Piëzo-ICSI voor menselijke eicellen

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor intracytoplasmatische sperma-injectie in menselijke eicellen met behulp van een piëzo-aangedreven micropipet.

Samenvatting

Sinds de eerste succesvolle zwangerschappen met intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) werden gemeld, is ICSI een essentiële techniek geworden in de geassisteerde voortplantingstechnologie (ART). ICSI maakt gebruik van micropipetten met een puntige punt om de zona pellucida en het membraan binnen te dringen. Vervolgens wordt het cytoplasma meestal in de micropipet opgezogen voor membraanbreuk (conventioneel-ICSI). De overlevings- en bevruchtingspercentages van eicellen van muizen na conventionele ICSI waren respectievelijk zo laag als 16% en 8%. Kimura en Yanagimachi pasten een piëzo-aandrijfeenheid, kwik en een micropipet met een platte punt toe voor ICSI van de muis. De membraanbreuk kan semi-automatisch worden uitgevoerd door dit soort apparatuur zonder cytoplasmatische aspiratie in de micropipet (piëzo-ICSI) te combineren. Deze auteurs rapporteerden significant hogere overlevings- en bevruchtingspercentages (80% en 78%) in vergelijking met die van conventionele-ICSI (16% en 8%). Daarom kan de piëzo-ICSI niet alleen effectief zijn voor eicellen van muizen, maar ook voor ICSI van menselijke eicellen. Er zijn echter slechts vijf artikelen beschikbaar die de effectiviteit van piëzo-ICSI in vergelijking met conventioneel-ICSI voor menselijke eicellen beoordelen. Al deze vijf artikelen rapporteerden significant hogere bevruchtingspercentages in vergelijking met die van conventionele ICSI. Het doel van het hier beschreven piëzo-ICSI-protocol is om de klinische resultaten van ICSI te verbeteren in vergelijking met de conventionele-ICSI.

Inleiding

Sinds Dr. Palermo de eerste succesvolle zwangerschappen rapporteerde die werden bereikt door intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI)¹, is ICSI een essentiële techniek geworden in de geassisteerde voortplantingstechnologie (ART). ICSI maakt gebruik van micropipetten met een puntige punt om de zona pellucida en het membraan binnen te dringen. Vervolgens wordt het cytoplasma meestal in de micropipet opgezogen voor membraanbreuk (conventioneel-ICSI). De overlevings- en bevruchtingspercentages van eicellen van muizen na conventionele ICSI waren respectievelijk zo laag als 16% en 8%². Kimura en Yanagimachi pasten een piëzo-aandrijfeenheid, kwik en een micropipet met een platte punt toe voor muis ICSI². De membraanbreuk kan semi-automatisch worden uitgevoerd door dit soort apparatuur (piëzo-ICSI) te combineren. Deze auteurs rapporteerden significant hogere overlevings- en bevruchtingspercentages (80% en 78%) van piëzo-ICSI in vergelijking met die van conventioneel-ICSI (16% en 8%)². Een van de redenen voor de betere resultaten die in de piëzo-ICSI worden verkregen, kan het proces van membraanbreuk zijn. De piëzo-ICSI kan het membraan stabiel en semi-automatisch breken zonder cytoplasmatische aspiratie in de micropipet. Deze resultaten suggereerden dat de cytoplasmatische aspiratie in de micropipet tijdens membraanbreuk invasief is voor eicellen van muizen. Daarom kan de piëzo-ICSI niet alleen effectief zijn voor eicellen van muizen, maar ook voor ICSI van menselijke eicellen.

Slechts vijf beschikbare artikelen hebben echter de effectiviteit van piëzo-ICSI beoordeeld in vergelijking met conventioneel-ICSI voor menselijke eicellen. Alle vijf deze artikelen rapporteerden significant hogere bevruchtingspercentages met piëzo-ICSI in vergelijking met bevruchtingspercentages met conventioneel-ICSI 3,4,5,6,7 (Tabel 1). Daarom kan de piëzo-ICSI de overleving en bevruchtingspercentages verbeteren in vergelijking met conventionele-ICSI. Het doel van het hier beschreven piëzo-ICSI-protocol is om de klinische resultaten van ICSI te verbeteren in vergelijking met conventioneel-ICSI.

