Solid phase 11C-methylering, zuivering en formulering voor de productie van Pet-tracers

Summary

We rapporteren een efficiënte Carbon-11 radiolabeling-techniek om klinisch relevante tracers te produceren voor positron emissie tomografie (PET) met behulp van Solid phase-extractie cartridges. ¹¹ C-methylating agent wordt doorgegeven via een patroon vooraf geladen met precursor en opeenvolgende elutie met waterige ethanol biedt chemisch en radiochemisch zuivere PET tracers in hoge radiochemische opbrengsten.

Abstract

Routine matige productie van radiotracers gebruikt in positron emissie tomografie (PET) meestal vertrouwt op natte chemie waar de radioactieve synthon reageert met een niet-radioactieve precursor in oplossing. Deze aanpak vereist zuivering van de Tracer door hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), gevolgd door herformulering in een biocompatibel oplosmiddel voor menselijke toediening. We hebben onlangs een roman ontwikkeld ¹¹C-Methylation aanpak voor de zeer efficiënte synthese van koolstof-11 GELABELDE huisdier radiofarmaca, gebruik te maken van Solid phase cartridges als wegwerp "3-in-1" eenheden voor de synthese, zuivering en herformulering van de tracers. Deze aanpak voorkomt het gebruik van preparatieve HPLC en vermindert de verliezen van de Tracer in Transfer lijnen en als gevolg van radioactief verval. Bovendien verbetert de cartridge-gebaseerde techniek de betrouwbaarheid van de synthese, vereenvoudigt het automatiseringsproces en vergemakkelijkt het de naleving van de Good Manufacturing Practices (GMP) vereisten. Hier demonstreren we deze techniek op het voorbeeld van de productie van een PET Tracer Pittsburgh compound B ([¹¹C] PIB), een gouden standaard in vivo imaging agent voor amyloïde plaques in de menselijke hersenen.

Introduction

Positron emissie tomografie (PET) is een moleculaire beeldvormings modaliteit die berust op het opsporen van het radioactieve verval van een isotoop die is gekoppeld aan een biologisch actief molecuul om de in vivo visualisatie van biochemische processen, signalen en transformaties mogelijk te maken . Koolstof-11 (t_1/2 = 20,3 min) is een van de meest gebruikte radio-isotopen in pet vanwege zijn overvloed aan organische moleculen en korte halfwaardetijd die meerdere Tracer administraties op dezelfde dag mogelijk maakt met hetzelfde menselijke of dierlijke onderwerp en vermindert de Stralingsbelasting van de patiënten. Veel tracers gelabeld met deze isotoop worden gebruikt in klinische studies en in fundamenteel gezondheidsonderzoek voor in vivo PET-beeldvorming van klassieke en opkomende biologisch relevante doelen-[¹¹c] Raclopride voor d₂/d₃ -receptoren, [¹¹c] PiB voor amyloïde plaques, [¹¹C] PBR28 voor trans Locator eiwit-om er maar een paar te noemen.

Koolstof-11 gelabelde PET tracers worden voornamelijk geproduceerd via ¹¹C-methylatie van niet-radioactieve PRECURSOREN bevattende-Oh (alcohol, fenol en carbonzuur),-NH (amine en amide) of-sh (thiol) groepen. Kort, de isotoop wordt gegenereerd in de gasdoelstelling van een cyclotron via een ¹⁴N (p, α)¹¹c nucleaire reactie in de chemische vorm van [¹¹c] co₂. Deze laatste wordt vervolgens omgezet in [¹¹c] methyljodide ([¹¹c] ch₃I) via ofwel natte chemie (reductie tot [¹¹c] ch₃Oh met LiAlH₄ gevolgd door afschrikken met Hi)¹ of droog Scheikunde (katalytische reductie tot [¹¹C] ch₄ gevolgd door radicale iodinatie met moleculaire I₂)². [¹¹C] CH₃ik kan dan verder worden omgezet naar de meer reactieve ¹¹c-methyl triflaat ([¹¹c] ch₃otf) door het over een zilveren triflaat kolom³. De ¹¹C-Methylation wordt vervolgens uitgevoerd door ofwel het borrelen van het radioactieve gas in een oplossing van niet-radioactieve precursor in organisch oplosmiddel of via de meer elegante Captive solvent "lus" methode^4,5. De ¹¹C-Tracer wordt vervolgens gezuiverd door middel van HPLC, geherformuleerd in een biocompatibel oplosmiddel, en doorgegeven via een steriel filter voordat het aan menselijke proefpersonen wordt toegediend. Al deze manipulaties moeten snel en betrouwbaar zijn gezien de korte halfwaardetijd van Carbon-11. Het gebruik van een HPLC-systeem verhoogt echter aanzienlijk de verliezen van de Tracer en de productietijd, vereist vaak het gebruik van giftige oplosmiddelen, bemoeilijkt de automatisering en leidt af en toe tot mislukte syntheses. Bovendien verlengt de vereiste reiniging van de reactoren en de HPLC-kolom de vertragingen tussen de syntheses van volgende Tracer batches en verhoogt het de blootstelling van personeel aan straling.

