebaseerd op de detectie van antigeen (voornamelijk viraal gecodeerd nucleoproteïne, N-eiwit) in complex met genomisch RNA (ribonucleoproteïnecomplex, RNP) in het hersenweefsel3. De antigeendetectie door de direct fluorescerende antilichaam (DFA) -test wordt beschouwd als de gouden standaard voor de diagnose van hondsdolheid4. De methode maakt gebruik van vers of vers bevroren hersenmateriaal, een aanraakimpressie op een dia, fixatie in aceton, kleuring met behulp van in de handel verkrijgbare fluorescerende isothiocyanaat (FITC) gelabelde monoklonale of polyklonale antilichamen (mAbs / pAbs) en gelezen door de fluorescentiemicroscopie5. De DFA-test is snel, gevoelig en specifiek voor rabiës-antigeendetectie in vers hersenweefsel. Onlangs werd aangetoond dat een directe snelle immunohistochemische test (DRIT), gemodificeerde immunohistochemie (IHC) -techniek, een vergelijkbare gevoeligheid vertoont voor DFA, maar biedt het voordeel van lichtmicroscopie voor visualisatie6. Hoewel de detectiemethode die in DRIT wordt gebruikt, vergelijkbaar is met IHC, maakt de eerste stap gebruik van verse of bevroren weefsels om aanraakafdrukken van het monster te genereren, gevolgd door fixatie in formaline.

IHC is een veelgebruikte techniek om histologische veranderingen en detectie van eiwitten te bepalen met behulp van specifieke antilichamen in formaline-gefixeerde weefsels ingebed in paraffineblokken. IHC is een gevestigde alternatieve test voor de detectie van rabiësantigeen in de weefselsecties7. IHC is met name gebruikt voor de diagnose van retrospectieve gevallen die neurologische ziekten vertoonden om de last van hondsdolheid te bepalen8. Paraffine-ingebedde formaline-gefixeerde weefsels behouden de eiwitten voor de detectie, zelfs na enkele jaren wanneer ze bij omgevingstemperatuur worden bewaard9. Formalinebehandeling wijzigt eiwitten door de aminozuurzijketens te verknopen en te veranderen, waardoor de epitopen mogelijk niet langer reactief zijn tegen antilichamen10. Hoewel de IHC-test voor rabiës-antigeendetectie mAbs of pAbs omvat, is de laatste voordelig omdat meerdere epitopen en divergente lyssavirussen kunnen worden gedetecteerd11.

De standaardstappen die betrokken zijn bij IHC zijn formalinefixatie van weefsels, inbedding in paraffineblokken, sectie van weefsels, deparaffinisatie en hydratatie, epitoopherstel, reactiviteit tegen primaire en secundaire antilichamen en de ontwikkeling met behulp van chromogene substraten. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd verslag van het protocol voor de diagnose van hondsdolheid. Voor de detectie van rabiësantigeen worden muizenserum geïmmuniseerd met RABV (pAbs) gegenereerd bij de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, in combinatie met gebiotinyleerde antimuis secundaire antilichamen gebruikt. Gebiotinyleerde abs worden gedetecteerd door de toevoeging van streptavidin-mierikswortelperoxidase (HRP) -complex gevolgd door de kleurontwikkeling met amino-ethylcarbazolsubstraat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel het IHC-protocol werd uitgevoerd op formaline-gefixeerde weefsels, die RABV inactiveren indien aanwezig, moeten de juiste bioveiligheidsprotocollen correct worden gevolgd. Alle bioveiligheidsprocedures worden beschreven in de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), inclusief het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en vaccinatieplicht zoals beschreven12. Bovendien moet de juiste insluiting en behandeling van gevaarlijke chemicaliën (zoals formaline, AEC en xyleen) worden gevolgd (bijv. zuurkasten).

1. Formaline fixatie van weefsels

  1. Plaats 3-5 mm hersenweefsel verzameld na obductie13 in 10% fosfaat gebufferde formaline-oplossing (1:20 tot 1:50 weefsel/formaline verhouding) gedurende 24-72 uur.
    LET OP: Formaline is een toxisch fixatief.
  2. Noteer het geschatte weefselgewicht (grootte), weefseltype (hersengebieden) en volume formaline. Het is belangrijk voor laboratoria om fixatietijden te documenteren en bij te houden.
  3. Voor langere weefselopslag na formalinefixatie en voorafgaand aan de verwerking, plaatst u het weefsel in 70% ethanol.

