Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever

Samenvatting

Vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) maakt snelle en efficiënte isolatie van celtypespecifieke vertalen mRNA. Hier demonstreren we een methode die hydrodynamische staart-ader injectie combineert in een muismodel van lever repopulatie en val om het uitdrukkings Profiel van het herbevolkende hepatocyten te onderzoeken.

Samenvatting

Lever repopulatie na letsel is een cruciaal kenmerk van zoogdieren die onmiddellijk orgaan falen en overlijden na blootstelling van milieu-toxines voorkomt. Een dieper begrip van de veranderingen in genexpressie die optreden tijdens de herbevolking kan helpen bij het identificeren van therapeutische doelen ter bevordering van het herstel van de leverfunctie bij het instellen van verwondingen. Niettemin, methoden om specifiek te isoleren van de herbevolkingende hepatocyten worden geremd door een gebrek aan celmarkeringen, beperkte celaantallen, en de kwetsbaarheid van deze cellen. De ontwikkeling van het vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) technologie in combinatie met de Fah^-/- Mouse model te even herbevolking in de setting van leverletsel maakt het mogelijk genexpressie profilering van de repopulatie hepatocyten. Met TRAP, Cell Type-specifieke vertalen mRNA is snel en efficiënt geïsoleerd. We ontwikkelden een methode die gebruik maakt van TRAP met affiniteit gebaseerde isolatie van het vertalen van mRNA van hepatocyten die selectief uitdrukken het groene fluorescerende eiwit (GFP)-tagged ribosomale eiwitten (RP), GFP: RPL10A. TRAP omzeilt de lange periode die nodig is voor het sorteren van fluorescentie-geactiveerde cellen die het genexpressie profiel kunnen veranderen. Bovendien, aangezien alleen de herbevolkende hepatocyten Express de GFP: RPL10A fusie-eiwit, de geïsoleerde mRNA is verstoken van besmetting van de omringende geblesseerde hepatocyten en andere celtypen in de lever. De affiniteits-gezuiverde mRNA is van hoge kwaliteit en maakt downstream PCR-of high-throughput sequencing-gebaseerde analyse van genexpressie mogelijk.

Inleiding

Als de belangrijkste metabole orgaan in gewervelde dieren, de lever is verantwoordelijk voor glucose homeostase, serumeiwit synthese, gal zuur secretie, en xenobiotische metabolisme en detoxificatie. De lever bezit een buitengewone capaciteit om het geblesseerde parenchym te regenereren bij blootstelling aan toxines om onmiddellijke leverfalen¹te voorkomen. Echter, falen van regeneratie kan optreden in de setting van paracetamol of alcohol overconsumptie, wat kan leiden tot acuut leverfalen². Bovendien, chronische leverschade veroorzaakt door virale hepatitis infectie, vette leverziekte, en Steatohepatitis kan leverfibrose veroorzaken, cirrose, en hepatocellulaire carcinoom³. De enige beschikbare curatieve behandeling voor eindstadium leverziekte is transplantatie, maar wordt beperkt door orgaan tekort, waardoor een efficiënte behandeling voor alle patiënten⁴. Een beter begrip van het herstelproces na toxische leverbeschadiging is daarom cruciaal voor de ontwikkeling van behandelingen om regeneratie te stimuleren die voldoende is om de functie in het zieke orgaan te redden.

