Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een darm/levermicrofysiologisch systeem voor farmacokinetische en toxicologische beoordeling

7.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60184

⸱

3 december 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

In dit artikel

Samenvatting

We stelden een microfysiologisch systeem (MPS) met darm- en leverorganoïden bloot aan paracetamol (APAP). Dit artikel beschrijft de methoden voor organoïde productie en APAP farmacokinetische en toxicologische eigendomsbeoordelingen in de MPS. Het beschrijft ook de weefselfunctionaliteitsanalyses die nodig zijn om de resultaten te valideren.

Samenvatting

De onlangs geïntroduceerde microfysiologische systemen (MPS) cultiveren menselijke organoïden zullen naar verwachting beter presteren dan dieren in de preklinische tests fase van het geneesmiddel ontwikkelen proces, omdat ze genetisch menselijk en recapituleren het samenspel tussen weefsels. In deze studie werden de menselijke darmbarrière (geëmuleerd door een co-cultuur van Caco-2- en HT-29-cellen) en het leverequivalent (geëmuleerd door sferoïden gemaakt van gedifferentieerde HepaRG-cellen en menselijke lever stellatische cellen) geïntegreerd in een twee-orgaanchip (2-OC) microfluïde apparaat om wat paracetamol (APAP) farmacokinetische (PK) en toxische eigenschappen te beoordelen. De MPS had drie samenstellingen: Darm slechts 2-OC, Lever slechts 2-OC, en Darm/Lever 2-OC met de zelfde media die beide organoïden doordringen. Voor PK-beoordelingen hebben we de APAP in de media gesedisd op vooraf ingestelde tijdpunten na toediening over de darmbarrière (het emuleren van de orale route) of in de media (het emuleren van de intraveneuze route), op respectievelijk 12 μM en 2 μM. De mediamonsters werden geanalyseerd door reversed-phase hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC). Organoïden werden geanalyseerd voor genexpressie, voor TEER-waarden, voor eiwitexpressie en -activiteit, en vervolgens verzameld, vastgesteld en onderworpen aan een reeks morfologische evaluaties. De MTT-techniek presteerde goed bij het beoordelen van de levensvatbaarheid van de organoïden, maar de hoge gehalteanalyses (HCA) konden zeer vroege toxische voorvallen detecteren in reactie op apap-behandeling. We hebben geverifieerd dat de mediastroom de APAP-absorptie niet significant beïnvloedt, terwijl de leverequivalente functionaliteit aanzienlijk verbetert. De APAP menselijke darmabsorptie en leverstofwisseling kan worden geëmuleerd in de MPS. Het verband tussen MPS-gegevens en in silico-modellering heeft een groot potentieel om de voorspelbaarheid van de in vitro-methoden te verbeteren en een betere nauwkeurigheid te bieden dan diermodellen in farmacokinetische en toxicologische studies.

Inleiding

Als gevolg van genomische en proteomische verschillen, dier modellen hebben beperkte voorspellende waarde voor verschillende menselijke resultaten. Bovendien zijn ze tijdrovend, duur en ethisch twijfelachtig1. MPS is een relatief nieuwe technologie die gericht is op het verbeteren van de voorspellende kracht en het verminderen van de kosten en tijd besteed aan pre-klinische tests. Het zijn microfluidische apparaten die organoïden (kunstmatige mimetiek functionele eenheden van organen) cultiveren onder mediastroom die organoïde-organoïde communicatie bevordert. Organoïden gemaakt van menselijke cellen verhogen de relevantie van de vertaling2,3,4. MPS zal naar verwachting beter presteren dan de dierproeven omdat ze genetisch menselijk zijn en het samenspel tussen weefsels samenvatten. Wanneer het volledig functioneel is, zal de MPS zinvollere resultaten opleveren, met hogere snelheid en lagere kosten en risico's4. Veel groepen ontwikkelen MPS voor verschillende doeleinden, met name ziektemodellen om de werkzaamheid van geneesmiddelen te testen.

Blootstellingsniveau is een van de meest kritieke parameters voor de evaluatie van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen5,6,7,8,9,10,11,12. MPS maakt organoïde integratie die systemische blootstelling emuleert en zal naar verwachting beter presteren dan de traditionele 2D menselijke weefsel cultuur. Deze technologie kan de voorspelling van samengestelde darmabsorptie en levermetabolisme4aanzienlijk verbeteren.

Een MPS integratie van menselijk gelijkwaardig model van darm en lever is een goed uitgangspunt, gezien de centrale rol van deze twee organen in de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen en systemische blootstelling13,14,15. APAP is een aantrekkelijk medicijn voor het bestuderen van een MPS zonder nierequivalent omdat de metabolisatie voornamelijk wordt gedaan door de lever16,17.

