Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

Samenvatting

Macrofagen, vooral primaire macrofagen, zijn uitdagend om te transfect als ze gespecialiseerd zijn in het opsporen van moleculen van niet-eigen oorsprong. We beschrijven een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen mogelijk maakt met mRNA gegenereerd uit DNA-templates zoals plasmiden.

Samenvatting

Macrofagen zijn fagocytische cellen gespecialiseerd in het opsporen van moleculen van niet-eigen oorsprong. Daartoe zijn ze uitgerust met een groot aantal patroon herkennings receptoren (PRRs). Helaas maakt dit ook macrofagen bijzonder uitdagend om te transfect als het transfectie-reagens en de getransfuneerde nucleïnezuren vaak worden herkend door de PRRS als niet-zelf. Daarom resulteert transfectie vaak in macrofaag activatie en afbraak van de getransfunde nucleïnezuren of zelfs bij zelfmoord op de macrofagen. Hier beschrijven we een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van Murine primaire macrofagen zoals peritoneale macrofagen (PM) en met beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) mogelijk maakt met mRNA in vitro getranscribeerd uit DNA-templates zoals plasmiden. Met dit eenvoudige protocol worden transfectie percentages van ongeveer 50-65% voor PM en ongeveer 85% voor BMDM bereikt zonder cytotoxiciteit of immunogeniciteit waargenomen. We beschrijven in detail de generatie van mRNA voor transfectie van DNA-constructies zoals plasmiden en de transfectie-procedure.

Inleiding

Macrofagen zijn fagocytische cellen die gespecialiseerd zijn in het opsporen, inname en vernederende microben, apoptotische cellen en cellulair puin. Bovendien, ze helpen om het orthese van immuunresponsen door het afscheidende cytokines en chemokines en door het presenteren van antigenen aan T-cellen en B-cellen. Macrofagen spelen ook belangrijke rollen in tal van andere processen, zoals wondgenezing, atherosclerose, tumorvorming en obesitas.

Om niet-zelf moleculen zoals pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en out-of-place moleculen zoals schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) te kunnen detecteren, zijn macrofagen uitgerust met een groot aantal patroon herkennings receptoren (PRR)¹. Helaas maakt dit ook macrofagen bijzonder uitdagend voor transfect² , omdat de transfectie-^{reagens 3} en de geoverde nucleïnezuren^4,5,6,7 vaak door de PRRS worden herkend als niet-zelf. Om deze reden, transfectie van macrofagen met behulp van chemische of fysische methoden⁸ resulteert meestal in macrofaag activering en afbraak van de getransfuneerde nucleïnezuren of zelfs in macrofaag zelfmoord via pyroptosis, een vorm van geprogrammeerde lytische celdood geactiveerd na herkenning van cytosolische pamps/DAMPS zoals DNA of buitenlandse RNA⁹. Biologische transfectie van macrofagen met behulp van virussen zoals adenovirussen of lentivirussen als vectoren is vaak efficiënter, maar de bouw van dergelijke virale vectoren is tijdrovend en vereist bioveiligheid niveau 2-apparatuur^10,11.

Dus, hoewel macrofagen het onderwerp zijn van intensief onderzoek, wordt de analyse van hun functies op moleculair niveau belemmerd, omdat een van de belangrijkste instrumenten van moleculaire biologie, de transfectie van nucleïnezuur constructies voor exogene expressie van eiwitten, is nauwelijks toepasbaar. Dit dwingt onderzoekers vaak macrofaag-achtige cellijnen te gebruiken in plaats van bonafide macrofagen. Toepassingen voor nucleïnezuur construct trans fectie omvatten expressie van gemuleerde of gelabelde eiwit versies, overexpressie van een specifiek eiwit, eiwit re-expressie in een respectieve Knockout achtergrond en expressie van eiwitten van andere soorten (bijv. , CRE of of leid RNA en Cas9 voor gerichte genen knock-out).