De radiochemie van fluor-18 (t_1/2 = 109,7 min), de andere veelgebruikte Pet-isotoop, is onlangs gevorderd via de ontwikkeling van cassette-gebaseerde Kits die de noodzaak voor HPLC-zuivering overbodig maken. Door gebruik te maken van Solid phase extraction (SPE) cartridges, bieden deze volledig wegwerp kits de betrouwbare routine productie van ¹⁸f-tracers, waaronder [¹⁸f] FDG, [¹⁸f] FMISO, [¹⁸f] FMC en anderen, met kortere synthese minder betrokkenheid van het personeel en minimaal onderhoud van de apparatuur. Een van de redenen waarom Carbon-11 nog steeds een minder populaire isotoop in PET Imaging is, is een gebrek aan soortgelijke Kits voor de routine productie van ¹¹C-tracers. Hun ontwikkeling zou de synthetische betrouwbaarheid aanzienlijk verbeteren, de radiochemische opbrengsten verhogen en de automatisering en het preventieve onderhoud van de productie modules vereenvoudigen.

Momenteel beschikbare productie kits profiteren van goedkope, wegwerp-, SPE-cartridges in plaats van HPLC-kolommen voor de scheiding van de radio Tracer van niet-gereageerd radioactieve isotoop, precursor en andere radioactieve en niet-radioactieve bijproducten. Idealiter gaat de radiolabeling-reactie ook op dezelfde cartridge voort; bijvoorbeeld, de [¹⁸f] fluoromethylatie van Dimethylaminoethanol met gasvormige [¹⁸f] ch₂BRF in de productie van prostaatkanker Imaging Pet Tracer [¹⁸f] fluoromethylcholine treedt op een kation-uitwisseling hars cartridge ⁶. hoewel soortgelijke procedures voor het radiolabeling van verschillende ¹¹c-tracers op cartridges zijn gemeld^7,8 en werd bijzonder krachtig voor de radio synthese van [¹¹c] choline⁹ en [¹¹C] methionine¹⁰, deze voorbeelden blijven beperkt tot oncologische Pet-tracers waar de scheiding van de precursor vaak niet nodig is. Onlangs rapporteerden we de ontwikkeling van "^[11c] kits" voor de productie van^[11c] ch₃I¹¹ en daaropvolgende ¹¹c-methylatie, evenals een solide fase-ondersteunde synthese¹² in onze inspanningen om Vereenvoudig de routine productie van ¹¹C-tracers. Hier willen we onze vooruitgang demonstreren met behulp van het voorbeeld van de vaste fase ondersteunde radio synthese van [¹¹C] PIB, een radio Tracer voor Aβ-beeldvorming die een revolutie teweeggebracht in het gebied van de ziekte van Alzheimer (AD) Imaging toen het voor het eerst werd ontwikkeld in 2003 ( Figuur 1) ^13,14. Bij deze methode wordt vluchtige [¹¹C] ch₃otf (BP 100 °c) over 6-Oh-BTA-0-precursor afgezet op de hars van een wegwerp cartridge. PET Tracer [¹¹C] PIB wordt vervolgens gescheiden van de precursor en radioactieve onzuiverheden door elutie uit de patroon met biocompatibele waterige ethanol. Verder hebben we deze methode van [¹¹C] PIB radiosynthese geautomatiseerd met behulp van een op afstand bediende radiochemie synthese module en wegwerp cassette Kits. Specifiek, we implementeerden deze radio synthese op een 20-Valve radiochemie module, uitgerust met spuit aandrijving (dispenser) die geschikt is voor standaard 20 mL wegwerp plastic spuit, gasstroom controller, vacuümpomp en gauge. Vanwege de eenvoud van deze methode, zijn we ervan overtuigd dat het kan worden aangepast aan de meeste commercieel verkrijgbare geautomatiseerde synthesizers, ofwel cassette-based of die uitgerust met stationaire kleppen. Deze solide fase ondersteunde techniek vergemakkelijkt [¹¹C] PIB productie voldoet aan goede Manufacturing Practice (GMP) regelgeving en verbetert de betrouwbaarheid van de synthese. De hier beschreven techniek vermindert ook de hoeveelheid precursor die nodig is voor radio synthese, gebruikt alleen "groene" biocompatibele oplosmiddelen en verlaagt de tijd tussen opeenvolgende productie batches.