Het meest breed toegepaste modelsysteem voor de studie van lever regeneratie is partiële hepatectomie bij knaagdieren, waarbij een groot deel van de lever wordt doorgeperfectioneerd om snelle hepatocyten uitbreiding⁵te stimuleren. Echter, partiële hepatectomie niet recapituleren hepatocyten expansie na toxische leverschade als gevolg van het gebrek aan immuuncel infiltratie en hepatocyten cel necrose vaak waargenomen in de setting van acute leverschade bij de mens⁶. Een geschikter systeem om deze vorm van orgel vernieuwing te modelleren is de Fah^-/- Mouse, die geen functionele fumarylacetoacetaat hydrolase (FAH) vereist voor een goede tyrosine metabolisme en ontwikkelt ernstige leverschade leidt tot de dood⁷. Deze muizen kunnen worden gehandhaafd in een gezonde toestand voor onbepaalde tijd door behandeling met de drug nitisinon in het drinkwater. Als alternatief kan Fah expressie worden hersteld door transgen levering aan een subset van hepatocyten, die zal uitbreiden naar de lever opnieuw bevolken op nitisinon verwijderen⁸.

Voor het profiel van de genetische expressie veranderingen van het herbevolgen van hepatocyten, een instrument om specifiek te isoleren repliceren hepatocyten in de Fah^-/- Mouse zonder besmetting van de naburige gewonde hepatocyten en andere celtypen is vereist. Helaas, fluorescentie-geassisteerde celsortering (FACS) van hepatocyten is moeilijk sinds (1) de kwetsbaarheid van het hervullen van hepatocyten leidt tot slecht herstel na lever perfusie, (2) replicerende hepatocyten zijn zeer variabel in grootte, waardoor isolatie van een zuivere populatie door FACS moeilijk, en (3) de procedure tijd van lever perfusie tot RNA-isolatie is groter dan 2 uur, vandaar dat genexpressie profielen aanzienlijke kunstmatige veranderingen kunnen ondergaan voordat monsters worden verworven⁹.

Als alternatief kan de uitdrukking van met epitope gelabelde ribosomen die specifiek zijn voor het hervullen van hepatocyten, de snelle isolatie van actief vertalen van mRNA gebonden door ribosomen met behulp van affiniteits zuivering onmiddellijk na orgaanoogst, met bulk lever weefsel lysaten. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van vertalen-ribosome affiniteits zuivering (TRAP)¹⁰ gevolgd door RNA-sequencing met hoge doorvoer (trap-SEQ), om specifiek mRNA te isoleren en te profiel bij het hervullen van hepatocyten in de Fah^-/- muis⁹. Coexpressie van groen fluorescerend eiwit-gelabeld ribosomaal eiwit (GFP: RPL10A) met FAH maakt affiniteits zuivering van het vertalen van mRNA gebonden door polysomes met GFP: RPL10A. Deze methode vermijdt elke celdissociatie stappen, zoals lever perfusie om fragiele repopulatie hepatocyten te isoleren. In plaats daarvan maakt het gebruik van Lysis van heel orgaanweefsel en antilichamen om snel het RNA specifiek uit de doelcellen te halen. Tot slot maakt het isoleren van overvloedige, kwalitatief hoogwaardige mRNA via TRAP-SEQ downstreamtoepassingen zoals sequentieanalyse mogelijk om de dynamische verandering van genexpressie tijdens het repopulatie proces te profiel.

Protocol

Alle methoden die betrekking hebben op het gebruik van muizen zijn consistent met de richtlijnen die door de IACUC van de Penn Office of Animal Welfare aan de Universiteit van Pennsylvania.