Hier beschrijven we een protocol dat zeer efficiënte transfectie van (meestal moeilijk te transfect) primaire macrofagen toestaat, dat is Murine peritoneale macrofagen (PM) en met beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) met mRNA gegenereerd uit DNA-sjablonen zoals plasmiden. Belangrijk is dat de in vitro getranscribeerde mRNA die met dit protocol is gegenereerd, de natuurlijk voorkomende gemodificeerde nucleosiden 5-methyl-CtP en pseudo-UTP bevat die de immunogeniciteit verminderen en de stabiliteit verhogen^4,6,7,12,13. Bovendien worden de 5 '-uiteinden van de in vitro getranscribeerde mRNA gedefosforyleerd door Antarctische fosfatase om herkenning door de Rig-I complex^14,15te voorkomen. Dit minimaliseert de aangeboren immuunherkenning van de in vitro getranscribeerd mRNA. Met ons eenvoudig uit te voeren protocol worden transfectie percentages tussen 50-65% (peritoneale macrofagen (PM)) en 85% (BMDM) bereikt terwijl, belangrijker nog, er geen cytotoxiciteit of immunogeniciteit is waargenomen. We beschrijven in detail (i) hoe de immunologisch gesilenced mRNA voor Transfectie kan worden gegenereerd uit DNA-constructies zoals plasmiden en (II) de transfectie procedure zelf.

Protocol

Macrofaag isolatie van muizen werd uitgevoerd in overeenstemming met de Dierenbeschermings wetgeving van Duitsland in overeenstemming met de ethische commissie van de Universiteit van Keulen.

Opmerking: Voer alle stappen uit die handschoenen dragen. Voer alle transfectiestappen uit onder een laminaire stroom afzuigkap om besmetting van de cellen te voorkomen. Reinig voordat u met mRNA werkt alle instrumenten zoals pipetten en elk oppervlak met 70% ethanol en/of een RNAse-vernederende oppervlakteactieve stof (tabel met materialen). Zorg ervoor dat alle reactie buisjes RNAse-vrij en steriel zijn. Gebruik alleen steriel, RNAase-vrij water voor verdunningen. Gebruik uitsluitend pipetpunten met filters. Pipetpunten wijzigen na elke Pipetteer stap.

1. generatie van de DNA-template

Opmerking: De DNA-template voor in-vitro mRNA transcriptie met dit protocol moet een T7 promotor sequentie bevatten om de RNA polymerase te kunnen docken. Als het plasmide met de DNA-sequentie van het eiwit van belangstelling al een correct georiënteerde T7 promotor-sequentie bevat die direct stroomopwaarts van de volgorde van belang is, moet de linearisatie van het plasmide (zie stap 1,1.) worden uitgevoerd. Sluit anders een T7 promotor aan op de volgorde van de polymerase kettingreactie (PCR, zie stap 1,2.).