De 2-OC is een tweekamermicrofluïdisch apparaat dat geschikt is voor de cultuur van twee verschillende menselijke equivalente weefsels/organoïden met elkaar verbonden door microkanalen16. Om een in vitro human orale/intraveneuze toediening van een geneesmiddel na te bootsen en de effecten van de kruisspraak tussen de darm- en leverequivalenten op APAP-farmacokinetiek te beoordelen, naast de organoïden functionaliteit en levensvatbaarheid, drie verschillende MPS assemblages werden uitgevoerd: (1) een "Darm 2-OC MPS" bestaat uit een darm equivalent gebaseerd op een cultuur insert met een Caco-2 + HT-29 cellen cocultuur, geïntegreerd in de 2-OC apparaat; (2) een "Liver 2-OC MPS" bestaande uit leversferoïden van HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) geïntegreerd in het 2-OC apparaat; en (3) een "Darm/Lever 2-OC MPS" bestaande uit het darmequivalent in het ene apparaatcompartiment dat communiceert met het leverequivalent in het andere door de mediastroom door de microfluïde kanalen.

Alle tests werden uitgevoerd onder statische (geen stroom) en dynamische (met stroom) omstandigheden als gevolg van de impact van de mechanische stimuli (compressie, stretching, en schuintrekken) op de levensvatbaarheid van de cel en functionaliteiten18,19,20. Het onderhavige artikel beschrijft het protocol voor APAP orale/intraveneuze toedieningsmultiulatie en de respectievelijke absorptie/stofwisseling en toxicologische analyses in de 2-OC MPS met menselijke darm- en leverequivalentenmodellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Productie van weefselequivalenten voor de teelt in de 2-OC

  1. De gelijkwaardige productie van de dunne darmbarrière
    1. Onderhouden Caco-2 en HT-29 cellen met behulp van de darm equivalent medium: DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline en streptomycine, en 1% niet-essentiële aminozuren, die wordt genoemd als "DMEM S" in dit manuscript.
    2. Verwijder het medium, was twee maal met 1x DPBS en voeg 8 mL van 0,25% Trypsin/EDTA toe om Caco-2 cellen te scheiden die in celkweekkolven worden gekweekt (175 cm2). Incubeer gedurende 5 min bij 37 °C en stop de reactie door ten minste het dubbele volume van de trypsineremmer toe te voegen. Voer dezelfde procedure uit voor HT-29-cellen, waarbij de reagensvolumes worden aangepast omdat een kleinere hoeveelheid van deze cellen nodig is en ze worden gehandhaafd in kleinere kolven (75 cm2).
    3. Centrifuge op 250 x g gedurende 5 min, verwijder de supernatant uit beide buizen, en resuspend de cel pellets in 10 mL van DMEM S. Tel cellen, het waarborgen van een cel levensvatbaarheid hoger dan 80%. Aseptically integreren celcultuur inserts in een 24-put plaat eerder gevuld met 400 μL van DMEM S per goed in de basolaterale kant (die de menselijke bloedbaan vertegenwoordigt).
    4. Co-cultiveren Caco-2 en HT-29 cellen met een verhouding van 9:121. Gebruik 2,25 x 105 Caco-2 en 2,5 x 104 HT-29 cellen aan elk darmequivalent in een eindvolume van 200 μL DMEM S. Pas celnummers en -volume aan op basis van het gewenste aantal organoïden. Meng voorzichtig.
    5. Pipette 200 μL celoplossing in de apicale kant van elke insert (die de menselijke darmlumenzijde vertegenwoordigt), die 250.000 cellen per insert zaait. Co-cultiveren van de cellen in de inserts gedurende drie weken22. Verander het medium ten minste drie keer per week, aspirating het van zowel de apicale en basolaterale zijden met een steriele Pasteur pipet, waarbij zorg ervoor dat de intacte celbarrière niet beschadigen.
      OPMERKING: Ga verder met de aspiratie aan de apicale kant, om de celbarrière niet aan te raken (aanzuigen door de Pasteur pipet op de plastic rand van de cel insert te ondersteunen).
    6. Controleer de strakke monolaagvorming door de TEER (transepithelial electrical resistance) om de drie dagen te meten met behulp van een voltmeter23, volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Voer een lege, het meten van de weerstand over een cel cultuur insert zonder cellen, maar met dezelfde cel medium en op dezelfde celplaat.
      2. Bereken de weefselweerstand door de blancoweerstand af te trekken van de weefselequivalentweerstand en vermenigvuldig met het effectieve oppervlak van het filtermembraan (0,6 cm2). Een goede darmbarrièreweerstand bedraagt 150 tot 400 Ω·cm2.
        OPMERKING: Na 21 dagen moeten de cellen volledig gedifferentieerd zijn en de darmbarrière gevormd, zodat de darmequivalenten klaar zijn om in MPS te worden geïntegreerd.
  2. Leverequivalenten productie
    1. Onderhouden HepaRG cellen met behulp van de lever equivalent medium, dat is William's Medium E aangevuld met 10% foetale runder serum, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / mL penicilline, 100 μg / mL streptomycine, 5 μg / mL menselijke insuline en 5 x 10-5 M hydrocortison, en heet "Williams E S" in dit manuscript. Vernieuwen HepaRG media elke 2-3 dagen en handhaven celcultuur voor twee weken om de differentiatie in hepatocyten en cholangiocyten te starten.
    2. Voeg na de eerste twee weken 2% DMSO toe aan het medium van HepaRG voor nog eens twee weken om de celdifferentiatie24,25te voltooien . Grow HHSTeC in Stellate Cell Media (SteC CM), met behulp van poly-L-lysine-gecoate celkweekkolven, veranderende media om de twee of drie dagen.
    3. Verwijder het medium, was twee maal met 1x DPBS en voeg 8 mL van 0,05% Trypsin/EDTA toe om HepaRG-cellen te scheiden die in celkweekkolven worden gekweekt (175 cm2). Incubeer gedurende 5 tot 10 min bij 37 °C en stop de reactie door het volume van de trypsineremmer minstens het dubbele toe te voegen. Voer hetzelfde uit voor HHSTeC, het aanpassen van het reagensvolume omdat een kleinere hoeveelheid van deze cellen nodig is en ze kunnen worden onderhouden in kleinere kolven (75 cm2).
    4. Centrifuge zowel op 250 x g gedurende 5 min, verwijder de supernatant en resuspend de cel pellets in Williams E S medium. Tel cellen, het verzekeren van een cel levensvatbaarheid hoger dan 80%.
    5. Genereer de leversferoïden die HepaRG- en HHSTeC-cellen combineren met een verhouding van respectievelijk 24:1 in Williams E S medium16. Voeg 4,8 x 104 gedifferentieerde HepaRG en 0,2 x 104 HHSTeC toe om elke leversferoïde van 50.000 cellen samen te stellen, in een volume van 80 μL. Pas celnummers en -volume aan op basis van het gewenste aantal sferoïden. Meng voorzichtig.
    6. Met behulp van een multichannel pipet, afzien van 80 μL van de gecombineerde cel pool in elke put van 384 sferoïde microplaten, die ronde goed-bodem geometrie heeft.
      OPMERKING: Na vier dagen worden sferoïden van ongeveer 300 μm gevormd.
    7. Met behulp van wide-bore tips, breng de lever sferoïden naar ultra-low-attachment 6 goed platen, die het mogelijk maakt de vereiste "een-voor-een" tellen.