Protocol

Het hieronder beschreven protocol van piëzo-ICSI volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek in het Kameda Medical Center.

1. Apparatuur en voorbereiding

1. Gebruik een piëzo-ICSI-systeem dat bestaat uit een aandrijfeenheid, een operatiebox, een voetschakelaar en een controller. Gebruik elk type omgekeerde microscoop of drie-assige micromanipulator. Bevestig de piëzo-aandrijfeenheid aan de micropipethouder en plaats de voetschakelaar op de vloer. Stel het INTENSITY-niveau in op 2 en het SPEED-niveau op 1 op de bedieningsdoos.
2. Gebruik een in de handel verkrijgbare piëzo-ICSI-micropipet met een platte punt. Vul een micropipet met de operatievloeistof (vloeistof op basis van fluorkoolstof) tot een lengte van 20 mm. Vermijd het mengen van luchtbellen in de bedrijfsvloeistof. Zuig eventuele luchtbellen of overtollige bedrijfsvloeistof op naar de achterkant van de pipet met het vloeistofvulapparaat.
3. Installeer de micropipet in de injectiemicropipethouder. Als de houder voor injectiemicropipetten een siliconen buisje heeft, steekt u de kop van de pipet ongeveer 5 mm in het siliconen slangetje. Draai de houderdop vast en bevestig de micropipet stevig.
4. Bevestig de aandrijfeenheid aan de manipulator en zet deze stevig vast om rotatie door het gewicht te voorkomen.
5. Plaats de micropipet in het microscoopveld. Bedien de injector en duw de operatievloeistof naar de kop van de micropipet zodat alle lucht in de kop van de pipet naar buiten wordt gedrukt. Controleer met het blote oog of er geen lucht meer in de kop van de pipet is achtergebleven in plaats van met een microscoop.
6. Bereid de ICSI-schaal op de schaal met glazen bodem zoals weergegeven in afbeelding 1. Bereid twee microdruppels van 7% polyvinylpyrrolidonoplossing (PVP): de kleinere microdruppel is voor de bereiding van een micropipet (5 μL) en de andere is voor de selectie van sperma (10 μL). Bereid nog een druppel voor die in het midden van de schaal met glazen bodem is gemaakt van het gebufferde medium; deze microdruppel is voor de eicel en wordt gebruikt voor sperma-injectie (8 μL).
7. Steek de kop van de micropipet in een druppel van 7% PVP en bedek de binnenwand van de micropipet. Bedien de injector krachtig en beweeg deze langs de grensvlakgrens tussen de operatievloeistof en de PVP. Spoel de binnenkant van de micropipet met PVP op ongeveer 800 μm van de kop van de pipet.
   1. Herhaal deze procedure (~3 of 4 keer) totdat de grensvlakgrens soepel glijdt.

2. Immobilisatie van sperma

1. Stel het INTENSITY-niveau in op 2 en het SPEED-niveau op 1 op de bedieningsdoos. Breng de piëzopuls van de aandrijfeenheid aan die aan de micropipethouder is bevestigd wanneer de voetschakelaar is ingeschakeld. Bij het aanbrengen van de piëzopuls tijdens de procedure verschijnt het pictogram "Piëzo-puls" rechtsboven in de video.
2. Verzamel het beweeglijke sperma met behulp van een dichtheidsgradiënt en houd het verzamelde beweeglijke sperma in het gebufferde medium. Zuig het gebufferde medium op dat het verzamelde beweeglijke sperma ongeveer 2-3 μL bevat met behulp van een pipet. Injecteer dit medium vervolgens in de onderkant van de 7% PVP-microdruppel. Selecteer het sperma onder een vergroting van 400x.
   1. Bevestig de punt van de micropipet aan de staart van het geselecteerde sperma en drijf vervolgens de piëzo-aandrijfeenheid aan. Herhaal het rijden meestal 3 keer voor één immobilisatie van het sperma. Zuig na de immobilisatie van het sperma het sperma eerst in de staart van de micropipet.