1. Linearisatie van T7 promotor-bevattende plasmiden
   1. Linearize plasmiden bevatten al een correct georiënteerde T7 promotor-sequentie door spijsvertering met een restrictie-enzym dat stroomafwaarts van de stop codon van de sequentie van belang is. Anders wordt transcriptie niet correct beëindigd na de volgorde van belangstelling.
      Opmerking: Het beste is om restrictie enzymen te gebruiken die botte uiteinden of 5 ' uitsteeklengten verlaten.
   2. Bevestig volledige linearisatie van het plasmide door agarose gel elektroforese van onverteerd versus verteerd plasmide DNA.
   3. Reinig gelineariseerde plasmide DNA voorafgaand aan gebruik als DNA-template voor in-vitro mRNA-transcriptie met behulp van een DNA-zuiverings pakket (tabel met materialen).
2. Bevestiging van de T7 promotor door PCR
   1. Gebruik een voorwaartse primer met de volgende componenten (in de aangegeven volgorde van 5 ' tot 3 '): ongeveer 5 willekeurige BP stroomopwaarts van de promotor (bijv. GAAAT); de T7 promotor-reeks (TAATACGACTCACTATAG); twee extra GS voor verhoogde transcriptie efficiëntie (GG); het doel sequentie-specifieke deel dat homoloog is aan de plasmide sequentie rond de start codon.
      Opmerking: Het moet bestaan uit: 3-6 BP stroomopwaarts van de KOZAK-sequentie en start codon, de KOZAK-sequentie en start codon (meestal GCCACC ATG G), 12-18 BP stroomafwaarts van de start codon. Als de volgorde van de rente niet al een KOZAK-sequentie of start codon bevat, kunnen deze in deze stap worden bevestigd door ze simpelweg in de primer volgorde te laten opnemen.
   2. Bereken de t_m van de voorwaartse primer alleen door rekening te houden met het deel dat homoloog is aan de doel volgorde.
   3. Om te beoordelen dimers/haarspeld vorming gebruik maken van de gehele primer sequentie, die gemakkelijk kan overschrijden 50 BP.
   4. Gebruik een omgekeerde primer gelegen ergens stroomafwaarts van de halte codon.
      Opmerking: Als de volgorde van de rente nog geen stop codon bevat, kan deze in deze stap worden bevestigd door deze simpelweg in de primer volgorde te laten opnemen.
   5. Gebruik de voorwaartse en omgekeerde primers om een PCR uit te voeren met behulp van een high-fidelity polymerase met proeflezen (tabel met materialen).
   6. Bevestig het genereren van een enkel product en ampliconlengte voor temp grootte door agarose gel elektroforese (bijvoorbeeld, gebruik een 1% agarose gel en 100 V constante stroom).
   7. Reinig het PCR-product voorafgaand aan gebruik als DNA-template voor in-vitro mRNA-transcriptie met behulp van een DNA-reinigingsset.

2. mRNA-generatie

1. Alle componenten van de in-vitro mRNA transcriptie Kit ontdooien (Zie de tabel met materialen). Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g. Blijf op ijs tot het gebruik.
2. Bereid de reactiemix voor in vitro mRNA-transcriptie in een micro centrifuge-buis van 0,5 mL in de volgende volgorde (totaal volume van 40 μL): 20 μL 10x ARCA/NTP-mix (opgenomen in de in vitro mRNA transcriptie Kit); 0,25 μL 5-methyl-CTP (eindconcentratie (FC) is 1,25 mM; 50% van de totale CTP); 0,25 μL pseudo-UTP (f.c. is 1,25 mM; 50% van de totale UTP); X μL DNA-template; 2 μL T7 RNA polymerase mix (opgenomen in de in vitro mRNA transcriptie Kit); Y μL RNAse-vrij H₂O.
   Opmerking: X is een volume dat ten minste 1 μg DNA bevat. Bijvoorbeeld 1,6 μL van een stamoplossing van 625 ng/μL. Y is het reservevolume van het totale volume van 40 μL.
3. Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g. Incuberen bij 37 °C gedurende 30 minuten bij 400 rpm op een thermische mixer voor in vitro transcriptie.
4. Voeg vervolgens 2 μL DNase I rechtstreeks toe aan de reactiemix voor het verwijderen van het template-DNA. Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g.
5. Incuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten bij 400 rpm op een thermische mixer. Neem een aliquot van 2 μL voor de control gel (stap 3,3) en bewaar bij-80 °C.
6. Voeg voor poly (A) de volgende componenten rechtstreeks toe aan de vorige reactiemix (tot een eindvolume van 50 μL): 5 μL van 10x poly (A) polymerase reactiebuffer en 5 μL poly (A) Polymerase (beide opgenomen in de in vitro mRNA transcriptie Kit). Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g.
7. Inincuberen de mix bij 37 °C gedurende 30 minuten bij 400 rpm op een thermomixer. Neem een aliquot van 2 μL voor de control gel (stap 3,3) en bewaar bij-80 °C.
8. Voeg voor defosforylering van de 5 ́-uiteinden van de mRNA de volgende componenten rechtstreeks toe aan de vorige reactiemix (tot een eindvolume van 60 μL): 3 μL RNAse-vrij H₂O; 6 μL van 10 x Antarctische fosfatase reactiebuffer; 3 μL Antarctische fosfatase (15 eenheden voor reactievolume van 60 μL). Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g.
9. Inincuberen de mix bij 37 °C gedurende 30 minuten bij 400 rpm op een thermische mixer.
10. Hitte-inactivatie Antarctische fosfatase door incubatie bij 80 °C gedurende 2 min.
    Opmerking: Gebruik in het ideale geval een aparte thermische mixer, wacht niet tot de eerste mixer de gewenste temperatuur bereikt.