2. Integratie van darm- en leverequivalenten in een 2-OC MPS

  1. Darm 2-OC MPS assemblage voor absorptietest
    1. Pipette 500 μL DMEM S in het grotere compartiment van 2-OC en 300 μL in de kleinere. Aspirate de basolaterale en apicale media van elke darmbarrière equivalent in de 24 goed platen. Met behulp van steriele tangen, integreren een insert per 2-OC circuit, met name in het grotere compartiment. Breng 200 μL van het darmmedium aan de apicale kant aan.
      OPMERKING: Vermijd de vorming van bellen bij de integratie van de organoïden in de MPS.
    2. Sluit de MPS aan op de besturingseenheid, die moet worden aangesloten op een luchttoevoer onder druk. Stel de parameters: een druk van ongeveer ±300 bar en een pompfrequentie van 0,3 Hz. Start de stroom 24 uur voor de toediening van de teststof. De volgende dag voert u de APAP-behandeling uit.
  2. Lever 2-OC MPS assemblage voor metabolisme test
    1. Pipette 650 μL van Williams E S in het grote compartiment en 350 μL in het kleinere compartiment, dat de sferoïden zal ontvangen. In de ultra-lage bevestiging 6 goed platen, tel de sferoïden met behulp van wide-bore tips. Elk leverequivalent bestaat uit twintig sferoïden26. Integreer twintig leverequivalenten per circuit, met behulp van brede-boring tips, die de overdracht van organoïden alleen mogelijk maakt, in het kleinere compartiment van een 2-OC.
    2. Sluit de MPS aan op de besturingseenheid, die moet worden aangesloten op een luchttoevoer onder druk. Stel de parameters: een druk van ongeveer ±300 bar en een pompfrequentie van 0,3 Hz. Start de stroom 24 uur voor de toediening van de teststof. De volgende dag voert u de APAP-behandeling uit.
  3. Darm/Lever 2-OC MPS assemblage voor absorptie en metabolisme test
    1. Combineer de twee media (darm en lever) in een 1:4 verhouding, wat betekent 200 μL DMEM S in de darm apicale kant en 800 μL van Williams E S in de basolaterale kant. Integreer darm- en leverequivalenten tegelijkertijd in de 2-OC.
    2. Sluit de MPS aan op de besturingseenheid, die moet worden aangesloten op een luchttoevoer onder druk. Stel de parameters: een druk van ongeveer ±300 bar en een pompfrequentie van 0,3 Hz. Start de stroom 24 uur voor de toediening van de teststof. De volgende dag voert u de APAP-behandeling uit.
      OPMERKING: Voer voor alle experimenten elk keer punt in drievoud uit, wat betekent dat drie gescheiden 2-OC-circuits (d.w.z. 1 en 1/2 2-OC-apparaten). Het totale volume van elke 2-OC circuits is 1 mL.

3. Paracetamol (APAP) voorbereiding

  1. Bereid de APAP voorraadoplossing voor en los APAP op in absolute ethanol. Op de dag van het experiment verdunt APAP in het respectievelijke medium (APAP-oplossing), tot een concentratie van 12 μM voor "orale toediening" en 2 μM voor "intraveneuze toediening".
  2. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie ethanol in de voertuigcontrole- en behandelingsoplossing 0,5% bedraagt voor beide overheidsdiensten. Voor de positieve controle (100 mM APAP) bedraagt de ethanolconcentratie 2%.

