Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Live Cell time-lapse Imaging is een belangrijk hulpmiddel in celbiologie dat inzicht geeft in cellulaire processen die anders zouden kunnen worden vergeten, verkeerd begrepen of verkeerd geïnterpreteerd door de analyse van de vaste cel. Hoewel de vaste celbeeldvorming en-analyse robuust en voldoende zijn om cellulaire stationaire toestand te observeren, kan deze worden beperkt bij het definiëren van een tijdelijke volgorde van gebeurtenissen op cellulair niveau en is slecht uitgerust om de voorbijgaande aard van dynamische processen te beoordelen, waaronder mitotische progressie. Live-celbeeldvorming daarentegen is een welsprekend hulpmiddel dat kan worden gebruikt om cellulaire processen in de loop van de tijd op het eencellige niveau te observeren en heeft de capaciteit om de dynamiek van processen vast te leggen die anders slecht zouden worden weergegeven in vaste celbeeldvorming. Hier beschrijven we een aanpak voor het genereren van cellen die fluorescentisch gelabelde markers van chromatine en microtubuli dragen en hun gebruik in Live Cell Imaging benaderingen om de metafase-chromosoom uitlijning en de mitotische uitgang te bewaken. We beschrijven Imaging-gebaseerde technieken om de dynamiek van spil vorming en mitotische progressie te beoordelen, inclusief de identificatie van cellen in verschillende stadia in mitose, identificatie en tracking van mitotische defecten, en analyse van spil dynamiek en mitotische cel lot na de behandeling met mitotische remmers.
Inleiding
Op afbeeldingen gebaseerde analyse van vaste cellen wordt vaak gebruikt om de celpopulatie veranderingen te beoordelen in reactie op verschillende verstoringen. In combinatie met celsynchronisatie, gevolgd door de verzameling en imaging van seriële tijdpunten, kunnen dergelijke benaderingen worden gebruikt om een cellulaire opeenvolging van gebeurtenissen voor te stellen. Niettemin, vaste celbeeldvorming is beperkt in die tijdelijke relaties worden geïmpliceerd voor een populatie en niet aangetoond op het niveau van individuele cellen. Op deze manier, terwijl vaste celbeeldvorming en-analyse voldoende zijn om robuuste fenotypes en steady-state veranderingen te observeren, is de mogelijkheid om voorbijgaande veranderingen na verloop van tijd te detecteren en veranderingen die alleen een subpopulatie van de cellen beïnvloeden, onvolmaakt. Live-celbeeldvorming daarentegen is een welsprekend hulpmiddel dat kan worden gebruikt om cellulaire en subcellulaire processen binnen een enkele cel of cellulaire populatie te observeren, na verloop van tijd en zonder de hulp van synchronisatie benaderingen die zelf invloed kunnen hebben op cellulair gedrag 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
De vorming van een bipolaire mitotische spil is essentieel voor de juiste chromosoomsegregatie tijdens celdeling, resulterend in twee genetisch identieke dochtercellen. Defecten in de mitotische spil structuur die corrupte mitotische progressie en het compromitteren van de getrouwheid van chromosoomsegregatie kan resulteren in catastrofale celsplitsingen en verminderde levensvatbaarheid van de cel. Om deze reden, mitotische gifstoffen die spindel vorming veranderen zijn veelbelovende Therapeutics om de snelle proliferatie van kankercellen7,8,9te beperken. Niettemin, vaste celanalyse van spil structuur na de toevoeging van mitotische gifstoffen is beperkt in zijn vermogen om het dynamische proces van spindel vorming te beoordelen en kan niet aangeven of waargenomen veranderingen in spil structuur permanent zijn of in plaats van voorbijgaande en kan worden overwonnen om succesvolle celdeling toe te staan.
In dit protocol beschrijven we een benadering voor het beoordelen van de dynamiek van mitose na spindle-perturbaties door Live-celbeeldvorming. Met behulp van de htert vereeuwigd RPE-1 cellijn ontworpen om een RFP-Tagged histone 2b uit te drukken om chromatine te visualiseren, samen met een met EGFP gelabelde α-tubuline om microtubuli te visualiseren, de timing van metafase-chromosoom uitlijning, anafhase aanvang, en uiteindelijk het lot van de mitotische cellen wordt beoordeeld aan de hand van visuele aanwijzingen van chromosoom beweging, verdichting en nucleaire morfologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. opwekking van hTERT-RPE-1 cellen die op rendabele wijze RFP-histone 2B (RFP-H2B) en α-tubulin-EGFP (tub-EGFP) uitdrukken
Opmerking: alle stappen volgen aseptische technieken en vinden plaats in een veiligheidskast van bioveiligheid Level II + (BSL2 +).
