Methodenartikel

Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

DOI:

10.3791/60170

⸱

11 november 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 3Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Surgery, University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes te isoleren die immuunstimulerende granulocyten macrofaagkolonie-stimulerende factoren dragen uit embryonale stamcellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embryonale stamcellen (SER's) zijn pluripotente stamcellen die in staat zijn tot zelfvernieuwing en differentiatie in alle soorten embryonale cellen. Net als veel andere celtypen geven SER's kleine membraanblaasjes, zoals exosomen, af aan de extracellulaire omgeving. Exosomen dienen als essentiële bemiddelaars van intercellulaire communicatie en spelen een basisrol in veel (patho)fysiologische processen. Granulocyte-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) functioneert als een cytokine om de immuunrespons te moduleren. De aanwezigheid van GM-CSF in exosomen heeft het potentieel om hun immuunregulerende functie te stimuleren. Hier werd GM-CSF stabiel overexpressie in de muriene ESC-cellijn ES-D3. Er werd een protocol ontwikkeld om hoogwaardige exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes (EV's) te isoleren uit ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie geven. Geïsoleerde exosoom-verrijkte EV's werden gekenmerkt door een verscheidenheid aan experimentele benaderingen. Belangrijk is dat aanzienlijke hoeveelheden GM-CSF aanwezig bleken te zijn in exosoom-verrijkte EV's. Over het algemeen kunnen GM-CSF-dragende exosoom-verrijkte EV's van SER's functioneren als celvrije blaasjes om hun immuunregulerende activiteiten uit te oefenen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SER's zijn afgeleid van het blastocyststadium van een pre-implantatie-embryo1. Als pluripotente stamcellen hebben SER's het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in elk type embryonale cel. Vanwege hun opmerkelijke ontwikkelingspotentieel en proliferatieve capaciteit op lange termijn zijn SER's uiterst waardevol voor biomedisch onderzoek1. De huidige onderzoeksinspanningen hebben zich grotendeels gericht op het therapeutisch potentieel van SER's voor een verscheidenheid aan belangrijke pathologische aandoeningen, waaronder diabetes, hartaandoeningen en neurodegeneratieve ziekten2,3,4.

Van zoogdiercellen, waaronder SER's, is bekend dat ze blaasjes met variabele grootte afgeven aan de extracellulaire omgeving, en deze EV's bezitten veel fysiologische en pathologische functies vanwege hun rol in intercellulaire communicatie5. Onder verschillende subtypen van EV's zijn exosomen kleine membraanblaasjes die vrijkomen uit verschillende celtypen in de extracellulaire ruimte bij fusie van intermediaire endocytische compartimenten, multivesiculaire lichamen (MWB's), met het plasmamembraan6. Van exosomen is gemeld dat ze intercellulaire communicatie bemiddelen en zijn kritisch betrokken bij veel (patho)fysiologische processen7,8. Exosomen erven sommige biologische functies van hun eigen ouderlijke cellen, omdat exosomen biologische materialen bevatten die uit het cytosol zijn verkregen, waaronder eiwitten en nucleïnezuren. De geassocieerde antigenen of factoren die de immuunrespons specifiek voor een bepaalde ziekte stimuleren, zijn dus ingekapseld in de exosomen van bepaalde soorten cellen9. Dit maakte de weg vrij voor klinische onderzoeken naar tumor-afgeleide exosomen als een anti-kankervaccin10.

GM-CSF is een cytokine uitgescheiden door verschillende soorten immuuncellen11. Opkomend bewijs toont aan dat GM-CSF het immuunsysteem activeert en reguleert en een essentiële rol speelt in het antigeen-presenterende proces12. Een klinisch rapport suggereert bijvoorbeeld dat GM-CSF de immuunrespons op tumoren stimuleert als een vaccinadjuvans13. Verschillende gm-csf-gebaseerde kanker immunotherapie strategieën om de krachtige immuunstimulerende activiteit van GM-CSF te benutten zijn onderzocht in klinische onderzoeken14. Onder deze, een kankervaccin samengesteld uit bestraalde GM-CSF-afscheidende tumorcellen heeft enige belofte getoond bij gevorderde melanoompatiënten door cellulaire en humorale antitumorreacties en daaropvolgende necrose in uitgezaaide tumoren te induceren15.