4. Toediening van de teststof en bemonstering van media

  1. APAP "orale" administratie en mediabemonstering
    1. Aspirate de basolaterale en apicale media van elk darmbarrière-equivalent in de 2-OC. Pipet 500 μL van het juiste kweekmedium in het grote compartiment aan de organoïde basolaterale kant en 300 μL in het kleine compartiment.
    2. Controleer op bellen en ga verder met de darmbarrière gelijkwaardige behandeling met de teststof in de apicale kant, emuleren orale toediening. Emuleer APAP "orale" toediening door 200 μL van een 12 μM APAP-oplossing toe te voegen aan de apicale kant van de darmcultuurinserts, die de darmzijde van het lumen vertegenwoordigt (Figuur 1B). Sluit de MPS aan op de besturingseenheid.
    3. Verzamel het totale volume van apicale en van basolaterale kanten op de volgende tijdstippen: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, en 24 h15,27. Voer alle experimenten uit in drievoud, onder statische en dynamische omstandigheden, en verzamel elk monster, van elk drievoud, in een aparte microtube. Analyseer de monsters met behulp van HPLC/UV.
      OPMERKING: Afzonderlijke apicale en basolaterale monsters.
  2. APAP "intraveneuze" administratie en mediabemonstering
    1. Emuleer de "intraveneuze" route door 2 μM APAP-oplossing rechtstreeks in het levercompartiment toe te dienen. Aspirate alle 2-OC medium content. Pipette 650 μL Williams E S met de teststof in het grote compartiment en 350 μL van hetzelfde medium in het kleinere compartiment dat de 20 sferoïden bevat. Verzamel alle volumes op de volgende tijdstipen: 0 uur, 30 min, 1 uur, 2 uur, 3 uur, 6 uur, 12 uur en 24 uur27,28.
    2. Voer alle experimenten uit in drievoud, onder statische en dynamische omstandigheden. Verzamel elk monster, van elk drievoud, in een aparte microbuis. Analyseer de monsters met behulp van HPLC/UV.

5. Instrumentatie en chromatografische omstandigheden

  1. HPLC-analyse
    1. Stel alle relevante parameters voor de HPLC-analyse in volgens tabel 1.
    2. Filtreer de mobiele fase door een membraanfilter van 0,45 μm onder vacuüm. Filtreer de monsters door een 0,22 μm porie grootte PVDF spuitfilter (diameter 13 mm) en bewaar ze in een flacon. Start de meting.
  2. Stockoplossingen, kalibratienormen en QC-monsters (Quality Control)
    1. Bereid 10 mM APAP-voorraadoplossingen voor in ammoniumacetaatbuffer (100 mM, pH 6.8) en verdun verder met DMEM S- en Williams E S-celkweekmedia verdund met ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v) om de werkoplossingen te bereiken variërend van 0,25 tot 100,00 μM.
    2. Neem een set kalibratiemonsters op in drievoud en kwaliteitscontrolemonsters op vier niveaus in drievoud. Bereid deze normen door seriële verdunning.
    3. Maak kalibratiecurven van APAP-piekgebieden versus APAP nominale standaardconcentraties. Bepaal de lineaire regressie die geschikt is voor elke kalibratiecurve. Evalueer de goedheid van verschillende kalibratiemodellen aan de hand van visuele inspectie, correlatiecoëfficiënt, intra- en inter-run nauwkeurigheid en precisiewaarden.
    4. Injecteer lege monsters van DMEM S en Williams E S media verdund in ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v) in sextuplicaat. Bereid drievouden van kwaliteitscontrolemonsters in DMEM S en Williams E S-media die zijn verdund met ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v) voor de APAP-concentraties van 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 en 90,00 μM.
    5. Zorg ervoor dat de kwaliteitscontrolemonsters worden bereid vanuit een nieuwe voorraadoplossing, anders dan die voor het genereren van een standaardcurve. Gebruik kwaliteitscontrolemonsters om intra- en inter-run variaties te onderzoeken.
  3. Validatieprocedures
    1. Voer de validatie van de bioanalytische methode uit volgens de eerder gerapporteerde procedures29,30. Voer de chromatografische runs uit op vijf of zes afzonderlijke gelegenheden, rekening houdend met Williams E S en DMEM S cel cultuur media, respectievelijk.
    2. Zorg ervoor dat kalibratiepunten variërend van 0,25 tot 100,00 μM APAP, in DMEM S- of Williams E S-celkweekmedia verdund in ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v), worden uitgezet op basis van de piekgebieden van APAP (as y) ten opzichte van de respectieve nominale concentraties (as x). Vergelijk de hellingen van deze standaard kalibratiecurven met hellingen van kalibratiecurve die zijn bereid in ammoniumacetaatbuffer. Zorg ervoor dat alle kalibratiecurven een correlatiewaarde hebben van ten minste 0,998.
    3. Bepaal de precisie en nauwkeurigheid (intra- en inter-run) voor de analyt in de draagmatrix met behulp van replica's op vier verschillende niveaus LLOQ, lage, middelste en hoge kwaliteit controle op vijf of zes verschillende dagen. Voer op dezelfde dag intra-run precisie- en nauwkeurigheidsmetingen uit in DMEM S- of Williams E S-celkweekmedia verdund in ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v) met 0,50, 4,50, 45,00 en 90,00 μM APAP-concentraties (n= 3).
    4. Evalueer elke set van kwaliteitscontrolemonsters die de APAP-concentraties bevatten van recent verkregen kalibratiecurven. Test de selectiviteit van de tests door de mate van scheiding van de verbinding van belang en mogelijke andere chromatografische pieken veroorzaakt door storende componenten.
  4. Ondergrens van kwantificering (LLOQ) en detectielimiet (LOD)
    1. Bepaal de ondergrens van kwantificering (LLOQ) op basis van de standaarddeviatie van de respons en de hellingsbenadering. Bereken met behulp van de formule 10α/S, waarbij α de standaarddeviatie is van y-intercept en S is de helling van de rechte lijn verkregen door kalibratiecurven29,30teplotten . Schat de detectiegrens (LOD) rekening houdend met 3,3 keer de standaarddeviatie van de blanco, gedeeld door de helling van de kalibratiecurve29,30.

