Hier gepresenteerd is een protocol voor het gebruik van alginaat als een polymeer in micro-inkapseling van vereeuwigde cellen voor langdurige levering van biologische producten aan knaagdierogen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ingekapselde celtechnologie voor de levering van biologics aan het muisoog
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel huidige therapieën in ontwikkeling voor ziekten van de achterste oogstok zijn biologische. Deze geneesmiddelen moeten vaak worden toegediend, meestal via intravitreale injecties. Ingekapselde cellen die de biologische van keuze uitdrukken, worden een hulpmiddel voor lokale eiwitproductie en -afgifte (bijvoorbeeld via langdurige toediening van geneesmiddelen). Bovendien, inkapseling systemen maken gebruik van doorlatende materialen die verspreiding van voedingsstoffen, afval, en therapeutische factoren in en uit cellen mogelijk te maken. Dit gebeurt tijdens het maskeren van de cellen van de gastheer immuunrespons, het vermijden van de noodzaak voor onderdrukking van het gastheer immuunsysteem. Dit protocol beschrijft het gebruik van alginaat als een polymeer in micro-encapsulation in combinatie met de elektrospray methode als een micro-encapsulation techniek. ARPE-19 cellen, een spontaan ontstaanmenselijke RPE cellijn, is gebruikt in langdurige celtherapie experimenten vanwege de levensduur functionaliteit, en het wordt hier gebruikt voor inkapseling en levering van de capsules aan muisogen. Het manuscript vat de stappen voor celmicroencapulatie, kwaliteitscontrole en oculaire levering samen.
Inleiding
Celgebaseerde therapieën vertegenwoordigen revolutionaire biologische technieken die op grote schaal zijn toegepast in de geneeskunde. Onlangs zijn ze met succes toegepast bij de behandeling van neurodegeneratieve ziekten, oogziekten en kanker. Celtherapieën bestrijken een breed scala aan gebieden, van celvervanging tot toediening van geneesmiddelen, en dit protocol richt zich op de laatste. Biologisch afbreekbare alginaat microcapsules (MC) hebben aangetoond effectiviteit als een leveringssysteem, en ze worden steeds veel gebruikt in de biomedische veld. Alginaat is gebruikt in micro-encapsulation als gevolg van zijn eenvoudige geleerproces, biologische afbreekbaarheid, uitstekende biocompatibiliteit, en stabiliteit onder in vivo omstandigheden1,2,3,4.
De elektrospraymethode, als micro-encapsulation-techniek, is met succes gebruikt om peptiden en eiwitten in te kapselen met behulp van alginaat (basispolymeer) en poly-l-ornithine (secundair coatingpolymeer). Beide polymeren worden van nature gevonden en gebruikt voor hun biocompatibiliteit5,6,7. Echter, de belangrijkste uitdaging in cel-gebaseerde therapieën is onderdrukking van de gastheer immuunsysteem om bijwerkingen veroorzaakt door immunosuppressieve geneesmiddelen te voorkomen. De doorlaatbaarheid van alginaat microcapsules wordt beschouwd als een geschikte eigenschap voor celinkapseling, die verspreiding van voedingsstoffen, afval en therapeutische factoren in en uit cellen mogelijk maakt terwijl ze worden gemaskerd vanaf de gastheer immuunrespons8,9,10.
In het oog zijn ingekapselde cellen gebruikt in klinische studies voor de constante levering van biologische producten (d.w.z. groeifactoren11,,12 en groeifactor antagonisten13)voor de behandeling van retinitis pigmentosa of leeftijdsgebonden maculadegeneratie. Andere doelen, zoals complementremmers14, worden momenteel ook onderzocht in preklinische omgevingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARVO Verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en Vision Research en werden goedgekeurd door de Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee onder protocol ID 00399.
1. Celcultuur
- Genereren menselijke retinale pigment epitheelcellen (ARPE-19) cellijn stabiel uitdrukken van het gen van keuze volgens gepubliceerde protocollen14,15.
- Cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) onderhouden, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
- De cellen uitbroeden bij 37 °C en 5% CO2.
- Vervang het medium elke 2-3 dagen.
- Passage de cellen na het bereiken van 70%-80% samenvloeiing met behulp van standaard weefselkweek procedures.
2. Celinkapseling
- Meng natriumalginaat met gedeïoniseerd (DI) water voor een eindconcentratie van 2% w/v en zuiver door filtratie met een 0,2 μm steriel spuitfilter.
- Bereid de cellen voor om te worden gemengd met de alginaatoplossing door te trypsiniseren, centrifugeren en wassen met 10 mM HEPES gebufferde zoutoplossing (pH = 7,4). Met behulp van een hemocytometer, tellen de cellen en de laatste celconcentratie aan te passen tot 1 x 106 in alginaat oplossing.
LET OP: Het inkapselingsproces moet worden uitgevoerd in een gesteriliseerde kap. - Laad ~ 300 μL aliquots van alginaat en cellen mengsel in een 3 mL spuit en bevestig het aan een spuit pomp. De oplossing wordt door een stompe puntnaald van 30 G gepompt naar een steriel gelelingbad dat in een steriele beker van 50 mL onder de spuitpunt op 7 mm wordt geplaatst voor een naald tot badspuitafstand.
- Het gelelingbad bevat een volume van 40 mL van 10 mM HEPES gebufferde zoutoplossing met 100 mM calciumchloride (CaCl2) en 0,5% w/v poly-L-ornithine (PLO). De PLO is een secundaire polymeercoating die kan worden weggelaten of vervangen volgens de behoeften van de onderzoeker.
- Pas de spanning en destroomsnelheid aan en houd ze zowel constant tijdens het inkapselingsproces bij 60 mm/h debiet en 6,0 kV initiële spanning om microcapsules grootte van ~ 150 μm te produceren.
- Sluit de clip van anodedraad (rood) van een hoogspanningsgeneratornaaldpunt aan op de naald en sluit de grondclip (zwart) aan op de koperdraad die halverwege in het geleingbad is ondergedompeld. Een batch van het alginaat + celmengsel (1 mL) duurt ongeveer 30 min om de ingekapselde cellen (ongeveer 25.000 microcapsules) voor te bereiden.
- Was de gevormde microcapsules met cellen met wasoplossing (10 mM HEPES gebufferde zoutoplossing met 1,5 mM CaCl2, pH = 7,4) tweemaal. Gebruik PBS niet om te wassen.
- Incubeer de ingekapselde cellen met 10% FBS aangevulde DMEM-media in een bevochtigde couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
LET OP: Inkapselingsprocesinstrumenten zijn afgebeeld in figuur 1.
3. Bevestiging dat inkapseling geen invloed heeft op de levensvatbaarheid van de cel
- Na het uitbroeden van de ingekapselde cellen gedurende 24 uur in de media, bereidt u een klein monster van 500 μL (~ 30 microcapsules) voor op kleuring.
- Was de microcapsules 2x met behulp van wasoplossing (10 mM HEPES gebufferde zoutoplossing met 1,5 mM CaCl2)en bevlek ze voor levende dode levensvatbaarheid met behulp van een levende / dode test kit.
- Bereid een kleuringsmengsel van calcein AM (acetoxymethyl) en ethidium homodimer-1 voor bij eindconcentraties van respectievelijk 2 μM en 4 μM.
- Voeg 2 mL van het kleurmengsel toe aan de ingekapselde cellen en incubeer gedurende 30-45 min in het donker bij kamertemperatuur (RT).
- Met zorgvuldige aspiratie, aangezogen de kleuring oplossing en was de microcapsules 2x met de wasoplossing. Gebruik een fluorescerend microscoopsysteem om de ingekapselde cellen te observeren en in beeld te brengen.
LET OP: Documentatie van inkapseling is afgebeeld in figuur 2.