3. zuivering van mRNA

1. Reinig de in vitro getranscribeerd mRNA met behulp van een speciale RNA zuiverings pakket (tabel van materialen).
   1. Voeg X μL elutie oplossing toe aan de mRNA-reactiemix vanaf stap 2,10. Meng door 5 keer inverteren. Voeg 300 μL binding oplossing concentraat toe. Meng door het zachtjes pipetteren 5 keer.
      Opmerking: X is het reservevolume tot een totaal volume van 100 μL. Voeg bijvoorbeeld 40 μL elutie oplossing toe aan 60 μL mRNA-reactiemix.
   2. Voeg 100 μL RNAase-vrije ethanol toe. Meng door het zachtjes pipetteren 5 keer.
   3. Plaats een filter kolom in een van de meegeleverde opvang buizen. Breng de mRNA-reactiemix voorzichtig over in het midden van het filter zonder het filter aan te raken. Centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT).
   4. Til de filter kolom voorzichtig op en gooi de doorstroom in de opvang buis weg. Plaats de filter kolom terug in dezelfde verzamelbuis.
   5. Voeg 500 μL wasoplossing toe (Vergeet niet om 20 mL RNAase-vrije ethanol toe te voegen voordat u de reinigingsoplossing voor de eerste keer gebruikt).
   6. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij RT. Herhaal stappen 3.1.4-3.1.6 om nog een keer te wassen.
   7. Centrifugeer op volle snelheid (17.900 x g) gedurende 1 minuut bij RT om eventuele restvloeistof uit de filter kolom te verwijderen. Neem de filter kolom voorzichtig uit het opvang buisje. Plaats de filter kolom in een nieuwe collectie Tube.
   8. Voeg 50 μL elutie buffer toe aan het midden van het filter zonder het filter aan te raken. Inincuberen bij 65 °C gedurende 10 minuten op een thermische mixer.
   9. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij RT. Verwijder de filter kolom en gooi deze weg.
2. Meet de concentratie en zuiverheid van de eluteerde mRNA, bijvoorbeeld door gebruik te maken van een microvolume spectrofotometer voor het meten van de extinctie bij 260 en 280 nm.
   Opmerking: Een A260/A280 ratio van 1,8-2,1 is indicatief voor zeer gezuiverde mRNA.
3. Controleer de aanwezigheid van één product, corrigeer de transcriptie lengte en poly (A) door de aliquots te analyseren uit de stappen 2,5 en 2,7 door agarose gel elektroforese onder denaturerende condities (gebruik bijvoorbeeld een 1,2% agarose gel met 20 mM 3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur [MOPS], 5 mM Natriumacetaat, 1 mM EDTA en 20% formaldehyde en lopen in 20 mM MOPS, 5 mM Natriumacetaat, 1 mM EDTA en 0,74% formaldehyde bij 100 V constante stroom).
4. Bewaar de gezuiverde mRNA in de elutie Tube bij-80 °c tot transfectie. Als het gebruik van slechts lage hoeveelheden van de mRNA voor Transfectie vervolgens aliquot de mRNA om herhaalde bevriezen-ontdooien cycli te voorkomen.
   Opmerking: mRNA kan ongeveer 1 jaar bij-80 °c worden bewaard.