Omdat de exosomen afgeleid van SER's vergelijkbare biologische activiteiten hebben als de oorspronkelijke SER's, kunnen GM-CSF-dragende exosomen van SER's misschien functioneren als celvrije blaasjes om de immuunrespons te reguleren. In dit artikel wordt een gedetailleerde methode beschreven om hoogwaardige exosoom-verrijkte EV's te produceren van SER's die GM-CSF tot expressie geven. Deze exosoom-verrijkte EV's hebben het potentieel om te dienen als immuunregulerende blaasjes om de immuunrespons te moduleren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ES-D3 cellen kweken

  1. Om exosoomvrij foetaal runderserum (FBS) te genereren, laadt u FBS in een ultracentrifuge en centrifugeer u gedurende 16 uur bij 4 °C bij 100.000 x g. Verzamel na centrifugeren serumsupernatant als exosoomvrije FBS voor het kweken van de muriene ESC-cellijn ES-D3 en het verwerven van exosoomverrijkte EV's.
  2. Voordat u de ES-D3-cellen plateert, bedekt u de 15 cm weefselkweekschalen met gelatine (0,1%) op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  3. Volgens een eerder beschreven protocol16, kweek de ES-D3 cellen zonder feederlaagcellen in de met gelatine beklede 15 cm weefselkweekschalen. Het ES-D3 celkweekmedium bestaat uit DMEM, exosoomvrije FBS (15%), niet-essentiële aminozuren (0,1 mM), L-glutamine (2 mM), β-mercaptoethanol (0,1 mM), penicilline (50 eenheden / ml), streptomycine (50 μg / ml) en leukemie remmende factor (LIF; 100 eenheden / ml). Kweek ES-D3 cellen bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
  4. Zodra de ES-D3-cellen ongeveer 90% samenvloeiing bereiken in 15 cm weefselkweekschalen, verwijdert u het medium door aspiratie. Was de cellen met trypsine (5 ml; 0,05%). Voeg trypsine (5 ml) toe aan de gerechten en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Verzamel de cellen uit de gerechten.
  5. Voeg vers kweekmedium (5 ml) toe aan de verzamelde cellen om de trypsine te inactiveren. Centrifugeer de cellen bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen in vers medium en bepaal het celnummer met behulp van een hemocytometer.
  6. Voor passaging cellen, plaat de ES-D3 cellen (5 x 106) in een gelatine-gecoate (0,1%) 15 cm weefselkweek schaal met vers medium (15 ml) en kweek gedurende 3 dagen voordat subculturatie van de cellen.
  7. Om het celkweeksupernatant te verzamelen voor isolatie van exosoomverrijkte EV's, verguld de ES-D3-cellen (1 x10 7) in een met gelatine bedekte (0,1%) 15 cm weefselkweekschaal met vers medium (15 ml) gedurende 3 dagen voorafgaand aan het verzamelen van celkweeksupernatant.

2. Generatie van GM-CSF expressie plasmide

OPMERKING: Genereer het transfectieplasmide pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP om GM-CSF in ES-D3-cellen te overexpresseren. In dit plasmide wordt de expressie van murine GM-CSF cDNA samen met het markereiwit gemensualiseerd Renilla reniformis GFP (hrGFP) aangedreven door de humane polypeptideketen rekfactor 1α (EF1α) promotor17,18.

  1. Genereer de vectorbackbone.
    1. Verteer het plasmide pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg DNA) met behulp van het restrictieszym EcoRI (100 eenheden) bij 37 °C gedurende 2 uur om twee DNA-fragmenten te genereren: de vectorbackbone (6,0 kb) en FD3ER-insert (2,5 kb).
    2. Breng 50% van het verteerde plasmide-DNA (10 μg) over in één microcentrifugebuis van 1,5 ml en behandel met alkalische fosfatase (20 eenheden) bij 37 °C gedurende 1 uur. Los zowel onbehandeld als gedefosforyleerd DNA op met behulp van agarosegel-elektroforese (2%).
    3. Zuiver de vector backbone DNA-fragmenten (6,0 kb) met behulp van een DNA-gelextractiekit. Terwijl de onbehandelde vectorbackbone zal dienen als de lege vector (pEF1α-IRES-hrGFP), zal de gedefosforyleerde vectorbackbone worden gebruikt om GM-CSF-expresserend plasmide (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP) te genereren.
  2. Genereer de GM-CSF cDNA-insert.
    1. Verteer het plasmide pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) met behulp van het restrictie-enzym EcoRI (100 eenheden) bij 37 °C gedurende 2 uur om twee DNA-fragmenten te produceren: de vectorbackbone (6,5 kb) en de murine GM-CSF cDNA-insert (474 bp).
    2. Los het verteerde DNA op via agarosegel-elektroforese (2%). Zuiver het murine GM-CSF cDNA-fragment (474 bp) met behulp van een DNA-gelextractiekit.
  3. Genereer de expressie plasmiden.
    1. Stel 2 ligatiereacties in (10 μL totaal volume) met behulp van een DNA-ligatiekit.
      1. Om de lege vector pEF1α-IRES-hrGFP te genereren, ligaat u de onbehandelde vectorbackbone uit stap 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).
      2. Om pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP te genereren, ligaat u de volgende DNA-fragmenten: (1) de gedefosforyleerde vectorbackbone uit stap 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) en (2) het mGM-CSF cDNA-fragment gegenereerd in stap 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
    2. Ligate bij 25 °C gedurende 5 min. Transformeer geligeerd DNA in DH5α competente E. coli cellen. Plaat de getransformeerde E. coli-cellen op LB-agarplaten die carbenicilline (50 μg/ ml) bevatten.
    3. Zuiver plasmiden uit enkele E. coli-kolonies met behulp van een DNA-isolatiekit. Valideer de identiteit van de plasmiden door DNA-sequencing.