3. Piëzo-ICSI-operatie (een eicel met een membraan met een hoog rekvermogen)

1. Houd de kop van het sperma op een positie ongeveer één sperma over de volledige lengte van de kop van de micropipet. Tijdens het aandrijven van de piëzo-aandrijfeenheid (ongeveer 5 keer per eicel), beweegt u de micropipet om de punctie uit te voeren zonder vervorming van de zona pellucida. Wanneer de punt van de micropipet de binnenste laag van de zona pellucida bereikt en vervolgens het uitgeholde stuk van de zona pellucida volledig in de micropipet wordt opgezogen, is de doorboring van de zona pellucida voltooid.
2. Verwijder het uitgeholde stuk van de zona pellucida uit de micropipet en verplaats tegelijkertijd het sperma naar de kop van de micropipet. Duw de micropipet naar binnen en rek het cytoplasmatische membraan uit tot ongeveer 90% van de eiceldiameter.
3. Als het voldoende is uitgerekt, start u de piëzo-aandrijving één keer om het membraan te scheuren. Membraanbreuk is voltooid wanneer wordt bevestigd dat het membraan is teruggekaatst.
4. Injecteer na membraanbreuk de kop van het sperma in de eicel. Nadat de kop van het sperma zeker in het cytoplasma is geïnjecteerd, moet u erop letten geen onnodige vloeistof toe te voegen.

4. Piëzo-ICSI-operatie (een eicel met een membraan dat weinig rekt)

LET OP: We leggen uit hoe om te gaan met een eicel met een membraan met een weinig rekbaar vermogen dat spontaan kan scheuren tijdens het rekken.

1. Voer dezelfde actie uit als de eicel met een membraan met een hoog rekvermogen tot het punt waarop het cytoplasmatische membraan wordt uitgerekt.
2. Als het membraan tijdens de actie spontaan scheurt, injecteer dan de kop van het sperma vanuit de positie van de micropipet zonder deze verder naar voren te duwen om degeneratie van eicellen na sperma-injectie te voorkomen.
3. Nadat de kop van het sperma zeker in het cytoplasma is geïnjecteerd, moet u erop letten geen onnodige vloeistof toe te voegen.

Resultaten

De hierboven beschreven conventionele ICSI en piëzo-ICSI werden uitgevoerd op 10.488 rijpe eicellen (1.744 cycli) door 4 embryologen. Hiervan werden tussen januari 2013 en september 2016 3.522 eicellen (587 cycli) geïnsemineerd door conventioneel-ICSI en 6.966 eicellen (1.157 cycli) werden geïnsemineerd door piëzo-ICSI tussen oktober 2016 en december 2020 in het Kameda Medical Center. Tabel 1 toont de gemiddelde leeftijd van de vrouwen, de bevruchtingspercentages, de overlevingspercentages, de degeneratiepercentages, de blastocystpercentages op dag 5 en het gemiddelde aantal gecryopreserveerde blastocysten per cycli van conventioneel-ICSI en piëzo-ICSI. Hoewel de gemiddelde leeftijd van piëzo-ICSI bij vrouwen hoger was in vergelijking met die van conventioneel-ICSI, waren de bevruchtings-, overlevings- en blastocystsnelheden en het gemiddelde aantal gecryopreserveerde blastocysten per cycli van piëzo-ICSI significant hoger in vergelijking met die van conventioneel-ICSI (Tabel 2).

Figuur 1: ICSI-schaal gebruikt voor piëzo-ICSI. De lay-out van de microdruppels wordt hier beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Studeren	conventioneel-ICSI	piëzo-ICSI
Yanagida et al. (1999)	66%een	79%miljard
Takeuchi et al. (2001)	83%a	90%b
Hiraoka et al. (2015)	68%een	89%miljard
Furuhashi et al. (2019)	64%een	75%miljard
Fujii et al. (2020)	71%een	84%miljard
ab<0.05 in dezelfde lijn

Tabel 1: Vergelijking van de bevruchtingssnelheden tussen conventionele ICSI en piëzo-ICSI. In alle rapporten werden significant hogere bevruchtingspercentages waargenomen in de piëzo-ICSI in vergelijking met die van de conventionele-ICSI.