4. macrofaag voorbereiding

1. Euthanize C57/BL6 muizen (gebruik muizen van hetzelfde geslacht en van 6-24 weken leeftijd) door cervicale dislocatie.
   Opmerking: Dezelfde muizen kunnen worden gebruikt voor isolatie van PM (stap 4,2) en het genereren van BMDM (stappen 4,3 en 4,4). Voor isolatie van PM gebruik ten minste twee muizen. Als alleen BMDM moet worden gegenereerd, is een muis meestal voldoende.
2. Immunomagnetische verrijking van peritoneale macrofagen.
   1. Vul een spuit van 10 mL met een 0,9 x 40 mm canule met 8 mL ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 2 mL lucht. Spoel de peritoneale holte met PBS. De lucht zal een bubbel vormen die lekkage van de PBS minimaliseert.
   2. Verzamel snel peritoneale spoeling met dezelfde spuit en breng over in een conische centrifugeren-buis van 50 ml. Combineer peritoneale cellen van meerdere muizen indien nodig. Houd de celsuspensie op ijs.
   3. Centrifuge celsuspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in 5 mL van 0,2% NaCl voor 30 s tot lyse rode bloedcellen.
   4. Voeg 5 mL 1,6% NaCl toe aan een totaal volume van 10 mL om isotone condities te reconstitueren. Centrifugeer bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
   5. Gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in 97,5 μL magnetische celsortering (MCS) buffer (2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur [EDTA], 5% boviene serumalbumine [BSA] in PBS) per 1 peritoneale spoeling (bijv. als drie muizen zijn gespoeld, hervat in 292,5 μL ).
   6. Voeg 2,5 μL paramagnetische parels toe die zijn geconjugeerd aan een CD11b-specifiek antilichaam per 97,5 μL celsuspensie (bijv. Voeg 7,5 μL toe aan 292,5 μL).
   7. Incuberen op ijs gedurende 15 minuten bij 150 rpm op een rondschudapparaat.
   8. Centrifuge celsuspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c, gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in 1 ml mcs-buffer.
   9. Voeg 4 mL MCS-buffer toe aan een totaal volume van 5 mL en was de cellen door drie keer zachtjes op en neer te pipetteren.
   10. Herhaal stap 4.2.8 en 4.2.9 nog twee keer voor een totaal van drie wasstappen.
   11. Plaats tijdens de wasstappen een LS-kolom in een scheidingsteken voor magnetische cellen (Zie tabel met materialen). Spoel de kolom af met 3 mL MCS-buffer.
       Opmerking: Vermijd eventuele bubbels omdat deze de kolom kunnen verstoppen.
   12. Respendeer de celpellet in 1 mL MCS-buffer. Voeg 3 mL MCS buffer toe aan een totaal volume van 4 mL, Meng door pipetteren drie keer omhoog en omlaag.
   13. Breng de 4 mL celsuspensie over naar de kolom gespoeld.
       Opmerking: Nogmaals, Vermijd eventuele bubbels omdat deze de kolom kunnen verstoppen.
   14. Wacht tot het reservoir van de kolom helemaal leeg is. Voeg geen extra vloeistof toe totdat de kolom stopt met druipen.
   15. Voeg 3 mL MCS-buffer toe aan de kolom. Wacht tot het reservoir van de kolom helemaal leeg is. Herhaal stap 4.2.15 nog twee keer.
   16. Plaats de LS-kolom in een conische Centrifugeer buis van 15 mL. Breng 5 mL MCS-buffer aan op de kolom. Wacht tot 2 mL vloeistof door de kolom is gegaan en gebruik vervolgens de zuiger om de overblijvende fractie voorzichtig in de buis te duwen.
   17. Centrifugeer celsuspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en gooi het supernatant weg.
   18. Respendeer de celpellet in 1 mL DMEM aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalf serum (FCS) (DMEM + FCS).