3. Generatie van ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie

OPMERKING: Transfecteer de ES-D3-cellen met het plasmide pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP om GM-CS te overexpressie. Cotransfecteer het plasmide pBabe-Neo in ES-D3-cellen om de selectie van stabiel getransfecteerde cellente vergemakkelijken 18,20.

  1. Transfecteer de plasmiden in de ES-D3-cellen.
    1. Verdeel de ES-D3-cellen (1,4 x 106) in een met gelatine beklede (0,1%) 10 cm weefselkweekschaal met kweekmedium (10 ml) voor transfectie. Gekweekte ES-D3-cellen bij 37 °C gedurende 24 uur.
    2. Bereid twee plasmidemengsels in microcentrifugebuizen van 1,5 ml: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vectorcontrole) met pBabe-Neo (4 μg) en (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, gm-csf) met pBabe-Neo (4 μg). Voer transfectie uit met behulp van een transfectiekit volgens het protocol van de fabrikant.
    3. Voeg transfectiemedium (1 ml) en transfectiereagens (64 μL) toe aan elke buis die de plasmidemengsels bevat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    4. Voeg de transfectiemengsels toe aan de respectievelijke 10 cm schalen van ES-D3-cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 uur.
    5. Vervang het medium in schalen van 10 cm door vers kweekmedium (10 ml). Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur.
  2. Genereer bulkpopulaties van stabiel getransfecteerde ES-D3-cellen.
    1. Verwijder het medium uit getransfecteerde ES-D3-cellen. Was de cellen met trypsine (2 ml; 0,05%). Voeg trypsine (2 ml) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Breng de cellen over in een centrifugebuis van 15 ml en voeg 2 ml vers kweekmedium toe om trypsine te neutraliseren. Centrifugeer bij 390 x g gedurende 5 min.
    2. Resuspend de getransfecteerde cellen in vers kweekmedium (10 ml). Evalueer de fluorescentie-intensiteit van GFP in getransfecteerde ES-D3-cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), volgens het protocol van de fabrikant.
    3. Breng de getransfecteerde cellen over in twee schalen van 10 cm met vers kweekmedium (10 ml). Voeg neomycine (0,5 mg / ml) toe om niet-getransfecteerde cellen te elimineren.
    4. Ga door met het kweken van de getransfecteerde cellen in kweekmedium dat neomycine bevat (0,5 mg / ml). Wanneer de getransfecteerde ES-D3 90% confluentie bereikt, breng de cellen opnieuw over naar 15 cm weefselkweekschalen. Herhaal de procedure gedurende 2 weken.
  3. Genereer klonen van stabiel getransfecteerde ES-D3-cellen.
    1. Zodra bulkpopulaties van stabiel getransfecteerde ES-D3-cellen zijn gegenereerd, verzamelt u de cellen zoals voorheen. Bepaal de celaantallen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen (1 x 107 cellen/ml) in vers kweekmedium.
    2. Filter de cellen door een steriele celzeef van 40 μm. Zuiver GFP-positieve ES-D3-cellen met behulp van FACS, volgens het protocol van de fabrikant.
    3. Plaats een enkele gesorteerde ES-D3-cel in één put van een met gelatine bedekt (0,1%) 96-put weefselkweekplaat met ouderlijke ES-D3-cellen (1 x 103) in neomycinevrij medium (200 μL). Co-culturing van getransfecteerde ES-D3-cellen met hun niet-getransfecteerde ouderlijke tegenhangers zorgt ervoor dat stabiel getransfecteerde enkele ES-D3-cellen overleven en prolifereren als een enkele kloon.
    4. Kweek de cellen gedurende 48 uur en voeg vervolgens neomycine (0,5 mg / ml) toe aan 96-well platen om niet-getransfecteerde ouderlijke ES-D3-cellen te elimineren.
    5. Ga door met het kweken van de GFP-positieve ES-D3-cellen in 96-well weefselkweekplaten met medium dat neomycine (0,5 mg / ml) bevat gedurende 1 week. Breng klonale ES-D3-cellijnen over naar gelatine-gecoate (0,1%) 6 cm weefselkweekschalen met kweekmedium (5 ml) die neomycine (0,5 mg / ml) bevatten gedurende 1 week.
    6. Bepaal de intensiteit van GFP-fluorescentie in elk van de getransfecteerde ES-D3-celklonen met behulp van FACS, volgens het protocol van de fabrikant. Selecteer de ES-D3-klonen die GM-CSF of de lege vector met hoge niveaus van groene fluorescentie tot expressie brengen.
    7. Bepaal de hoeveelheden GM-CSF die door ES-D3-cellen worden uitgescheiden met behulp van een murine GM-CSF ELISA-kit, volgens het protocol van de fabrikant.