1. bereiding van het reagens

1. Haring
   1. Om 500 μl van 0,1 g/ml haring te maken, schorst u 50 mg haring in 500 μL methanol.
      Let op: Cycloheximide is zeer giftig voor het milieu en kan aangeboren misvorming veroorzaken. Alle afvalstoffen en buffers die haring bevatten, moeten worden ingezameld voor de juiste verwijdering.
      Opmerking: Cycloheximide kan maximaal 1 dag bij 4 °C worden bewaard. Cycloheximide remt de vertaling.
2. Dithiothreitol (DTT)
   1. Om 1 mL van 1 M DTT te maken, schorst u 0,15 g DTT poeder in RNase-vrij water.
      Let op: DTT kan irritatie van de huid, het oog en de luchtwegen veroorzaken.
      Opmerking: DTT is een reinigingsmiddel. DTT kan bij-20 °C worden bewaard. Het wordt aanbevolen om 1 M DTT op te slaan in aliquots voor eenmalig gebruik van 50 μL.
3. Deoxycholaat (DOC)
   1. Om 10% DOC te maken, onderbreek 1 g DOC in een conische buis van 50 mL en voeg RNase-vrij water tot 10 mL toe. Schud krachtig totdat het poeder is opgelost.
      Opmerking: De oplossing van 10% DOC is licht geel en kan tot 1 jaar bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard. DOC wordt gebruikt voor nucleaire lysis.
4. GFP-antilichamen
   1. Aliquot GFP-antilichamen bij gebruik voor de eerste keer. Snap bevriezen de aliquots en bewaren bij-80 °C.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen om 50 μg GFP-antilichamen op te slaan in aliquots voor eenmalig gebruik.
5. B biotinyleerd proteïne L
   1. Respendeer biotinyleerd proteïne L in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om de uiteindelijke concentratie 1 μg/μL te maken.
      Opmerking: De resuspendeerde oplossing kan maximaal 6 maanden bij-20 °C worden bewaard.

2. buffer voorbereiding

1. Boviene serumalbumine (BSA) buffer
   1. Om 50 mL 3% BSA-buffer te maken, voegt u 1,5 g IgG-en protease vrij BSA-poeder toe aan 40 mL PBS gevolgd door Vortex. Nadat de BSA is opgelost, voegt u PBS toe aan een eindvolume van 50 mL.
      Opmerking: De BSA-buffer kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
2. Dissectie buffer
   1. Om 50 mL dissectie buffervoorraad te maken, combineer 5 mL van de gebalanceerde zoutoplossing van 10x Hank (HBSS), 125 μL van 1 M 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur (HEPES), 1.750 μL van 1 M glucose en 200 μL van 1 M NaHCO₃. Voeg RNase-vrij water toe aan een eindvolume van 50 mL.
      Opmerking: De dissectie buffervoorraad kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
   2. Voeg onmiddellijk vóór gebruik 100 μg/ml 0,1 g/ml haring toe en blijf op ijs.
3. Hoog-zout buffer
   1. Voeg 1 mL 1 M HEPES, 8,75 mL van 2 M KCl, 500 μL van 1 M MgCl₂en 500 μL 100% nonylphenyl polyethyleenglycol (tabel met materialen) toe aan RNase-vrij water om 50 ml hoogzout buffervoorraad te maken.
      Opmerking: De hoog-zout buffer kolf kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
   2. Voeg onmiddellijk vóór gebruik 0,5 μL/mL van 1 M DTT en 1 μL/mL 0,1 g/mL Cycloheximide toe. Houd de verse hoogzout buffer op ijs.
4. Laag-zout buffer
   1. Voeg 1 mL 1 M HEPES, 3,75 mL van 2 M KCl, 500 μL van 1 M MgCl₂en 500 μL 100% nonylphenyl polyethyleenglycol toe aan 44,25 ml RNase-vrij water om 50 ml zoutlaag zout te maken.
      Opmerking: De laag-zout buffervoorraad kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
   2. Voeg vóór gebruik 0,5 μl/ml van 1 M DTT en 1 μL/ml 0,1 g/ml haring toe. Houd de verse laag-zout buffer op ijs.
5. Weefsel lysis buffer
   1. Om 50 mL weefsel lysisbuffer voorraad te maken, Combineer 1 mL van 1 M HEPES, 3,75 mL van 2 M KCl en 500 μL van 1 M MgCl₂. Voeg RNase-vrij water toe aan een finale van 50 mL.
      Opmerking: De dissectie buffervoorraad kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
   2. Voeg 1 Tablet/10 mL EDTA-vrije proteaseremmer toe, 1 μL/mL 0,1 g/mL Cycloheximide, 10 μL/mL RNase remmers, elk onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik. Bewaar de verse weefsellysisbuffer op ijs.