   19. Bepaal het aantal levensvatbare cellen door in een trypaanse blauwe oplossing in een Neubauer-telkamer en zaadcellen in DMEM + FCS in cultuur platen te tellen.
       Opmerking: Zaad PM bij een dichtheid van 100.000 cellen/goed in een vlakke bodemmicro titer plaat. Gebruik geen weefsel cultuurbehandelde platen als PM kan niet worden losgekoppeld van deze. Gebruik in plaats daarvan niet-behandelde platen.
3. Generatie van BMDM
   1. Verwijder de huid en spieren van de achterpoten met een schaar. Was elk been met een korte onderdompeling in 70% ethanol.
   2. Maak benen los en open beide uiteinden van het dijbeen en de Tibia door te snijden met een schaar.
   3. Vul een 5 mL spuit gevuld met een 0,6 mm x 30 mm canule met 5 mL zeer lage endotoxine (VLE) RPMI 1640 en spoel het beenmerg uit de geopende botten in een kweek schotel.
   4. Combineer het beenmerg van meerdere muizen indien nodig door de stappen 4.3.1-4.3.3 te herhalen. Breng het beenmerg over in een conische centrifugeren buis van 50 mL.
   5. Centrifugeer de beenmerg suspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en gooi het supernatant weg.
   6. Respendeer de celpellet in 5 mL rode bloedcel lysisbuffer (8,3% NH₄Cl, 0,1 M Tris) en inincuberen gedurende 5 minuten bij RT om de rode bloedcellen te lyseren.
   7. Centrifugeer de celsuspensie bij 650 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
   8. Respendeer de celpellet in 1 mL VLE RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FCS, 1% penicileen/streptomycine, 1% HEPES, 1% natrium pyruvaat en 10 ng/mL recombinant macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) (RPMI⁺+ + + +).
   9. Voeg 4 ml rpmi⁺ + + + + toe aan een totaal volume van 5 ml.
   10. Bereid 5 92 mm x 16 mm onbehandelde Petri schaaltjes met nokken (Zie de tabel met materialen) per muis Pipetteer 7 ml rpmi⁺ + + + + medium in elk schaaltje.
   11. Breng de 1 mL celoplossing over naar de 5 bereide kweek gerechten en inincuberen bij 37 °C en 5% CO₂.
   12. Voer de cellen na 4 dagen uit door 4 mL RPMI⁺+ + + + toe te voegen. Na 6-7 dagen zijn de beenmergcellen volledig gedifferentieerd in BMDM.
4. Oogsten van BMDM
   1. Verwijder het medium volledig uit cultuur gerechten. Voeg in PBS 5 mL warme 0,2 mM EDTA toe aan elk gerecht.
   2. Schrapen het hele bord voorzichtig met een celscraper om de BMDM los te maken. Combineer de celsuspensies in een 50 mL conische centrifugatie buis.
   3. Spoel alle 5 gerechten opnieuw uit. Gebruik hetzelfde volume van 5 mL warme 0,2 mM EDTA in PBS voor alle 5 gerechten. Combineer deze celsuspensie met die van de vorige stap.
   4. Centrifugeer de celsuspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en gooi het supernatant weg.
   5. Respendeer de celpellet in 1 ml VLE rpmi 1640 medium aangevuld met 10% FCS, 1% Hepes, 1% natrium pyruvaat en 10 ng/ml recombinant M-CSF maar geen antibiotica (rpmi⁺+ + +).
   6. Bepaal het aantal levensvatbare cellen door te tellen in trypaanse blauwe oplossing in een Neubauer telkamer en zaadcellen in RPMI^{+ +} + + in kweek platen.
      Opmerking: Zaad BMDM bij een dichtheid van 50.000 cellen/goed maximaal in een vlakke bodemmicro titer plaat. Gebruik geen weefselcultuur behandelde platen als BMDM kan nauwelijks worden losgekoppeld van deze. Gebruik in plaats daarvan niet-behandelde platen.