	conventioneel-ICSI	piëzo-ICSI	P
Gemiddelde leeftijd van vrouwen	38,6 ± 0,2	39,2 ± 0,2	<0,05
Nee. van cycli	587	1,157	-
Nee. van eicellen	3,522	6,966	-
Nee. van de bemesting (%)	2,352 (66.8)	5,411 (77.7)	<0,01 Zoekertjes
Nee. van overleving (%)	3,303 (93.8)	6,767 (97.1)	<0,01 Zoekertjes
Nee. van degeneratie (%)	219 (6.2)	199 (2.9)	<0,01 Zoekertjes
Nee. van blastocyst (%)	915 (38.9)	2,787 (51.5)	<0,01 Zoekertjes
Gemiddeld aantal. van gecryopreserveerde blastocysten per cyclus	3,8 ± 0,2	5,1 ± 0,2	<0,01 Zoekertjes

Tabel 2: Klinische resultaten van Kameda Medical Center waarin de werkzaamheid van conventioneel-ICSI en piëzo-ICSI wordt vergeleken. In alle vergelijkingsitems werden significant betere resultaten waargenomen in de piëzo-ICSI in vergelijking met die van de conventionele-ICSI.

Discussie

De resultaten toonden aan dat de bevruchtingspercentages, de overlevingspercentages, de blastocystpercentages op dag 5 en het gemiddelde aantal gecryopreserveerde blastocysten van de piëzo-ICSI significant hoger waren in vergelijking met die van conventionele-ICSI.

Er zijn 2 kritieke stappen in het piëzo-ICSI-protocol. De eerste stap is het stevig draaien van de houderdop van de pipethouder. De tweede stap is om het aangezogen PVP-volume in de micropipet minder dan 300 micrometer te houden. Het losjes draaien van de houderdop van de micropipethouder en het opzuigen van PVP in de micropipet van meer dan 300 micrometer (een volledige lengte van het sperma is ongeveer 60 micrometer) veroorzaakt problemen bij de immobilisatie van het sperma, het openen van de zona en het breken van het membraan vanwege het afnemende piëzovermogen. In het bijzonder moeten we tijdens de procedure altijd letten op het aangezogen PVP-volume in de micropipet. Dit is de beperking van de piëzo-ICSI.

Het is essentieel om een kleine hoeveelheid zware vloeistof als operatievloeistof in de micropipet te plaatsen om de piëzo-kracht te creëren. In de vorige rapporten werd kwik gebruikt als operatievloeistof ^2,3,4. Een vloeistof op basis van fluorkoolstof kan echter worden gebruikt in plaats van kwik voor veilig gebruik in plaats van 5,6,7,8,9,11. De vloeistof op basis van fluorkoolstof heeft een soortelijk gewicht van 1,8 en is kleurloos, transparant en niet oplosbaar in water. De operatievloeistof heeft direct contact met de PVP die het sperma vasthoudt. De blootstelling van de PVP aan de operatievloeistof kan enkele negatieve effecten hebben op het sperma of de eicel. De snelheid van bevruchting, overleving en blastocyst op dag 5 van piëzo-ICSI was echter significant hoger in vergelijking met die van conventioneel-ICSI in de huidige studie. Wij zijn van mening dat het risico van het directe contact tussen de operatievloeistof en de PVP vrij laag is.

Eerder hebben we de tijd van het micropipetpreparaat gemeten met een olie-injector en een luchtinjector. De gemiddelde tijden voor de voorbereiding van de olie-injector en de luchtinjector met micropipetten waren respectievelijk 233 en 106 seconden (P < 0,05)⁸. De voorbereidingstijd van de micropipet met de luchtinjector is korter omdat deze olievrij is. De aanwezigheid van de olie verlengt de bereidingstijd van de micropipet vanwege de plakkerigheid. Als er luchtbellen in het oliegebied in de micropipet terechtkomen nadat de micropipet in de pipethouder is gestoken, moet de pipet worden weggegooid omdat de piëzo-ICSI niet werkt. We hebben ook het aantal verspilde micropipetten geteld tijdens de voorbereiding van de micropipetten. Het gemiddelde aantal verspilde micropipetten per patiënt voor de olie-injector en de luchtinjector was respectievelijk 0,28 ± 0,56 en 0 ± 0 (P < 0,05),^8. Er was echter geen significant verschil tussen de olie- en luchtinjectoren in de overlevingspercentages (99% en 99%), bevruchting (89% en 90%) en dag 3-embryo's van goede kwaliteit (61% en 61%) na piëzo-ICSI⁸. We verspilden 3,2 uur en 25 micropipetten extra in de olie-injectorgroep (90 patiënten) in vergelijking met de luchtinjectorgroep (90 patiënten) tijdens studie⁸. De resultaten geven aan dat het gebruik van een luchtinjector in plaats van een olie-injector een goede aanpassing is van piëzo-ICSI.