3. conjugatie van antilichamen tegen magnetische kralen

1. Antilichamen
   1. Bereken de hoeveelheid GFP-antilichamen die voor alle monsters nodig is en bereid een extra monster voor.
      Opmerking: Voor elk monster is 50 μg van elk GFP-antilichaam vereist.
   2. Dooi GFP antilichamen op ijs en spin op maximale snelheid (> 13000 x g) gedurende 10 minuten bij 4 °c en breng supernatanten over naar een nieuwe microcentrifuge buis.
      Opmerking: De voorbereidingsstap van het antilichaam kan voorafgaand aan de kraal voorbereiding worden uitgevoerd en de ontdooide antilichamen kunnen op ijs worden gehouden. Als alternatief kan dit deel worden uitgevoerd tijdens de incubatie van de magnetische kraal en biotinyleerd proteïne L.
2. Resuspend magnetische kralen
   1. Respendeer magnetische kralen (tabel met materialen) door voorzichtig pipetteren.
   2. Gebruik voor elk monster 150 μL magnetische kraal. Bereken het volume van de magnetische kraal vereist voor alle monsters en bereiden een extra. Breng de geresuspendeerde magnetische kralen over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL of 2 mL. Als er meer dan 1 mL is vereist voor een experiment, splitst u het totaalbedrag op in gelijke volumes.
   3. Verzamel kralen op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Verwijder de microcentrifuge buis van de magnetische standaard en voeg 1 mL PBS toe, gevolgd door pipetteren op en neer om de kralen te wassen. Verzamel kralen op een magnetische standaard voor > 1 min en verwijder PBS.
3. Bereiding van eiwit L-gecoate kralen
   1. Gebruik voor elk monster 60 μL biotinyleerd proteïne L. Als proteïne L eerder is geresuspendeerd en opgeslagen bij-20 °C, ontdooit u proteïne L op ijs. Als proteïne L vóór gebruik opnieuw wordt opgehangen, neem dan het benodigde bedrag voor alle monsters en bereid een extra voor.
   2. Voeg het berekende volume biotinyleerd proteïne L toe aan de geresuspendeerde en gewassen magnetische kralen. Voeg 1x PBS toe om het laatste volume 1 mL te maken bij gebruik van een micro centrifugebuis van 1,5 mL of 1,5 mL bij gebruik van een micro centrifugebuis van 2 mL. Inbroed magnetische parels met biotinyleerd proteïne L voor 35 min bij RT op een buis Rotator.
      Opmerking: Bij deze stap kunnen antilichamen worden bereid terwijl de parels worden geïnbroed met biotinyleerd proteïne L.
   3. Verzamel eiwit L-gecoate parels op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Verwijder de microcentrifuge buis van de magnetische standaard en voeg 1 mL 3% BSA-buffer toe, gevolgd door voorzichtig pipetteren gedurende ten minste 5 keer om de proteïne L-gecoate kralen te wassen.
   4. Verzamel gecoate parels op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Herhaal de wasstappen met 3% BSA voor nog eens 4 keer (in totaal 5 keer).
4. Antilichaam binding
   1. Voeg de berekende hoeveelheid GFP-antilichamen toe aan de proteïne-L-gecoate kralen en incureer gedurende 1 uur bij 4 °C op een buis Rotator.
      Opmerking: Zorg er na de incubatie van het antilichaam voor dat u de affiniteits matrix niet Vortex.
   2. Bereid tijdens de incubatie-laag-zout buffer door het totale volume te berekenen dat voor alle monsters nodig is en Voeg 0,5 μl/ml van 1 M DTT en 1 μl/ml 0,1 g/ml haring toe aan de buffervoorraad met een laag zout vóór gebruik.
      NB: 3 ml laag-zout buffer voor het wassen van elke buis GFP-geconjugeerde kralen en 200 μL/monster voor het resuspensie van de GFP-geconjugeerde kralen is vereist. Verse zoutpan buffer kan een paar uur op ijs worden gehouden.
   3. Verzamel de affiniteits matrix op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Voeg 1 mL laag-zout buffer toe en Pipetteer voorzichtig omhoog en omlaag om de affiniteits matrix te wassen. Verzamel de affiniteits matrix op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder de laag-zout buffer. Herhaal de wasstappen met een laag-zout buffer voor nog eens 2 keer (in totaal 3 keer).
   4. Respendeer de parels in een laag-zout buffer zodat elk monster 200 μL affiniteits matrix heeft.
      Opmerking: De affiniteits matrix kan worden opgeslagen in 0,02% NaN₃ bij 4 °c gedurende maximaal 2 weken. De affiniteits matrix moet in 3 keer snel worden gewassen in een laag-zout buffer en gedurende ten minste 10 minuten zachtjes worden geresuspendeerd op een buisrotator bij 4 °C als de affiniteits matrix wordt bereid binnen 1 week of 's nachts als de affiniteits matrix gedurende 1 week wordt opgeslagen. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.
      Let op: Natrium natriumazide is zeer giftig voor het milieu. Contact met zuren produceert giftig gas. Alle afvalstoffen moeten worden ingezameld voor de juiste verwijdering.