Protocol

1. voorbereiding van buffers en eluents

1. Los 2,72 g natriumacetaattrihydraat op in 100 mL water om 0,2 M natriumacetaatoplossing (oplossing A) te bereiden.
2. Los 11,4 mL ijsazijn in 1 liter water op om 0,2 M azijnzuur oplossing te bereiden (oplossing B).
3. Combineer 50 mL oplossing A met 450 mL oplossing B om de acetaatbuffer voor te bereiden op pH 3,7 (buffer 1) volgens het buffer referentiecentrum¹⁵. Controleer de pH van de buffer met pH-strips of een pH-meter.
4. Combineer 12,5 mL absolute ethanol met 87,5 mL buffer 1 om 12,5% waterige EtOH-oplossing (Wash 1) te maken in een 100 mL fles.
5. Combineer 15 mL absolute ethanol met 85 mL buffer 1 om 15% waterige EtOH-oplossing (Wash 2) te maken in een fles van 100 mL.
6. Combineer 5 mL absolute ethanol met 5 mL buffer 1 om 50% waterige EtOH oplossing (uiteindelijke eluent) te maken en trek 2,5 mL van deze oplossing in een 10 mL spuit.

2. toepassing van de voorloper op de patroon

1. Laat 10 mL water passeren, gevolgd door 5 mL aceton door de tC18 patroon, om dit te voorkomen.
2. Droog de patroon met een stroom van stikstof bij 50 mL/min gedurende 1 min.
3. Los 2 mg van de precursor 6-OH-BTA-0 op in 1 mL watervrij aceton.
4. Houd een Luer-Tip 250 μL precisie glazen spuit naar beneden, zuig 100 μL van de precursor oplossing en 50 μL luchtkussen bovenop de vloeistof. Verwijder de naald en breng de precursor oplossing op de tC18 cartridge aan vanaf het vrouwelijke uiteinde door de zuiger langzaam helemaal naar beneden te duwen. Duw de oplossing niet verder!

3. de variëteit instellen voor geautomatiseerde synthese

1. Beveilig het standaard wegwerp spruitstuk van 5 poorten op de synthese module en monteer het volgens de Figuur 2 en de stappen 3,2-3,5 hieronder.
   Opmerking: we raden aan om aceton bestendige variëteiten te gebruiken (Zie tabel met materialen).
2. Poort 1 heeft twee posities. Sluit de horizontale inlaat aan op de automatische dispenser met een spuit van 20 mL. Sluit de verticale inlaat aan op de fles met Wash 1.
3. Verbind de uitgang van de module die [¹¹C] ch₃otf produceert naar poort 2 van de variëteit.
4. Installeer de tC18 cartridge geladen met precursor 6-OH-BTA-0 tussen de poorten 3 en 4.
5. Poort 5 heeft twee posities. Sluit het horizontale stopcontact aan op de afval fles die ten minste 200 mL moet vasthouden. Sluit de verticale uitlaatklep aan op de steriele injectieflacon voor Tracer inzameling via het steriele filter.