4. Bevestiging dat capsules de juiste grootte zijn voor de levering en levering van de biologische
- Intravitreale injecties in een muisoog worden meestal uitgevoerd met een 27 G stompe puntnaald (binnendiameter van 210 μm) bevestigd aan een 2,5 μL Hamilton spuit.
- Genereer capsules variërend van 100 tot 200 μm, verdun ze in serumvrije media en trek ze voorzichtig omhoog in de Hamilton-spuit. PBS is geen geschikt voertuig, omdat alginaatcapsules in PBS zullen oplossen.
- Langzaam 1 μL druppels met capsules op een microscoopdia uitwerpen en hun integriteit bepalen met behulp van een rechtopstaande heldere veldmicroscoop.
- Pas de capsulegrootte aan (zie stap 2.3) door de spanning en debiet dienovereenkomstig aan te passen. Kleinere microcapsules worden op niet-lineaire wijze geproduceerd door de spanning te verhogen en de stroomsnelheid licht te verlagen8. In onze handen bleken capsules met een diameter van 150 μm het meest geschikt. Aanpassing van de capsule grootte is ook afhankelijk van het houden van de alginaat concentratie constant, terwijl het veranderen van de andere parameters.
- Onderhoud een aparte set cellen in capsules van de juiste grootte in serumvrij medium om de hoeveelheid afscheiding van de gewenste biologische te bepalen. Gebruik gevoelige ELISA's of westelijke blotting om de concentratie van de biologische in de supernatant te bepalen.
- Bepaal de vereiste hoeveelheid capsules die geïnjecteerd moeten worden op basis van de bekende PK/PD (farmacokinetiek/farmacodynamica) van de therapeutische. In onze handen bleken 10 capsules per muisoog het meest effectief te zijn.
5. Capsule levering in muis glasachtig
- Voer intravitreale injecties uit met behulp van een ontledende microscoop. Zie figuur 3 voor chirurgische opstelling en materialen die tijdens de procedure worden gebruikt. Een gedetailleerd protocol voor intravitreous injecties kan elders worden gevonden16.
- Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van xylazine en ketamine (20 mg/kg en 80 mg/kg) of andere voorkeursverdovingsmiddelen die door het Comité voor dierverzorging en gebruik van de specifieke instelling zijn goedgekeurd. Zorg voor de juiste diepte van anesthesie met behulp van een teen pinch17.
- Verwijd de muispupillen met fenylephrine HCL (2,5%) en atropinesulfaat (1%) om een goede zichtbaarheid van de glaskamer mogelijk te maken en een smeerogengel op de ogen aan te brengen om ze gehydrateerd te houden tijdens de procedure.
- Prik de sclera bij de limbus met een 26 G naald als het geleidingsgat, zorg ervoor dat 1) de naald in een hoek van 45° staat met het oog en de tafel en 2) de afgeschuinde punt naar boven wordt gericht om te voorkomen dat de lens wordt doorboort.
- Injecteer de capsules voorzichtig met behulp van een naald met 27 G stompe punt die onder visuele inspectie aan een Hamilton-spuit is bevestigd onder een hoek van 45°, zodat u de lens niet met de naald aanraakt. Letsel van de lens zal leiden tot cataractvorming. De capsules moeten zichtbaar zijn in het glasvocht met behulp van de ontledende microscoop (figuur 4A).
- Na het intrekken van de naald, behandel de injectieplaats met antibioticazalven neomycine en polymyxine B-sulfaten naast dedexamethason oogheelkundige antibioticazalf.
- Breng goniotaire hypromellose demulcent oogheelkundige oplossing (2,5%) ogen om te voorkomen dat de hoornvliezen uitdrogen tijdens de herstelperiode.
- Plaats de muis op een verwarmingskussen op 37°C en controleer tot hij volledig wakker is.
- Een succesvolle injectie van ingekapselde ARPE-19 cellen moet de aanwezigheid van intacte capsules in de glasachtige kamer van de muis onthullen met slechts kleine hoeveelheden puin bij beeldvorming van het oog door optische coherentie tomografie of andere methoden (Figuur 4B).