4. Lysis van lever weefsels

1. Buffer voorbereiding en installatie van apparatuur
   1. Bereken het aantal benodigde microcentrifuge buizen, label en chill op ijs.
      Opmerking: Gewoonlijk zijn zeven 1,5 mL micro centrifugebuizen vereist voor elk monster: 1 voor de resterende ontleed lever, 4 voor 4 mL gehomogeniseerde lever lysaat, en 2 voor het overbrengen van supernatants.
   2. Bereid verse dissectie buffer door het totale volume te berekenen dat nodig is voor alle monsters en voeg 1 μL/mL 0,1 g/mL Cycloheximide toe. Plaats de verse dissectie buffer op ijs om het hele experiment koud te houden.
      Opmerking: Voor elk monster is 10 mL dissectie buffer vereist.
   3. Bereid de nieuwe lysisbuffer voor door het totale vereiste volume voor alle monsters te berekenen en voeg 1 Tablet/10 mL EDTA-vrije proteaseremmer, 1 μL/mL 0,1 g/mL Cycloheximide en 10 μL/mL RNase remmers toe. Houd de lysisbuffer op ijs tijdens het experiment.
      Opmerking: Voor elk monster is 4 mL lysisbuffer vereist.
   4. Stel de weefsel slijper (tabel met materialen) zo in dat de buizen van polytetrafluorethyleen (PTFE)-glas op ijs kunnen worden geplaatst tijdens de homogenisatie van lever stukken. Zet 4 mL koude lysisbuffer in de PTFE-glazen buizen.
2. Herbevolkende lever homogenisatie
   1. Euthanize een 8 − 12-weekse Fah^-/- muis geïnjecteerd met de trap vector en herbevolkt voor 1 − 4 weken met anesthesie en cervicale dislocatie volgens goedgekeurde dierlijke experimentele richtlijnen.
   2. Plaats de muis op een dissectie bord en spray de buik met 70% ethanol. Tent de huid en het peritoneum laag in de buik met behulp van een tang en gebruik een schaar om een dwarse incisie te maken. Blijf met de schaar snijden om een brede U-vormige peritoneale flap te maken, met zorg om de ingewanden niet te snijden. Draai de peritoneale flap over het borstbeen om de lever bloot te leggen.
   3. Verwijder voorzichtig de lever met behulp van fijne schaar en Tang en plaats het weefsel snel in de koude dissectie buffer om te spoelen. Om bevroren weefsels te homogeniseren, verplaats de gewenste hoeveelheid leverweefsel snel in PTFE-glazen buizen met koude lysisbuffer zonder het weefsel te ontdooien.
      Opmerking: Het ontleed weefsel kan worden ingevroren en opgeslagen bij-80 °C nadat het is gewassen met dissectie buffer. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.
   4. Weeg de lever op een Petri schaaltje en Isoleer 200 − 500 mg lever stukken en ga in de PTFE-glazen buizen. Plaats het resterende leverweefsel in een voorgekoelde micro centrifugebuis en vlam blokkeren.