De piëzo-ICSI kan het membraan semi-automatisch breken zonder cytoplasmatische aspiratie in de micropipet. Deze membraanbreukprocedure is stabiel en gemakkelijk. De piëzo-ICSI zou ook kunnen bijdragen aan het verkorten van de ICSI-trainingsperiode. We hebben eerder het effect van de piëzo-ICSI op de overlevingskansen, bevruchting en blastocyst voor een jonge embryoloog beoordeeld. De jonge embryoloog kreeg 30 keer piëzo-ICSI-praktijk voordat hij met de klinische ICSI-behandeling begon. We vergeleken de overleving, bevruchting en blastocystpercentages van jonge en oudere embryologen voor hun 1e 100 eicellen. De overlevings-, bevruchtings- en blastocystpercentages van de jonge en senior embryologen waren respectievelijk 100% en 97%, 87% en 91%, 47% en 57%⁹. Er was geen significant verschil tussen de jonge en de senior embryologen in alle vergelijkingsitems. Deze resultaten gaven aan dat de piëzo-ICSI van betekenis is in de membraanbreukprocedure die kan bijdragen aan het verkorten van de ICSI-trainingsperiode van een jonge embryoloog.

Sommige onderzoekers rapporteerden de klinische efficiëntie van intracytoplasmatische morfologisch geselecteerde sperma-injectie (IMSI). Setti et al. vergeleken de klinische resultaten tussen ICSI en IMSI in een meta-analyse studie¹⁰. Er was geen significant verschil in de bevruchtingspercentages tussen de ICSI- en IMSI-groepen¹⁰. Het embryopercentage van topkwaliteit van de IMSI-groep was echter significant hoger in vergelijking met dat van de ICSI-groep¹⁰. Voor zover wij weten, heeft geen enkele studie de impact van IMSI in combinatie met piëzo-ICSI op bevruchting en embryonale ontwikkeling onderzocht. We hebben retrospectief de effecten onderzocht van vergroting van spermaselectie (400x vs. 1.200x) op bevruchting en embryo-ontwikkeling in piëzo-ICSI. De bevruchtingssnelheid van de 1.200x groep (92%) was significant hoger in vergelijking met die van de 400x groep (77%) (P = 0,0002)¹¹. Het embryopercentage van goede kwaliteit op dag 3 van de 1.200x-groep (64%) was significant hoger in vergelijking met dat van de 400x-groep (46%) (P = 0,0021)¹¹. We hebben geprobeerd het sperma te selecteren zonder vacuolen in de kop van het sperma onder een vergroting van 1.200x. Deze procedure kan het sperma selecteren met een lagere mate van sperma-DNA-fragmentatie¹². Daarom kan de IMSI een nieuwe toepassing van piëzo-ICSI zijn.

Hier hebben we een protocol voor piëzo-ICSI beschreven dat ICSI-resultaten kan verbeteren zonder levensvatbare eicellen in menselijke ART te missen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Air injector	NARISHIGE CORPORATION	IM-12
Piezo drive unit	PRIME TECH Ltd.	PMM4GD
Micropipette	PRIME TECH Ltd.	PINU06-20FT
Operation liquid	3M	3M™ Noveck™
PVP 7% Ready-to-Use solution	Cooper Surgical Inc.	ART-4005-A
Buffered medium	Vitrolife	G-MOPS PLUS
Glass Bottom Dish	NIPRO	87-453
Inverted microscope	OLYMPUS CORPORATION	IX-73