6. Weefselequivalenten levensvatbaarheid/functionaliteit

  1. Mtt
    1. Voer een MTT-test uit om de levensvatbaarheid van organoïden te beoordelen in alle tijdstippen van de MPS-test. Als de negatieve controle, gebruik cel media plus voertuig. Behandel als de positieve controle de organoïden met 100 mM APAP en 1% NaOH verdund in celmedium.
    2. Breng de 20 sferoïden van elk repliceren voor individuele putten in een 96 put plaat, en de celcultuur inserts, met de darm equivalenten, tot 24 goed celplaten, het plaatsen van een darm equivalent per goed. Was de weefselequivalenten drie keer met 1x DPBS.
    3. Voeg 300 μL van een 1 mg/mL MTT-oplossing, verdund in het respectievelijke celmedium, per put toe. Incubeer de platen voor 3 uur bij standaard celkweekomstandigheden.
    4. Verwijder de MTT-oplossing uit elke put zorgvuldig door pipetten. Haal MTT formazan uit de darm- en leverequivalenten met 200 μL isopropanol per put 's nachts bij 4 °C.
      LET OP: Sluit het deksel af om verdamping te voorkomen.
    5. Breng 200 μL van elke supernatant over naar de respectievelijke vooraf geïdentificeerde put in een 96 goed micro testplaat. Gebruik isopropanol als de lege.
    6. Lees de formazan absorptie in een plaatlezer op 570 nm. Bereken het relatieve vermogen van de cellen om MTT te verminderen (%) met behulp van de gemiddelde optische dichtheid van elk tijdspunt, in vergelijking met de negatieve controle, beschouwd als 100% cel levensvatbaarheid.
  2. Cytochemie/Histologie
    1. Bevestig de darm- en leverequivalenten gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur met behulp van 4% (w/v) paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatzoutbuffer, pH 7.4. Was de organoïden 5 keer in PBS buffer gedurende 10 minuten elke keer. Bevlek de darm- en leverequivalenten met tetramethylrhodamine isothiocyanaat-phalloïden of Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 in PBS31.
    2. Breng ze enkele minuten over naar het vriesmedium van de LGO om bij RT te acclimatiseren voordat u ze overzet naar vloeibare stikstof tot de volledige bevriezing. Voer leversferoïden cryosections uit van ongeveer 10-12 μm dik, met behulp van een cryostat.
    3. Monteer de weefsels secties in montage medium met DAPI. Onderzoek ze door confocale fluorescentie microscopie.
    4. Vries de organoïden na fixatie om hematoxyline & eosine kleuring uit te voeren volgens de vastgestelde protocollen. Monteer de dia's met montagemedium na het snijden van het weefsel zoals hierboven beschreven en neem histologische beelden met behulp van een optische microscoop.
  3. Analyse met hoge inhoud
    1. Mitochondriale en nucleaire kleuring van de cellen
      1. Reconstrueer het gelyofiele poeder in DMSO om een 1 mM mitochondriale kleurstofoplossing te maken (bijvoorbeeld MitoTracker Deep Red FM). Bewaar aliquoted stock oplossing bij -20 °C beschermd tegen licht. Verdun de 1 mM mitochondriale kleurstofoplossing tot de uiteindelijke concentratie (200 nM) in voorverwarmd (37 °C) weefselkweekmedium zonder serum.
      2. Verwijder de celcultuurmedia. Voeg de mitochondriale kleuroplossing toe om het monster volledig af te dekken en incubeercellen gedurende 15-45 min bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
      3. Verwijder voorzichtig de mitochondriale kleuroplossing en vervang deze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur door 2-4% paraformaldehyde fixatief in PBS.
      4. Spoel de vaste cellen voorzichtig af met PBS gedurende 5 minuten. Herhaal het wasproces twee keer.
      5. Bereid een nucleïnezuuroplossing van 10 mg/mL (16,23 M) voor door 100 mg Hoechst 33342 kleurstof op te lossen in 10 mL ultrazuiver water.
        LET OP: De voorraadoplossing moet worden opgeslagen en beschermd tegen licht bij -20 °C.
      6. Bereid een 0,2-2,0 μg/mL nucleïnezuur kleuringsoplossing in PBS en ontcubeer de gefixeerde cellen met nucleïnezuur kleuroplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      7. Verwijder de nucleïnezuur kleuring werkoplossing en spoel de cellen zachtjes met PBS gedurende 5 minuten drie keer. Cellen moeten in PBS op 4 °C worden bewaard, beschermd tegen licht.
    2. Mitochondriale en nucleaire kleuringsanalyse
      1. Analyseer cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop met filtersets die geschikt zijn voor de nucleïnezuurvlek (λEx/ λEm: 361/497 nm) en de mitochondriale vlek (λEx/ λEm: 644/665 nm). Zoek cellen door nucleïnezuur positieve kleuring en kwantificeren celnummer. Kwantificeren mitochondriale vlekfluorescentie intensiteit in mitochondriën.