   5. Homogeniseren de monsters in een motor-aangedreven homogenisator beginnend bij 300 rpm om hepatocyten van de lever structuur te ontkoppelen voor minstens 5 slagen. Verlaag de glazen buis elke keer maar zorg ervoor dat de stamper niet boven de oplossing stijgt om beluchting te voorkomen die eiwit denaturatie kan veroorzaken.
   6. Verhoog de snelheid tot 900 rpm om de lever weefsels volledig te homogeniseren voor ten minste 12 volledige slagen.
   7. Breng het lysaat over in de gelabelde en voorgekoelde buisjes, met niet meer dan 1 mL lysaat per 1,5 mL micro centrifugebuizen. Als 4 mL lysisbuffer wordt gebruikt, Houd 1 tube en Flash de resterende 3 tubes in de vriezer.
      Opmerking: De lysaten kunnen tot 1 uur op ijs worden gehouden terwijl ze het volgende dier ontleden en verse lysaten bereiden. De gehomogeniseerde lever kan na de lysisstap in de vlam worden bevroren en bij-80 °C worden bewaard. Er kan een afname van 50% in geïsoleerd RNA zijn als bevroren lysaten worden gebruikt. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.
3. Nucleaire Lysis
   1. Centrifugeer het lever lysaat op 2.000 x g bij 4 °c gedurende 10 minuten en breng het supernatant over naar een nieuwe, voorgekoelde microcentrifuge buis op ijs.
   2. Voeg 1/9 van het supernatans volume van 10% nonylphenyl polyethyleenglycol toe om de uiteindelijke concentratie 1% nonylfenylpolyethyleenglycol te maken en meng door de micro centrifugebuizen voorzichtig te inverteren.
   3. Draai de microcentrifuge buizen snel af en voeg 1/9 van het monstervolume van 10% DOC toe om de eindconcentratie 1% DOC te maken en meng door de micro centrifugebuizen voorzichtig te inverteren. Draai de micro centrifugebuizen snel af en inincuberen op ijs gedurende 5 minuten.
   4. Centrifugeer het nucleaire lysaat op 20.000 x g bij 4 °c gedurende 10 minuten en breng het supernatant over naar een nieuwe, voorgekoelde microcentrifuge buis op ijs.
      Opmerking: De mitochondriën-uitgeput supernatant kan worden geplaatst op ijs voor een paar uur, terwijl de resterende monsters worden verzameld.

5. immunoprecipitatie

1. Neem voor elke buis 1% van het totale volume van de supernatant in als een pre-Immunoprecipitation-controle om de doel verrijking te vergelijken na incubatie met de affiniteits matrix. Plaats pre-Immunoprecipitation-controles op een buis Rotator bij 4 °C 's nachts, op dezelfde manier als de immunoprecipitated monsters worden verwerkt.
2. Voeg aan elk monster 200 μL affiniteits matrix toe. Neem extra zorg om de parels te hervatten door voorzichtig te pipetteren voordat u de affiniteits matrix aan elk monster toevoegt. Inbroed de lysaten met affiniteits matrix bij 4 °C 's nachts met zachte menging op een buis Rotator.
   Opmerking: Het protocol kan tot een dag na deze stap worden onderbroken.