2. Weefselbewerking

  1. Na de fixatie van het monster, ontleedt u het weefsel om de belangrijke hersengebieden op te nemen, bijvoorbeeld doorsneden van de hersenstam, het cerebellum (3 lobben) of de hippocampus (beide hippocampi) die elk 3 tot 5 mm dik snijden en in verwerkingscassettes worden geplaatst.
  2. Verwerk de weefselcassettes voor paraffine-infiltratie, ingebed in paraffineblokken en gesegmenteerd (3 tot 6 μm) op een microtoom.

3. Bereiding van materialen / vlekken op gerechten

  1. Stel de kleurschaal14 (Materialentabel) inzoals weergegeven in figuur 1. Vul elke schaal met 250 ml van de oplossing.
  2. Bereiding van de 3-Amino-9-ethylcarbizole (AEC) substraat stock oplossing
    1. Los een tablet van 20 mg 3-amino 9-ethylcarbazol (AEC) op in 5 ml N,N, dimethylformamide met behulp van een glazen pipet.
      LET OP: AEC is kankerverwekkend.
  3. Bereiding van de protease (bijv. Pronase) stamoplossing voor het ophalen van antigeen
    1. Los 7 mg van het protease op in 200 ml PBS.
  4. Voorbereiding van de spoelbuffer PBS-T
    1. Voeg 10 ml Tween 80 tot 990 ml PBS toe. Meng het goed om een homogene oplossing te vormen.

4. Deparaffinisatie en weefselrehydratatie

  1. Maak een paraffinesectie van 5 μm met behulp van een microtoom, drijf het op een waterbad bij 38 °C en verzamel op glazen dia's. Label de dia's met een reagensbestendige pen/marker.
  2. Plaats de glaasjes op een schaal en smelt gedurende 1 uur in een oven van 55-60 °C. Verhoog de temperatuur niet boven de 60 °C, omdat dit het virale antigeen kan vernietigen.
  3. Haal de glaasjes uit de oven en deparaffiniseer onmiddellijk in 3 opeenvolgende xyleenspoelingen van elk 5 min in de vaat 1, 2 en 3.
  4. Rehydrateer de secties op de dia door sequentiële onderdompelingen in afnemende verdunning van ethanol tot gedeïoniseerd water: (4 tot en met 11 is een duikspoeling) schotel 4: xyleen / 100% ethanol (1: 1); schotel 5: 100% ethanol; schotel 6: 100% ethanol; schotel 7: 95% ethanol; schotel 8: 95% ethanol; schotel 9: 80% ethanol; schotel 10: 70% ethanol; schotel 11: gedeoniseerd water (Figuur 1. Schotelopstelling).
    LET OP: Xyleen is een gevaarlijke chemische stof en het werk moet worden uitgevoerd in een zuurkast.

5. Proteolytisch antigeen ophalen

  1. Behandel dia's met het protease (2,5 μg/ml PBS) gedurende 30 minuten voor het ophalen van proteolytische antigeen in schotel 12.
  2. Daarna 10 min afspoelen in PBS-T (schaal 13).
  3. Behandel met 3% waterstofperoxide gedurende 10 min (schotel 14).
  4. Nogmaals, wassen met PBS-T gedurende 10 minuten (schotel 15).