  4. Morfmetrische metingen (sferoïdenberekeningen) in ImageJ
    1. Exporteer HCA-afbeeldingen (High Content Analysis) als *.flex-bestanden uit de Columbus-software. Importeer .flex-bestanden als grijswaarden in ImageJ met Bio-formats plugin32: Bestand > Importeren > Bio-indelingen.
    2. Selecteer in het venster Opties importeren de optie Hyperstack-weergave en schakel Gesplitste kanalen in onder Splitsen in afzonderlijke vensters. Met deze optie kunnen alle bestanden in een bepaald kanaal worden geopend (bijvoorbeeld DAPI, mitotracker, enz.). Selecteer Virtuele stack gebruiken niet onder Geheugenbeheer.
      OPMERKING: Het is beter om DAPI-kanaal te gebruiken als "stof" in beelden, omdat het kweekmedium wordt verminderd in UV-golflengte (bijvoorbeeld 405 nm).
    3. Pixelgrootte aanpassen(Analyseren > Schaal instellen)als deze niet is geladen op basis van ingesloten waarden in het .flex-bestand. Breng een Gaussian Blur filter om de overmaat van ruis te verwijderen en onregelmatigheden in de vormcontour te voorkomen. Proces > Filters > Gaussian Blur. Een hoge waarde van Sigma (straal) tussen 2.0 en 3.0 is ideaal voor de meeste gevallen. Als de stapel meerdere afbeeldingen heeft, moet u deze op alle afbeeldingen toepassen (selecteer Ja in processtapelvenster).
    4. Een binaire afbeelding genereren om achtergrond- en organoïden (objecten) te scheiden met behulp van een drempelwaarde. Klik op Afbeelding > Aanpassen > Drempelwaarde. Gebruik het rode masker om de waarden aan te passen aan de intensiteit van de afbeelding, om de organoïde vorm te passen, waarbij de morfologie intact blijft. Donkere achtergrond uitschakelen als de afbeelding een witte achtergrond heeft. Klik op Toepassen.
    5. Kies in het venster Stapel converteren naar binair de methode Drempel. Meestal hebben Standaard of Driehoek de voorkeur in dit soort beeldverwerking. Houd de achtergrond zo donker. Selecteer Drempelwaarde berekenen voor elke afbeelding als er meerdere afbeeldingen in de stapel zijn.
    6. Selecteer Proces > Binair > Opvulgaten. Verwijder eventueel gaten van de achtergrond. Selecteer in Proces > Binair > Opties de optie Zwarte achtergrond en voer Vulgaten opnieuw uit. Schakel de optie Zwarte achtergrond uit voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    7. Afzonderlijke objecten. Voor organoïden is de waterscheidingsmethode een goede keuze. Klik op Proces > Binair > Waterscheiding. Voer de vormanalyse uit.
      1. Selecteer Analyseren > Metingen instellen. Er zijn verschillende opties beschikbaar (details in https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Selecteer voor organoïden Gebied, Gemiddelde grijze waarde, Min & max grijswaarde en Shapedescriptors. Selecteer de optie Afbeeldingslabel om objecten in de afbeelding en wetenschappelijke notatiete identificeren. Klik op OK.
      2. Selecteer Analyse > Deeltjes analyseren. Kies de limieten Grootte en Circulariteit. Houd respectievelijk 0-oneindigheid en 0,00-1,00 om alle objecten in de afbeelding te meten. Kies in Weergeven contouren zodat de objecten worden geïdentificeerd. Weergaveresultaten inschakelen om resultaten uit te geven; Sluit randen uit om objecten uit te sluiten die randen raken; Neem gaten op, zodat eventuele binnengaten in de objecten worden beschouwd als onderdeel van de hoofdvorm.
    8. Herhaal shapeanalyse voor elke afbeeldingsstapel en de resultaten worden in één tabel toegevoegd. Tabel Resultaten exporteren in Bestand > Opslaan als... als bestand met gescheiden waarden van komma's (.csv).
  5. Real-Time PCR
    1. Extract RNA uit weefsel equivalenten met behulp van een monofasische oplossing van fenol en guanidine isothiocyanaat, volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Voer de cDNA-synthese uit door omgekeerde transcriptie van 1 – 2 μg van het totale RNA uit te voeren.
    3. Versterk alle doelen met behulp van genspecifieke primers(tabel 5) om real-time kwantitatieve PCR uit te voeren. Elke qRT-PCR bevat 30 ng reverse-transcribed RNA en 100 nM van elke primer.
    4. Volg PCR-voorwaarden: 50 °C gedurende 3 minuten (1 cyclus); 95 °C gedurende 5 minuten (1 cyclus); 95 °C gedurende 30 seconden, 59 °C gedurende 45 seconden en 72 °C gedurende 45 seconden (35 - 40 cycli).
  6. CYP-test
    1. Volg punt 2.2 voor lever 2-OC assemblage. De experimentele groepen zijn No-cell control, APAP 2 μM behandelingen voor 12 uur, 24 uur en voertuigcontrole. Volg de punten 3.3 en 4.2 voor APAP 2 μM preparaat en behandeling.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat alle monsters tegelijkertijd klaar zijn voor CYP-test, start u de 12-uursbehandeling 12 uur na het starten van de 24-uursbehandeling. Behandel de no-cell controle van CYP activiteit met 0,5% ethanol oplossing, evenals de controle van het voertuig.