6. RNA-isolatie

1. Buffer voorbereiding en installatie van apparatuur
   1. Plaats het magnetische rek bij 4 °C gedurende ten minste 30 minuten om vooraf te koelen en houd het rek tijdens het experiment op ijs.
   2. Bereken het aantal benodigde microcentrifuge buizen en pre-chill op ijs of bij 4 °C.
      Opmerking: Gewoonlijk vereist elk monster 1 micro centrifugebuis voor het uiteindelijke gezuiverde RNA.
   3. Draai de buizen snel uit stap 5,2 en vang de parels op door het op de magnetische rek te plaatsen gedurende ten minste 1 min. Verzamel of gooi het supernatant in extra micro centrifugebuizen.
      Opmerking: Het verzamelde supernatant dat niet-afhankelijke fractie bevat, kan in Flash worden bevroren en bij-80 °C worden opgeslagen om te vergelijken met de gebonden fractie voor transcriptie verrijking na zuivering. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.
   4. Bereid een hoogzout buffer voor door 0,5 μL/ml van 1 M DTT en 1 μl/ml 0,1 g/ml haring toe te voegen aan de buffervoorraad met een hoog zoutgehalte.
      Opmerking: Voor elk monster is 5 mL hoogzout buffer vereist.
2. RNA-isolatie
   1. Voeg 1 mL verse hoogzout buffer toe aan elke buis gevolgd door zachte pipetteren gedurende ten minste 5 keer zonder de invoering van bubbels.
      Opmerking: Onvoldoende wassen kan achtergronden van ongebonden transcripten introduceren terwijl de introductie van bubbels de afbraak van RNA kan versnellen.
   2. Verzamel kralen op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Herhaal de wasstappen met een hoog-zout buffer voor nog eens 4 keer (in totaal 5 keer).
   3. Verwijder de resterende hoogzout buffer en verwijder micro centrifugebuizen van de magnetische standaard en plaats bij RT gedurende 5 minuten om op te warmen.
   4. Rebreng de parels in 100 μL lysisbuffer (in de RNA Isolation Kit) met β-mercaptoethanol.
      Opmerking: Elke RNA-isolatie-en reinigingsset die het denaturerende guanidine-thiocyanaat bevat, kan worden gebruikt als een lysisbuffer om gebonden RNA vrij te maken van de affiniteits matrix. RNA-extractie moet worden verwerkt bij RT omdat guanidine thiocyanaat kan kristalliseren bij lage temperaturen.
   5. Vortex de kralen en buffer voor ten minste 5 s op de hoogste snelheid, draai snel naar beneden om de buffer op de zijkant van de micro centrifugebuis te verzamelen en inbroed de kralen met de buffer bij RT gedurende 10 minuten om het Bead-gebonden RNA in de lysisbuffer vrij te geven.
   6. Verzamel kralen op een magnetische standaard voor > 1 min en verzamel de supernatant om onmiddellijk door te gaan naar RNA Cleanup volgens het RNA-zuiverings protocol zoals gespecificeerd in de Kit (tabel met materialen).
      Opmerking: Het supernatant met het opgeelde RNA in lysisbuffer kan ook tot 1 maand voor het opruimen bij-80 °C worden bewaard door het opwarmen tot RT bij ontdooien.
   7. Om een maximale kwaliteit van het geïsoleerde RNA te bereiken, voert u alle optionele stappen uit, waaronder DNase spijsvertering en alle RNA elutie Steps. Verwarm de elutie buffer van de RNA Isolation Kit of RNase-vrij water tot 60 °C voor maximaal RNA herstel.
      Opmerking: Het geïsoleerde RNA kan gedurende meerdere jaren bij-20 °C worden bewaard voor maximaal 1 maand of-80 °C. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.

7. optionele RNA-kwaliteitsanalyse (aanbevolen)

1. Evalueer de RNA-kwaliteit met een bioanalyzer¹¹ en een hoeveelheid met een spectrofotometer¹² om te bepalen of het immunoprecipitatie proces herhaald moet worden om voldoende en kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen.
   Opmerking: De optimale RNA-kwaliteit voor sequentiëren met hoge doorvoer moet de protocollen volgen die zijn gespecificeerd door bibliotheek voorbereidings kits en volgorde platforms.