6. Kleuringsprocedure

  1. Behandel dia's één voor één en houd de resterende dia's ondergedompeld in de buffer (verwijder niet de hele diahouder - houd dia's nat). Verwijder één dia en dep overtollige buffer (met behulp van een papieren handdoek) van rond het tissuegedeelte, zorg ervoor dat u het tissuegedeelte niet verstoort. Incubeer glijden in een vochtigheidskamer, gemaakt door het plaatsen van bevochtigde papieren handdoeken, op de labbank top14 bij kamertemperatuur met normaal geitenserum (blokkeren) gedurende 15 minuten.
  2. Incubeer met de optimale vooraf bepaalde verdunning primair anti-rabiës antilichaam (1:250 verdunning van muizen anti-rabiës serum, ongepubliceerd) (positieve controle) en negatieve controle antilichamen bij kamertemperatuur hetzelfde als hierboven (stap 6.1.) gedurende 60 minuten zonder wasbeurten ertussen.
  3. Na 60 min, wassen met PBS-T gedurende 10 min (schotel 16).
  4. Incubeer met het gebiotinyleerde antilichaam (soortspecifiek) in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten (behandeling hetzelfde als stap 6.1.).
  5. Wassen met PBS-T gedurende 10 min (schotel 16).
  6. Incubeer met Streptavidin-HRP-complex in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten (behandeling hetzelfde als 6.1.).
  7. Wassen met PBS-T gedurende 10 min (schotel 16).
  8. Incubeer met peroxidasesubstraat, amino-ethylcarbazol (AEC), in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Maak AEC vlak voor gebruik. Voeg hiervoor 1 ml AEC-voorraadoplossing toe aan 14 ml acetaatbuffer van 0,1 m, pH 5,2. Voeg 0,15 ml van 3% H2O2toe. Filtreer het mengsel vlak voor gebruik (0,45 μm filter).
    OPMERKING: De werkoplossing van AEC is slechts 2-3 uur stabiel. De AEC-voorraadoplossing kan langer in de koelkast worden bewaard.
  9. Wassen in gedeïoniseerd water 10 min (schotel 17)
  10. Counterstained met Gill's Hematoxyline verdund 1:2 met gedeïoniseerd water gedurende 2 min (schotel 18).
  11. Spoel overtollige Hematoxyline af met gedeioniseerde waterspoeling (schaal 19 en 20).
  12. Spoel af in Scott's Kraanwater 30 s (blusoplossing) schaal 21.
  13. Wassen in gedeïoniseerd water 10 min (schotel 22)
  14. Verwijder dia's één voor één - monteer met in water oplosbaar montagemedium.
  15. Lees dia's op een lichtmicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2 toont representatieve IHC-kleuringsresultaten van positieve en negatieve controlemonsters in verschillende geteste hersenweefsels. Figuur 2A,D,G vertegenwoordigt positieve monsters bij 200x, terwijl figuur 2B,E,H overeenkomt met respectievelijk 400x vergroting. Figuur 2A-C komt overeen met de hersenstam;

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vanwege het hoge sterftecijfer van hondsdolheid na het begin van de symptomen, is de diagnose van verdachte dieren voor RABV-infectie uiterst kritisch voor een geschikte profylactische behandeling na blootstelling. De diagnose van hondsdolheid hangt voornamelijk af van DFA-, DRIT- en PCR-gebaseerde technieken met behulp van verse of bevroren weefsels. Voor het testen van formaline-gefixeerde weefsels biedt de IHC-test een alternatieve methode voor de gevoelige en specifieke detectie van RABV-antigeen. Terwijl de weefsels...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken de laboratoria, epidemiologen en gelieerde ondernemingen met volksgezondheidsafdelingen voor het indienen van monsters bij de Centers for Disease Control and Prevention. De bevindingen en conclusies in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de Centers for Disease Control and Prevention. Het gebruik van handelsnamen en commerciële bronnen is alleen voor identificatie en impliceert geen goedkeuring door de Centers for Disease Control and Prevention.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3% waterstofperoxidePharamacy merkenOff the shelf 3% H2O2
3-Amino-9-ethylcarbazool (AEC)Millipore SigmaA6926
Acetaat Buffer pH 5,2Poly Scientific R&D Corp.s140
Buffered Formaline 10% Fosfaat BufferedFisher ScientificSF100-4Gecertificeerd
Dekglazen CorningFisher Scientific12-553-47124 X 50 mm
Ethanol 190 ProofPharmco-AAPER111000190
Ethanol 200 ProofPharmco-AAPER111000200
Gill's hematoxylinen formule #2Fisher ScientificCS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kitseracare71-00-18Muis Primair Antilichaam 
ImmunoHistoMountMillipore Sigmai1161Montage media
N,N, Dimethyl formamide GRFisher ScientificD119
Fosfaat Buffered Saline HyCloneRR14440.0101M, pH 7,2 (pH 7,2-7,6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 ObjectiefMeerdere leveranciers
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 ObjectiefMeerdere leveranciers
PronaseMillipore Sigma53702Protease, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water Poly Scientific R&D Corp.s1887
Tissue-Tek Slide kleuren setFisher Scientific50-294-72
TWEEN-80 Millipore SigmaP1754
XyleenFisher ScientificX3S-4Histologisch Grade
Zeiss Axioplan 2 beeldvorming - microscoopMeerdere leveranciers

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
  3. Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
  4. WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).
  5. Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
  6. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  7. Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
  8. Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
  9. Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
  10. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  11. Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
  12. Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
  13. WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
  14. Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  15. Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
  16. WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
  17. Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Rabi virusantigeenparaffine inbeddingantigeenherstelAEC substraatlichtmicroscopieproteasebehandelinghematoxyline tegenkleuringPBS T buffer

Gerelateerde artikelen