4. radio synthese van [¹¹C] PIB

Let op: alle manipulaties met betrekking tot radioactieve isotopen moeten worden uitgevoerd in een door een lood afgeschermde Hot Cell door personeel met adequate training om te werken met radioactieve materialen.
Opmerking: dit protocol heeft geen betrekking op de details van de productie van [¹¹c] co₂ in de cyclotron en de omzetting ervan in [¹¹c] ch₃otf met behulp van de radiochemie module. Deze procedures zullen afhangen van de individuele uitrusting van het radiochemie laboratorium en vallen buiten het toepassingsgebied van dit protocol. Ons huisdieren centrum is uitgerust met een IBA cyclotron, die koolstof-11 produceert in de chemische vorm van [¹¹c] co₂via de ¹⁴N (p, α)¹¹c kernreactie met een N₂/o₂ gasmengsel (99,5:0,5) in het gas doel en een in de handel verkrijgbare module voor de productie van [¹¹c] ch₃I via de "droge methode" (katalytische reductie tot [¹¹C] ch₄ , gevolgd door radicale iodinatie). [¹¹C] CH₃otf wordt geproduceerd door het passeren van [¹¹C] l₃I over een zilveren triflaat kolom verhit tot 175 ° c bij 20 ml/min.

1. Lever [¹¹c] ch₃otf in de variëteit via poort 2 en geef deze door de geladen tC18 cartridge met een uitgangsstroom van 20 ml/min, gereguleerd door de [¹¹c] ch₃otf-module, via de poorten 3 en 4 en in de afval fles zoals weergegeven op Figuur 2A.
2. Zodra alle radioactiviteit is overgebracht en gevangen op de tC18-cartridge, zoals bewaakt door de radioactiviteitsdetector achter de cartridge houder, stopt u de gasstroom door poort 2 te sluiten. Laat de patroon 2 minuten zitten om de reactie te voltooien.
3. Trek 19 mL Wash 1-oplossing (zie stap 1,4) uit de flacon van 100 mL in de doseerspuit via poort 1 op 100 mL/min zoals afgebeeld op Figuur 2B.
4. Verdeel 18,5 mL Wash 1-oplossing van de dispenser via de tC18-cartridge via de poorten 3 en 4 en in de afval fles van 50 ml/min, zoals afgebeeld op Figuur 2C. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de variëteit zijn, omdat ze de scheidingsefficiëntie kunnen verminderen.
5. Herhaal de stappen 4,3 en 4,4 vier keer, waarbij u elke keer 18,5 mL Wash 1-oplossing intrekt en uittrekt. Het totale volume van Wash 1 oplossing doorgegeven via tC18 is 92,5 mL; echter, het kan variëren binnen de 90-100 mL bereik afhankelijk van de specifieke synthese module gebruikt.
6. Zet de ingangs lijn op poort 1 van Wash 1 naar Wash 2 oplossing (zie stap 1,5).
7. Herhaal de stappen 4,3 en 4,4 driemaal, waarbij u elke keer 18,5 mL Wash 2-oplossing intrekt en uittrekt. Het totale volume van Wash 2 oplossing doorgegeven via tC18 is 55,5 mL. Echter, het kan variëren binnen de 50-60 mL bereik afhankelijk van de specifieke synthese module gebruikt.
8. Schakelklep 5 naar de laatste injectieflacon zoals afgebeeld op Figuur 2D. Koppel de lijn los van de dispenser en sluit deze aan op de spuit van 10 ml met 2,5 ml van de laatste eluens oplossing (50% waterige EtOH, zie stap 1,6) en 7,5 ml lucht.
9. Houd de spuit naar beneden, duw handmatig de laatste eluens oplossing (2,5 ml), gevolgd door lucht (7,5 ml) via de tC18-patroon via de poorten 3 en 4 en in de steriele injectieflacon voor Tracer inzameling via het steriele filter, zoals afgebeeld op de afbeelding 2quinquies.
10. Koppel de lege spuit los, sluit de spuit van 10 mL met 10 mL van de steriele fosfaatbuffer aan (recept niet inbegrepen zoals het kan variëren) en duw het volledige volume door de tC18-patroon in de steriele injectieflacon zoals hierboven beschreven (Figuur 2D ). Koppel de spuit los en spoel de lijn met 10 mL lucht met dezelfde spuit.
11. Zuig 0,7 mL van de definitieve Tracer formulering op en verzamelmonsters voor kwaliteitscontroleprocedures (0,1 mL), bacteriële endotoxine test (0,1 mL) en steriliteit (0,5 mL).