8. downstreamtoepassingen

Opmerking: Totaal RNA geïsoleerd door het TRAP-protocol kan worden gebruikt in een aantal standaard downstream-toepassingen, met inbegrip van RNA-SEQ (TRAP-SEQ). Standaard reverse transcriptie en kwantitatieve PCR-protocollen kunnen ook worden gebruikt na val.

1. Voor de TRAP-SEQ voert u de RNA-SEQ-bibliotheek voorbereiding uit volgens de standaardmethoden¹³.
2. Voor RNA-seq, voorbereiding cDNA sequencing bibliotheken met behulp van commerciële RNA-SEQ kits met oligo d (T)-gebaseerde verrijking van poly adenylated poly (A) transcripten. Als alternatief, als de totale RNA-kwaliteit lager is dan aanbevolen voor poly (A) verrijking, gebruik rRNA depletie modules. Verwacht echter meer rRNA-uitlijning na sequentiëren te zien.

Resultaten

Voor het profiel van genexpressie bij het hervullen van hepatocyten van de Fah^-/- Mouse, worden GFP: Rpl10a Fusion en Fah transgenes samen geleverd binnen een transposon-bevattende plasmide⁸ (trap vector) tot levers door hydrodynamische injectie (Figuur 1A). De verwijdering van nitisinon induceert een toxische leverbeschadiging die een selectiedruk creëert voor hepatocyten die een ...

Discussie

TRAP-SEQ is een techniek voor celtypespecifieke isolatie van het vertalen van mRNA via epitope-Tagged ribosomen en presenteert een alternatief voor FACS benaderingen, als het omzeilt beperkingen zoals tijd vereisten van FACS⁹. In plaats daarvan, TRAP maakt snelle en efficiënte isolatie van RNA rechtstreeks uit bulk weefsels, helpen om te voorkomen dat eventuele veranderingen in genexpressie. De trap-SEQ is bijzonder geschikt voor gebruik in de herbevolkende Fah^-/- Mouse lever,...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated	DWK Life Sciences (Wheaton)	358007
Absolutely RNA Miniprep Kit	Agilent	400800
Anti-GFP antibodies	Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core	GFP Ab #19C8 en GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
Cycloheximide	Millipore Sigma	C7698
Deoxycholic acid, DOC	Millipore Sigma	D2510
D-Glucose, Dextrose	Fisher Scientific	D16
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Thermo Fisher Scientific	65602
Fisherbrand Petri Dishes met heldere deksel	Fisher Scientific	FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, geen fenolrood	Thermo Fisher Scientific	14065-056
HEPES, 1 M Oplossing, pH 7.3, Moleculaire Biologie Grade, Ultrapure, Thermo Scientific	Thermo Fisher Scientific	AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2	Millipore Sigma	M8266
Methanol	Fisher Scientific	A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific	VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module	New England BioLabs	E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit voor Illumina	New England BioLabs	E7530S
Nonylfenyl polyethyleenglycol, NP-40. IGEPAL CA-630	Millipore Sigma	I8896
Nuclease-vrij water, niet DEPC-behandeld	Ambion	AM9932
Overhead Stirrer	DWK Life Sciences (Wheaton)	903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4	Ambion	AM9625
Pierce Recombinant Protein L, gebiotinileerd	Thermo Fisher Scientific	29997
Potassium chloride, KCl	Millipore Sigma	P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents	Agilent	5067-1513
RNaseZap RNase Decontaminatieoplossing	Invitrogen	AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitoren	Promega	N2515
Sodium azide, NaN3	Millipore Sigma	S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3	Millipore Sigma	S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor	Invitrogen	AM2694