    2. Ontdooi 3 mM luminogene substraatvoorraadoplossing bij kamertemperatuur en maak een verdunning van 1:1000 in William's E S. Bescherm tegen licht.
    3. Verzamel sferoïden en breng elke experimentele groep over naar een put van een 96-put plaat. Verwijder het medium, was twee maal met 100 μL 1x DPBS en voeg 80 μL van 3 μM substraatoplossing per put toe. Bewaar de no-cell controle in William's E S medium. Bewaar een put zonder sferoïden of substraatoplossing voor een achtergrondcontrole. Incubeer gedurende 30-60 min bij 37 °C met 5% CO2, beschermd tegen licht.
    4. Equilibrate lyophilized Luciferin Detection Reagent (LDR) met behulp van de Reconstitution Buffer met esterase. Meng door te wervelen of om te keren. Bewaar het toegeëigende volume bij kamertemperatuur tot de volgende stap.
      LET OP: Gereconstitueerde LDR kan 24 uur of 1 week bij kamertemperatuur worden opgeslagen zonder verlies van activiteit. Voor langdurige opslag, bewaar op -20 °C.
    5. Breng na incubaties 25 μL intacte sferoïden over in drie verschillende putten van een witte ondoorzichtige microplaat van 96 put. Voeg 25 μL LDR per put toe en homogeniseer.
    6. Broed de witte plaat 20 minuten op kamertemperatuur. Lees de luminescentie op een luminometer. Gebruik geen fluorometer.
    7. Bereken nettosignalen door achtergrond luminescentiewaarden (no-cell control) af te trekken van de met de test samengestelde en onbehandelde (voertuigcontrole) waarden. Bereken procentuele verandering van CYP3A4 activiteit door de netto behandelde waarden te delen door de netto onbehandelde waarden en vermenigvuldigen met 100.
  7. Westelijke blotting
    1. Breng de leversferoïden over op een geïdentificeerde 1,5 mL microbuis. Verwijder het medium en was twee maal met 100 μL 1x DPBS.
    2. Lysate de leverferoïden in 100 μL van cellyse RIPA buffer bij 4 °C gedurende 20 min. Centrifuge voor 15 min, 4 °C en 11000 rpm. Breng de supernatant over naar een andere geïdentificeerde 1,5 mL microbuis.
    3. Kwantificeer de hoeveelheid eiwit verkregen door de Bradford methode. Laad tussen 10 en 50 μg eiwit uit de gekwantificeerde cellysaat per put van een gradiënt polyacrylamide gel 3-15% en voer een SDS-PAGINA uit.
    4. Breng het geladen eiwit van de gel naar een 0,22 μm PVDF mem mem via de semi-droge systeemapparatuur. Gebruik een overdrachtsoplossing van 50 mM Tris-HCl en 192 mM glycine. Stel de parameters van de apparatuur in op basis van het aantal gels dat moet worden overgedragen (1 op 2 tegelijk).
    5. Blokkeer niet-specifieke interacties op PVDF-membraan met een 3-5% magere melkoplossing in tbs-T-buffer: Tris-Buffered Saline (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM natriumchloride) aangevuld met 0,1% van Tween 20. Houd het membraan 1 uur zachtjes constant schudden bij kamertemperatuur.
    6. Was met TBS-T onder zacht constant schudden gedurende 3-5 min bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasstap twee keer.
    7. Verdun albumine en vinculine primaire antilichamen tot respectievelijk 1:1000 en 1:2000 op TBS-T. Broed het membraan 's nachts bij 4 °C uit met primaire antilichamen, onder zacht constant schudden.
      LET OP: Volg altijd de instructies van de fabrikant om antilichamen te verdunnen.
    8. Verwijder het primaire antilichaam en was membraan 3 keer (stap 6.7.6). Verdun ECL anti-muis IgG secundair antilichaam tot 1:5000 op TBS-T. Incubeer het membraan met een secundair antilichaam onder zacht constant schudden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    9. Verwijder het secundaire antilichaam en was het membraan (stap 6.7.6). Voer eiwitdetectie uit met ECL Western Blotting Substraat. Bloot de autoradiografische films voor 30 s tot 30 min. Voer de immunoblottingdetectie uit in drievoud.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de PK APAP-tests uit te voeren in de 2-OC MPS, is de eerste stap het vervaardigen van de menselijke darm- en leverequivalenten (organoïden). Ze zijn geïntegreerd in de 2-OC microfluïde apparaat (Figuur 1A) 24 uur voor het starten van de PK APAP test. De volgende dag wordt het medium gewijzigd en wordt het model blootgesteld aan APAP. Figuur 1 illustreert de darm- en leverequivalenten die in het 2-OC-apparaat(figuur 1B) en de APAP...