Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Astrocyten behoren tot de meest overvloedige celtypen in het volwassen brein, waar ze belangrijke rollen spelen in een veelheid van functies. Als een centrale speler in de hersenen homeostase, astrocyten leveren neuronen met vitale metabolieten en buffer extracellulaire water, ionen, en glutamaat. Een integraal onderdeel van de "Tri-partite" Synapse, astrocyten zijn ook kritisch in de vorming, snoeien, onderhoud, en modulatie van synapsen. Om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling en met andere gliacellen, neuronen, de hersen-vasculatuur en de extracellulaire omgeving door een veelheid aan gespecialiseerde membraan eiwitten die cel bevatten adhesiemoleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporters, en gap-junction moleculen. Ter ondersteuning van deze dynamische flux, zijn astrocyten, net als neuronen, afhankelijk van strak gecoördineerd en efficiënt intracellulair transport. In tegenstelling tot neuronen, waar intracellulaire handel uitgebreid is afgebakend, is het op microtubulus gebaseerde transport in astrocyten minder bestudeerd. Niettemin, Exo-en endocytaire handel in celmembraan eiwitten en intracellulaire organel transport regelt de normale biologie van astrocyten, en deze processen worden vaak aangetast door ziekte of als reactie op letsel. Hier presenteren we een eenvoudig protocol om hoge kwaliteit Murine astrocyten te kweken, om astrocytische eiwitten en organellen van belang fluorescentisch te labelen en om hun intracellulaire transport dynamiek op te nemen met behulp van time-lapse confocale microscopie. We laten ook zien hoe relevante transport parameters uit de gekochte films kunnen worden uitgepakt en gekwantificeren met behulp van de beschikbare software voorbeeld analyse (d.w.z. ImageJ/FIJI) plugins.
Inleiding
Astrocyten zijn de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel van de volwassene, waar ze unieke ontwikkelings-en homeostatische functies uitvoeren1. Astrocyten moduleren synaptische ontwikkeling door direct contact met pre-en postsynaptisch terminals als onderdeel van de Tri-partite Synapse, die bevat neurotransmitter receptoren, transporters, en celadhesie moleculen die Synapse vorming vergemakkelijken en neuron-astrocyten communicatie2. Bovendien, astrocyten actief controle synaptische transmissie en voorkomen neuronale excitotoxicity door het snel verwijderen van excitatory neurotransmitters uit de synaptis....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dier procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Universiteit van North Carolina bij Chapel Hill Animal Care and use Committee (IACUC).
1. hersen dissectie en cultuur van primaire muis astrocyten
Opmerking: het volgende protocol is aangepast aan de gepubliceerde methoden, die de oorspronkelijke procedure volgt die is ontwikkeld door McCarthy en devellis13,14,15. Gemengde celculturen van McCarthy/deVellis (MD) astrocyten worden bereid uit postnatale dag 2 − 4 (P2 − P4) muis cortices, behandeld met een anti-m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het protocol voor het instellen van de hierboven beschreven primaire muis-MD-astrocyten moet reproduceerbare, kwalitatief hoogstaande culturen opleveren. Hoewel culturen in eerste instantie een mengsel van astrocyten, fibroblasten en andere gliacellen bevatten, waaronder Microglia en oligodendrocyten (Figuur 1bi, BIV; rode pijlpunten), wordt de toevoeging van araC aan de gemengde cultuur tussen DIV5-DIV7 geminimaliseerd de proliferatie van deze contaminerende cellen. De geco.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een experimentele aanpak om fluorescently gelabelde organellen en membraan eiwitten van belang te uiten, visualiseren en volgen met behulp van time-lapse video microscopie in hoge zuiverheid primaire muis corticale MD astrocyten. We schetsen ook een methodologie voor het meten van de deeltjes dynamiek. Directe visualisatie van eiwitten en organel dynamica in primaire astrocyten biedt een krachtig hulpmiddel om de regulering van intracellulair transport in deze cellen in vitro te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
DNL werd gesteund door de University of North Carolina op Chapel Hill (UNC) school of Medicine als Simmons-geleerde. TWR werd ondersteund door UNC PREP Grant R25 GM089569. Werk met behulp van de UNC Neuroscience Center microscopie kern faciliteit werd ondersteund, gedeeltelijk, door financiering van de NIH-NINDS Neuroscience Center ondersteuning Grant P30 NS045892 en de NIH-NICHD intellectuele en ontwikkelingsstoornissen Research Center ondersteuning subsidie U54 HD079124.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230, orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
Referenties
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