- Het geïnjecteerde muisoog, na een paar dagen van herstel als gevolg van de operatie, is nu klaar voor het experimentele paradigma bij de hand.
LET OP: De chirurgische opstelling en documentatie van capsules in het oog zijn afgebeeld in respectievelijk figuur 3 en figuur 4.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
ARPE-19 cellen zijn een spontaan vereeuwigde menselijke RPE-cellijn waarvan is aangetoond dat het vatbaar is voor inkapseling en overleving op lange termijn bij implantatie van capsules in het oog. De instrumenten voor alginaat inkapseling worden weergegeven in figuur 1. In deze studie werd aangetoond dat bij inkapseling in alginaat, de cellen in alginaat capsules werden bevestigd door heldere-veld beeldvorming (Figuur 2A). Levende dode testen werden uitgevoerd ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze celinkapselingtechniek is relatief snel en eenvoudig uit te voeren; er moeten echter bepaalde punten in gedachten worden gehouden om nauwkeurige downstreamresultaten te verkrijgen. Cellen moeten worden gehandhaafd in de cultuur in een petrischaaltje voorafgaand aan inkapseling en gehouden op de juiste samenvloeiing. Inkapseling moet worden uitgevoerd in een goede ventilatiekap met gereguleerde luchtstroom, indien mogelijk. Te sterk van een luchtstroom kan de vorming van capsule beïnvloeden, vooral in langetermijnexp...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies toegekend aan B. R. door de National Institutes of Health (R01EY019320), het Department of Veterans Affairs (RX000444 en BX003050), en de South Carolina SmartState Endowment.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3 mL Spuit | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Boten naald | SAI Infusion technologie | B30-100 | |
| Alginezuur natriumzout, van bruin zeewier | Sigma | A0682 | |
| Atropinesulfaat Ophthalmologische oplossing (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | voor pupilverwijding |
| BD 1 mL Spuit 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | om het geleidingsgat te maken |
| Calciumchloride, Watervrij, korrelig | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | om de ogen te smeren tijdens anesthesie |
| Goniotaire: Hypromellose (2,5%) Ophthalmologische Demulcent Oplossing (Steriel) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | om de ogen te smeren tijdens anesthesie |
| Hamilton Naald/spuittuit: 27 G, Kleine Hub RN NDL, aangepaste lengte (12 mm), puntstijl 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | voor intravitreale toediening van capsules |
| Hamilton Spuit: 2,5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Apart verkrijgbaar | Hamilton | 7632-01 | voor intravitreale toediening van capsules |
| HEPES buffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| Hoogspanningsgenerator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viabiliteit/Cytotoxiciteit Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycine en Polymyxine B sulfaten en Dexamethason Ophthalmologische Zalf | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibioticum om infectie na intravitreale injectie te voorkomen |
| Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmologische Oplossing (2,5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | voor pupilverwijding |
| Natriumchloride | Sigma | S-5886 | |
| Steriele spuitfilters, 0,2 μm | VWR | 28143-312 | |
| Spuitpomp | GRASEBY | MS16A |
Referenties
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
- Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
- Vilos, C., Velasquez, L. A. Therapeutic strategies based on polymeric microparticles. Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).
- Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. Natural polymers for the microencapsulation of cells. Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817(2014).
- Gasper, D. P. R. Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele. , (2012).
- Huang, S., Fu, X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).
- Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).
- Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release. Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).
- Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size. Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).
- Gryshkov, O., et al. Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells. Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).
- Thanos, C. G., et al. Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device. Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).
- Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).
- Kauper, K., et al. Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455(2012).
- Annamalai, B., et al. Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model. Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3(2018).
- Alge, C. S., et al. Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. Journal of Visualized Experiments. (8), 313(2007).
- Jove Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Holz, F. G., et al. Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).
- Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders. Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).
- Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration. PLoS ONE. 6 (4), e19078(2011).
- Vincent, L., et al. Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290(2013).
- Zhang, K., et al. Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).
- Chew, E. Y., et al. Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial. American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).
- Birch, D. G., et al. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