5. transfectie van macrofagen met mRNA

1. Bereken het vereiste volume van de mRNA-transfectie buffer.
   Opmerking: Het volume van de vereiste mRNA-transfectie-buffer is afhankelijk van de grootte: gebruik 200 μL voor Transfectie in een 6-well-plaat, 100 μL in een 12-well-plaat enzovoort. Voeg altijd een beetje reservevolume toe vanwege Pipetteer verlies (maar niet te veel, om overmatige verdunning van mRNA te voorkomen). Gebruik bijvoorbeeld 450 μL in plaats van 4 x 100 μL = 400 μL om in 4 putjes van een 12-Wells plaat te transfect.
2. Bereken het vereiste volume van het mRNA-transfectiereagens. Het mRNA transfectie-reagens wordt toegevoegd in een verhouding van 1:50. Zo is 9 μl mRNA transfectie-reagens vereist voor een eindvolume van 450 μL.
3. Bereken het totale bedrag van de vereiste mRNA. Ten minste 100 ng per 100.000 macrofagen zijn nodig voor een efficiënte trans fectie, 200 ng werkt nog beter (bijv. 800 ng mRNA naar transfect 400.000 macrofagen).
   1. Vermenigvuldig de berekende hoeveelheid mRNA die nodig is met het totale aantal putten dat moet worden omgerekend (bijvoorbeeld 4 putten met 400.000 macrofagen elk: 4 x 800 ng = 3.200 ng mRNA is in totaal vereist voor alle putten). Als uw mRNA-voorraad bijvoorbeeld 426,8 ng/μL is, zijn 7,49 μL nodig voor een optimale transfectie van 4 putten met 400.000 macrofagen per stuk.
4. Voeg het berekende volume van de mRNA transfectie-buffer toe (stap 5,1.) minus de volumes voor mRNA transfectie-reagens (stap 5,2) en de mRNA (stap 5,3) naar een reactie buis. Bijvoorbeeld 450 μL-9 μL-7,49 μL = 433,51 μL.
5. De mRNA-kolf ontdooien en mengen door de elutie buis voorzichtig te spiegelen. Voeg het berekende volume mRNA (stap 5,3) toe aan de reactie buis met mRNA-reactiebuffer (in het voorbeeld hierboven: 7,49 μL in 433,51 μL).
6. Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g.
7. Vortex de mRNA transfectie reagens voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s op 2.000 x g.
8. Voeg het berekende volume mRNA transfectie-reagens (stap 5,2) toe aan de reactie buis met de mRNA-transfectie buffer en de mRNA (in het bovenstaande voorbeeld: 9 μL mRNA-transfectiereagens).
9. Vortex de transfectie mix voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s op 2.000 x g.
10. Incuberen gedurende 15 minuten bij RT.
11. Vervang ondertussen het cultuurmedium van de macrofagen met een fris, warm kweekmedium (Zie stappen 4.2.18. en 4.4.5).
12. Na de incubatie stap 5,10 voegt u de transfectie-mix toe aan de putjes met de macrofagen in een volume dat geschikt is voor de grootte van de put (zie stap 5,1). Voeg de transfectie mix druppelsgewijs in een cirkel van de buitenkant naar het midden van de put.
13. Zachtjes de plaat, eerst in een verticale en vervolgens in een horizontale richting te zorgen voor een uniforme verdeling van de transfectie mix in de put. Inincuberen bij 37 °C en 5% CO₂. Synthese van het eiwit gecodeerd door de getransffecteerde mRNA zal kort na transfectie beginnen. Voor de beste resultaten, inincuberen gedurende ten minste 6 uur.
14. Analyseer na de incubatie de efficiëntie van de transfectie door (immuno) fluorescentiemicroscopie, Flowcytometrie of immunoblot¹⁶, of gebruik de getransfunde macrofagen voor het experiment naar keuze.