4. Isolatie van exosoomverrijkte extracellulaire blaasjes

  1. Kweek de ES-D3 cellen (1 x 107) in 15 cm weefselkweekschalen gedurende 72 h bij 37 °C. Verzamel het celkweeksupernatant. Bewaar verzameld supernatant bij 4 °C tot 1 week om de exosomale integriteit te behouden.
  2. Centrifugeer het celcultuursupernatant bij 5.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C met behulp van een centrifuge om grote celfragmenten te bezinken.
  3. Verzamel het supernatant en centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 90 minuten bij 4 °C met behulp van een ultracentrifuge.
  4. Verwijder het supernatant. Spoel elke pellet voorzichtig twee keer af met fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS; 1 ml) om restkweeksupernatant te verwijderen.
  5. Resuspend elke pellet in PBS. Kwantificeer exosoomverrijkte EV's aan de maat van hun eiwitgehalte5.
    1. Meet de eiwitconcentratie van exosoomverrijkte EV's met een bicinchoninezuur (BCA) -test. De verwachte opbrengst van exosoom-verrijkte EV's uit ES-D3-cellen is ongeveer 4 μg eiwit / ml celkweeksupernatant. Resuspend de exosoom-verrijkte EV's in PBS (eiwitconcentratie: ~6 μg/μL). Bewaar de exosoomverrijkte EV's bij -80 °C.

5. Karakterisering van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes door transmissie-elektronenmicroscopie

OPMERKING: Onderzoek de samenstelling en de structuur van de exosoom-verrijkte EV's geïsoleerd uit SER's met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)5.

  1. Fixeer de exosoomverrijkte EV's (3-5 μg/μL) met een eindconcentratie van 2% EM-kwaliteit paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  2. Laad vaste monsters (10 μL) op koperen roosters met koolstofondersteuningsfolie. Incubeer de monsters met koperen roosters gedurende 1 minuut en giet de roosters vervolgens af met filterpapier.
  3. Bevlek de roosters met een kleuringsoplossing volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Breng de roosters met een pincet over op een stuk filterpapier. Laat de roosters een nacht drogen bij kamertemperatuur.
  5. Verkrijg elektronenmicroscopiebeelden met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (50.000x vergroting), volgens het protocol van de fabrikant.

6. Evaluatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes door western blot analyse

  1. Bereid hele celextracten voor.
    1. Verwijder het medium uit ES-D3-cellen die in schalen van 15 cm zijn gekweekt. Was de cellen met trypsine (5 ml; 0,05%). Voeg trypsine (5 ml) toe aan de cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Verzamel de cellen en voeg vers kweekmedium (5 ml) toe om trypsine te neutraliseren. Centrifugeer de cellen bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen in PBS.
    2. Bepaal celaantallen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen in SDS-PAGE laadbuffer met 0,5% SDS (5.000 cellen/μL).
    3. Soniceer de samples gedurende 10 s met behulp van een sonicator met 10% amplitude (wattage: 500 W; ultrasone frequentie: 20 kHz). Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 100 °C.
  2. Bereid de lysaten van exosoom-verrijkte EV's voor.
    1. Resuspend de exosoom-verrijkte EV's in SDS-PAGE laadbuffer met 0,5% SDS in een concentratie van 1,2 μg/μL.
    2. Soniceer de samples gedurende 10 s met behulp van een sonicator met 10% amplitude (wattage: 500 W; ultrasone frequentie: 20 kHz). Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 100 °C.
  3. Detecteer eiwitten door Western blot.
    1. Laad hele celextracten (10 μL; 5.000 cellen/μL) en exosoomverrijkte EV-lysaten (10 μL; 1,2 μg/μL) in elke put van een Bis-Tris PAGE-gel (4-20%). Breng eiwitten over op polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen.
    2. Incubeer membranen met geschikte primaire en secundaire antilichamen. Verdun antilichamen (in de hieronder aangegeven concentraties) in blottingbuffer met PBS, Tween-20 (0,2%) en magere droge melk (10% w/v).
      1. Gebruik de volgende primaire antilichamen: anti-Annexine V (200 ng/ml), anti-CD81 (50 ng/ml), anti-flotilline-1 (200 ng/ml), anti-cytochroom c (100 ng/ml), anti-eiwit disulfide isomerase (200 ng/ml), anti-GAPDH (33 ng/ml) en anti-oxfos COX IV-subunit IV (600 ng/ml).
      2. Gebruik de volgende secundaire antilichamen: peroxidase-geconjugeerde geiten anti-konijn IgG (20 ng / ml) en peroxidase-geconjugeerde geiten anti-muis IgG (20 ng / ml).
    3. Detecteer eiwitten met behulp van een verbeterde chemiluminescentiedetectiekit.

7. Bepaling van GM-CSF-concentraties in exosoomverrijkte extracellulaire blaasjes door ELISA

OPMERKING: Evalueer de hoeveelheden GM-CSF in exosoom-verrijkte EV's met ELISA met behulp van een kit voor murine GM-CSF, volgens het protocol van de fabrikant met enkele wijzigingen.

  1. Bekleed de ELISA-plaat met vangantilichaam. Behandel exosoomverrijkte EV's (0,6 μg) alleen in PBS of PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg behandelde monsters toe aan de gecoate ELISA-plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de plaat alleen met PBS of PBS + 0,05% Tween-20.
  2. Voeg detectieantilichaam toe aan de monsters. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de plaat alleen met PBS of PBS + 0,05% Tween-20. Voeg Avidin-HRP toe aan de monsters. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de plaat alleen met PBS of PBS + 0,05% Tween-20.
  3. Bepaal de concentraties GM-CSF in exosoomverrijkte EV's door de absorptie bij 450 nm te meten op een microplaatlezer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GM-CSF is overexpressie in murine SER's.
Om GM-CSF stabiel te overexpressie in ES-D3-cellen, werd murine GM-CSF cDNA gekloond in een transfectievector om de expressievector pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP te genereren (Figuur 1A). GM-CSF was overexpressie in ES-D3-cellen door transfectie en ongeveer 20% van de tijdelijk getransfecteerde ES-D3-cellen was GFP-positief. Celklonen die GM-CSF stabiel overexpressie of de lege vectorcon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie toont een zeer efficiënte methode voor het produceren van exosoom-verrijkte EV's met het immuunstimulerende eiwit GM-CSF, dat kan worden gebruikt om de immuunmodulerende effecten van exosoom-verrijkte EV's te bestuderen. Verschillende studies suggereren dat exosomen immuunregulerende en antitumorale functies vertonen22. Exosomen van SER's die GM-CSF tot expressie komen, kunnen dus ook biologische activiteiten bezitten die de immuunrespons reguleren. In dit protocol werd exogene murine ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li en John W. Eaton dienden een Amerikaanse patentaanvraag in "Samenstellingen bestaande uit gemanipuleerde embryonale stamcel-afgeleide exosomen en methoden voor het gebruik daarvan."