5. procedures voor kwaliteitscontrole

Let op: elke partij van de radio Tracer moet worden onderworpen aan de passende kwaliteitscontroleprocedures (QC) voordat deze op de site voor huisdieren worden vrijgegeven voor toediening aan mensen of dieren. De auteurs van dit manuscript zijn niet verantwoordelijk voor de conformiteit van de radio Tracer die in andere centra met de lokale gezondheidsautoriteit is geproduceerd.

1. Voer pre-release QC-procedures uit, die tests moeten omvatten voor radiochemische identiteit (RCI), radiochemische zuiverheid (RCP), chemische zuiverheid en molaire activiteit van de Tracer, evenals het resterende oplosmiddelgehalte en de pH van de formulering.
2. Bepaal de RCI, RCP, chemische zuiverheid en molaire activiteit door middel van een analytisch HPLC-systeem dat is uitgerust met UV (bewaking bij 350 nm) en radioactiviteit detectoren, en een omgekeerde fase kolom. Bepaal de retentietijden van 6-OH-BTA-0 en 6-OH-BTA-1 en Kalibreer het instrument om de inhoud van elke stof te kwantificeren.
3. Bepaal het residueel oplosmiddelgehalte door middel van een analytisch gaschromatografisch systeem dat is uitgerust met een capillaire kolom. Bepaal de retentietijden van aceton en ethanol en Kalibreer het instrument om de inhoud van elk oplosmiddel te kwantificeren.
4. Voer de bacteriële endotoxine test uit met een cartridge lezer die is uitgerust met geschikte cartridges.
5. Voer de Steriliteits analyse van het monster ten minste 14 dagen na de synthese uit om de afwezigheid van bacteriële groei te waarborgen of het Steriliteits monster naar een door de lokale gezondheidsautoriteit geaccrediteerd laboratorium te zenden.

Results

Om een typische radio synthese van [¹¹c] PIB samen te vatten, wordt gasvormige [¹¹c] ch₃otf voor het eerst doorgegeven via een tC18-cartridge die vooraf is geladen met een oplossing van precursor (Figuur 1). De scheiding van het reactiemengsel wordt vervolgens bereikt door opeenvolgende elutie met waterige ethanol oplossingen als volgt. Ten eerste, 12,5% EtOH kolom de meerderheid van ongereageerde [¹¹c] ch₃

Discussion

Ondanks de recente opkomst en FDA-goedkeuring van verschillende ¹⁸F-GELABELDE Pet-tracers, zoals florbetapir, florbetaben en flutemetamol, blijft [¹¹C] PIB een gouden standaard Tracer voor amyloïde beeldvorming vanwege de snelle hersen opname en lage niet-specifieke Bindend. Momenteel wordt deze Tracer gesynthetiseerd via ofwel natte chemie¹⁶ ofwel met behulp van een "Dry loop" aanpak^4,17. Beide methoden vere...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OH-BTA-0	ABX advanced biochemical compounds	5101	Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1	ABX advanced biochemical compounds	5140	Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system	Agilent	Agilent 1200	Analytisch HPLC-systeem
Ethanol absoluut	Commerciële alcoholen	432526
Hamilton-spuit (luer-tip, 250 µL)	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	Analytische HPLC-kolom
Perkin Elmer Clarus 480 GC-systeem	Perkin Elmer	Clarus 480	Gaschromatograaf
Polycarbonaat-verdeelsysteem	Scintomics	ACC-101	Syntheseverdeelsysteem
Restek MTX-Wax-kolom (30 m, 0,53 mm)	Restek	70625-273	Analytische GC-kolom
Scintomics GRP-module	Scintomics	Scintomics GRP	Geautomatiseerde synthese-eenheid
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	Solid phase extractiecartridge
Oplosmiddelbestendig verdeelsysteem	Scintomics	ACC-201	Syntheseverdeelsysteem
Spinale naald	BD	405181
Steriele verlenglijn	B. Braun	8255059
Steriele filter	Millipore	SLLG013SL
Steriele flacon (20mL)	Huayi	SVV-20A
Sterieel water	Baxter	JF7623
Synthra MeIplus Research	Synthra	MeIplus Research	[11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Spuit (10 mL)	BD	309604
Spuit (1mL)	BD	309659
Spuit (20 mL)	B. Braun	4617207V	Dispenser-spuit
Ventfilter	Millipore	TEFG02525