Resultaten

We hebben dit protocol met succes gebruikt om mRNA-codering te genereren voor door de vlag gelabelde NEMO-en IKKβ-varianten voor transfectie van primaire macrofagen¹⁶. De plasmiden codering voor Flag-Tagged wild-type (^{Nemo WT}) en C54/347a Mutant Nemo (Nemo^C54/374a) (Zie de tabel met materialen) bevatten al een T7 promotor in de juiste richting (Figuur 1a). Zo moesten we alleen de ...

Discussie

Hier presenteren we een protocol voor zeer efficiënte transfectie van meestal moeilijk te transfect primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA. Belangrijk is dat de transfectie van de macrofagen met behulp van dit protocol geen celdood induceert of proinflammatoire signalering activeert die aangeeft dat noch het transfectiereagens noch de getransfunteerde mRNA als niet-zelf worden herkend.

De kwaliteit van de mRNA is van cruciaal belang voor een succesvolle transfectie van macrofage...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5-methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	bewaard bij -20 °C
Antarctic phosphatase	New England BioLabs	M0289	bewaard bij -20 °C
Antarctic phosphatase reactie buffer (10x)	New England BioLabs	B0289	bewaard bij -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antilichaam	Invitrogen	MA1-41046	bewaard bij -20 °C
anti-β-actine antilichaam	Sigma-Aldrich	A2228	bewaard bij -20 °C
Petrischalen 92,16 mm met kams	Sarstedt	821.473	bewaard bij RT
CD11b Microbeads muis en mens	Miltenyi Biotec	130-049-601	bewaard bij 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor voorwaartse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, bewaard bij -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor achterwaartse primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, bewaard bij -20 °C
DNA zuiveringskit: QIAquick PCR zuiveringskit	Qiagen	28104	bewaard bij RT
eGFP + T7-Promotor voorwaartse primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, bewaard bij -20 °C
eGFP + T7-Promotor achterwaartse primer	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, bewaard bij -20 °C
Fast Digest buffer (10x)	Thermo Scientific	B64	bewaard bij -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	bewaard bij -20 °C
High-fidelity polymerase met proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	bewaard bij -20 °C
IKKβ + T7-Promotor voorwaartse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, bewaard bij -20 °C
IKKβ + T7-Promotor achterwaartse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, bewaard bij -20 °C
In vitro mRNA transcriptiekit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (met polyA-staart)	New England BioLabs	E2060	bewaard bij -20 °C
LS Kolommen	Miltenyi Biotec	130-042-401	bewaard bij RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	bewaard bij RT
mRNA transfectiebuffer en reagens: jetMESSENGER	Polyplus transfectie	409-0001DE	bewaard bij 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmide	Addgene	11105	bewaard bij -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmide	Addgene	27268	bewaard bij -20 °C
pEGFP-N3 plasmide	Addgene	62043	bewaard bij -20 °C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	bewaard bij -20 °C
pPGK-Cre plasmide			F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). bewaard bij -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	bewaard bij -20 °C
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	bewaard bij RT
Rat-anti-muis CD11b antilichaam, APC-geconjugeerd	BioLegend	101212	bewaard bij 4 °C
Rat-anti-muis F4/80 antilichaam, PE-geconjugeerd	eBioscience	12-4801-82	bewaard bij 4 °C
Recombinant M-CSF	Peprotech	315-02	bewaard bij -20 °C
RNA zuiveringskit: MEGAclear transcriptie opruimingskit	ThermoFisher Scientific	AM1908	bewaard bij 4 °C
RNAse-degraderende oppervlakte-actieve stof: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	bewaard bij RT
Ultrapure LPS van E.coli O111:B4	Invivogen		bewaard bij -20 °C
Wild type IKKβ plasmide	Addgene	11103	bewaard bij -20 °C
Wild type NEMO plasmide	Addgene	27268	bewaard bij -20 °C