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn de heer Arkadiusz Slusarczyk en Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) dankbaar voor het verkrijgen van transmissie-elektronenmicroscoopbeelden. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 en CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) en Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alkaline fosfatase, Calf IntestinalNew England BiolabsM0290SDefosforyleren van DNA-plasmide
anti-Annexin V mAbSanta Cruz Biotechnologyclone H-3, sc-74438Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAbSanta Cruz Biotechnologyclone A-8, sc-13156Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone C-2; sc-74566Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAbRockland600-401-A33SWestern blot, RRID:AB_11182910
anti-muis IgG, geit, peroxidase-geconjugeerdThermo Fisher31430Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subeenheid IV mAbThermo Fisherclone 20E8C12 A21348Western blot, RRID:AB_221509
anti-eiwit disulfide isomerase (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890Western blot, RRID:AB_10616242
anti-konijn IgG, geit, peroxidase-geconjugeerdThermo Fisher31460Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic zuur) assayThermo Fisher23223Bepalen van eiwitconcentraties
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%GenscriptM42015Western blot
Carbenicilline, DinatriumzoutThermo Fisher10177012Selectie van E. coli kolonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPIBeckman CoulterLaagsnelheidscentrifugering
Centrifuge rotor, JA-10Beckman Coulter09U1597Laagsnelheidscentrifugering
Centrifuge fles, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKLaagsnelheidscentrifugering
Cu roosters met koolstofondersteuningsfilmElectron Microscopy SciencesFF200-CuVerkrijgen van elektronenmicroscoopbeelden
EcoRINew England BiolabsR0101Verteren van DNA-plasmide
Enhanced chemiluminescence detectiesysteemThermo Fisher32106Western blot
FACScalibur flow cytometerBecton DickinsonOnderzoeken van GFP-niveaus van ES-D3 cellen
Fetaal bovien serumATCCSCRR-30-2020Medium voor ES-D3 cellen
Fisherbrand steriele cel zeef; Maasmaat: 40μmThermo Fisher22-363-547Filteren van ES-D3 cellen voor FACS sorteer
Gelatine (0,1%)Thermo FisherES006BKweek van ES-D3 cellen
GM-CSF ELISA kitThermo Fisher88733422Bepalen van GM-CSF-concentraties
KnockOut Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s MediumThermo Fisher10-829-018Medium voor ES-D3 cellen
Leukemie Remmende FactorThermo FisherESG1106Medium voor ES-D3 cellen
L-glutamineVWRVWRL0131-0100Medium voor ES-D3 cellen
Lipofectamine 2000 transfectie reagensThermo Fisher11668019Transfectie van ES-D3 cellen
Microplaat lezer, PowerWave XSBioTekBepalen van GM-CSF-concentraties
MoFlo XDP hoge snelheidscel sorterBeckman CoulterIsoleren van enkele ES-D3 celklonen
NEB 5-alpha Competent E. coliNew England BiolabsC2988JGenereren van GM-CSF expressieplasmide
NeomycineThermo Fisher10-131-035Selectie van ES-D3 klonen
Niet-essentiële aminozurenThermo FisherSH3023801Medium voor ES-D3 cellen
Niet-vette melkpoederThermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I Gereduceerd Serum MediumThermo Fisher31985062Transfectie van ES-D3 cellen
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Verkrijgen van elektronenmicroscoopbeelden
Penicilline/streptomycineVWRsc45000-652Medium voor ES-D3 cellen
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270Genereren van GM-CSF expressieplasmide
PVDF membranenMillipore EMDIPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106Genereren van GM-CSF expressieplasmide
QIAquick Gel Extractie Kit (50)QIAGEN28704Genereren van GM-CSF expressieplasmide
Quick Ligatie KitNew England BiolabsM2200SGenereren van GM-CSF expressieplasmide
Transmissie elektronenmicroscoopHitachiHT7700Verkrijgen van elektronenmicroscoopbeelden
TrypsineVWR45000-660Kweek van ES-D3 cellen
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XPBeckman CoulterHoge snelheidscentrifugering
Ultracentrifuge rotor, 45TiBeckman Coulter09U4454Hoge snelheidscentrifugering
Ultracentrifuge polycarbonaat flesBeckman Coulter355622Hoge snelheidscentrifugering
UranyLess kleuringsoplossingElectron Microscopy Sciences22409Verkrijgen van elektronenmicroscoopbeelden

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
  3. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  4. Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
  5. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  6. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
  8. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
  9. Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
  10. Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
  11. Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
  12. Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
  13. Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
  14. Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
  15. Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
  16. Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  17. Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
  18. Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
  19. Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289(2012).
  20. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  21. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  22. Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
  23. Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81(2018).
  24. Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
  25. Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
  26. Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  27. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
  28. Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GM CSF overexpressieultracentrifugatieprotocoltransmissie elektronenmicroscopieWestern blot analyseELISA detectiekitexosoomisolatiemethodecelcultuursupernatantexosomale markers

Gerelateerde artikelen