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van de farmacologische eigenschappen van onderzoekende nieuwe geneesmiddelen is van cruciaal belang voor het verminderen van het risico in de volgende ontwikkelingsstappen. De MPS is een relatief nieuwe technologie, die gericht is op het verbeteren van de voorspellende kracht en het verminderen van de kosten en tijd besteed aan preklinische tests. Onze groep is op weg in de beoordeling van farmacokinetische en toxicologische eigenschappen meestal nodig voor lood optimalisatie. We...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon bij Unit 522 INSERM en dr. Christian Trepo bij Unit 271 INSERM voor het gebruik van het biologisch materiaal (Hepa RG cellen) en voor het beschikbaar stellen van vervolgens voor ons om het academisch onderzoek uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235Geen calcium, geen magnesium
2-OCTissUse GmbHTwo-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Zwart/helder, ronde bodem, ultra-lage hechting
4% ParaformaldehydeGebruik voor celfixatie
AcetaminophenSigma AldrichA7085Gebruik voor MPS-assays
AcetonitrileTediaGebruikt voor HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientificconfocale experiment
Ammonium acetateSigma AldrichGebruikt voor HPLC
Caco-2 cellenSigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
CelcultuurkolvenSarstedt
Confocale fluorescentiemicroscoopLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM hoge glucoseThermo Fisher Scientific12800017Voeg supplementen toe: 10% foetaal bovien serum, 100 eenheden per ml penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren
DMSOSigma AldrichD4540Voeg 2% toe aan HepaRG-medium
EthanolSynth
Foetaal bovien serumThermo Fisher Scientific12657029
Freezing medium OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Compound is een formulering van wateroplosbare glycolen en harsen, die een handige monstermatrix biedt voor cryostat secties bij temperaturen van -10°C en lager.
Hematoxyline & Eosine
HepaRG cellenBiopredic InternationalHPR101Ongedifferentieerde cellen
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cellen en alle kweeksupplementen
Hoechst 33342HCA-experimenten
HT-29 cellenSigma Aldrich85061109
Humaan insulineInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisonSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky’s fixatiemiddel
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 guard column SSPhenomenexGebruikt voor HPLC
MicroscoopLeicaDMi4000
MicrotoomLeicaRM2245
Millicell 0.4 µm poriegrootte insertsMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 meterMerckMERS00002Gebruikt voor TEER-meting
MitoTracker Deep RedHCA-experimenten
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systeemAgilent Technologies
Neubauer kamerCellen tellen
Operetta High Content Imaging SystemPerkin ElmerGebruikt voor HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay met Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15070063Celcultuur
PermountThermo Fisher ScientificHistologie
PrimersRT-qPCR
PVDF-membraanBioRad
PVDF-slangfilter0.22 µm poriegrootte
Omgekeerde-fase Luna C18-kolomPhenomenexGebruikt voor HPLC
Schudder (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Gebruikt voor spheroids om MTT-assay te verbeteren
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Voeg STeC CM-supplementen toe
SuperScriptIITM Reverse TranscriptaseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
TRizol TM-reagensThermo Fisher ScientificTrizol is een monofasische oplossing van fenol en guanidineisothiocyanaat.
Trypsine/EDTA-oplossingThermo Fisher ScientificR001100
Ultra-lage hechtingsplatenCorningCLS3471-24EA6 wellen
Vectashield plus DAPI montage media
Witte matte 96-well MicroplatePerkinHelmer
Breed-opening tips
Williams EPan BiotechP04-29510Voeg supplementen toe: 10% foetaal bovien serum, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden per ml penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 5 µg/mL humaan insuline

Referenties

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185(2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030(2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526(2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307(2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125(2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Darm lever chipfarmacokinetiek van acetaminophenHPLC analyseMTT viabiliteitsassayconfocale microscopiegenexpressie van organo denTEER metinghepatische stellaire cellenCaco 2 HT 29 co cultuur
Een darm/levermicrofysiologisch systeem voor farmacokinetische en toxicologische beoordeling
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.