- Genereer retrovirus met de genen van belang (α-tubulin-EGFP en RFP-H2B) door de transfectie van 293T cellen met de juiste linvirale plasmiden volgens de instructies van de fabrikant van het op lipide gebaseerde transfectie-toedieningssysteem.
- Dag 1: gebruik een wegwerp glazen Pasteur-pipet om het celkweekmedium uit een plaat van sub-confluente 293T-cellen te zuigen en het rest medium met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) af te spoelen door 5 mL PBS toe te voegen. Draai om PBS over de bodem van het plaatje te verdelen en zuig vervolgens de PBS op met een steriele, wegwerp glazen Pasteur-pipet.
- Voeg 2 mL 0,05% trypsine toe die vooraf is opgewarmd tot 37 °C en geef de plaat terug naar een bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2 tot 5 minuten, zodat aanhangers van het celkweek oppervlak kunnen worden vrijgelaten.
- Voeg 8 mL vers Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) toe, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine op de plaat die trypsine bevat.
- Rebreng de cellen door met het zachtjes pipetteren en breng de suspensie over naar een steriele 15 mL conische buis. Plaats de conische buis in een gebalanceerde centrifuge en spin op 161 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen zachtjes te pellet.
- Aspirate de medium/trypsine-oplossing uit gepelleteerde cellen en respendeer cellen in 10 mL DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicillaire/streptomycine. Gebruik een hemocytometer om te tellen van de 293T celsuspensie en plaat 2 x 106 293t cellen per goed van een 6 goed plaat.
- Kweekcellen in een totaal volume van 2 mL van het gemodificeerde Eagle medium van Dulbecco (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine en onderhouden in een bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Dag 2: Pipetteer 7 μL op lipide-gebaseerde transfectie afgifte reagens en 100 μL verlaagd serum medium in een micro centrifugebuis van 1,5 mL en laat het gedurende 5 minuten op kamertemperatuur inbrotten (buis #1).
- Pipetteer 1 μg RFP-H2B-expressie vector (of 1 μg α-tubulin-EGFP-expressie vector) in een aparte micro centrifuge-buis van 1,5 mL (zoals vereist volgens de richtlijnen van de fabrikant), 0,5 μg pMD2. G en 1 μg psPAX2 en 100 μL verlaagd serum medium (buis #2).
- Combineer de inhoud van stap 1.1.7 en stap 1.1.8 door zorgvuldig Pipetteer buis #2 in buis #1 en inincuberen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: de reactie kan zo nodig worden geschaald voor de transfectie van cellen in extra putjes. - Pipetteer de transfectie-reactie druppelsgewijs naar het gewenste goed met 293t cellen in 2 ml medium en retourneer het gerecht in de bevoficeerde incubator bij 37 °c met 5% Co2.
Opmerking: voor het genereren van cellen uitdrukken van zowel RFP-H2B en α-tubulin-EGFP, genereren van afzonderlijke virus voor elke expressie construct (stappen 1.1.7-1.1.9). - Dag 3: aspireren en vervangen van het medium met 2 mL verse DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicillaire/streptomycine. Keer de schaal terug naar de bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Dag 4: Verzamel het medium met uitgesproken virusdeeltjes, wees voorzichtig om niet te verstoren of te verwijderen 293T cellen. Filtreer het medium met virusdeeltjes door het door te geven via een filter van 0,45 μM dat aan een injectiespuit van 5 mL is bevestigd. Aliquot virus voor korte termijn opslag bij 4 °C, of lange termijn opslag bij-80 °C.
Opmerking: virale deeltjes die op deze manier worden verkregen, zullen aanwezig zijn in een bereik van ~ 1 x 107 tot 1 x 108 transducing-eenheden/ml. Als de virale-producerende cellen en cellen worden geïnfecteerd zijn beide gekweekt in hetzelfde medium, virale concentratie ter vervanging van het medium is niet vereist en gefilterde virale deeltjes kunnen direct worden gebruikt om cellen te infecteren. - Zaad 2 x 105 HTERT-RPE-1 cellen per put van een 6-goed gerecht in voorbereiding op de virale infectie. Kweekcellen in 2 mL DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicillaire/streptomycine en onderhouden in een bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Dag 5: Voeg hexadimethrine bromide (bijv. polybrene) toe aan de hTERT-RPE-1 cellen tot een eindconcentratie van 8 μg/mL. Besmetten cellen met een mengsel van 500 μL virus verdund in 500 μL celkweekmedium.
Opmerking: Hexadimethrine bromide stamoplossing wordt bereid in steriel gedestilleerd water en vervolgens gefilterd door een 0,45 μm filter. - Dag 6: met behulp van een wegwerp glas Pasteur Pipet, aspireren het medium uit putten met het virus geïnfecteerde cellen. Vervang het celkweekmedium door 2 mL DMEM met 10% FBS, 1% penicillaire/streptomycine, en geschikte concentraties van antibioticum om te selecteren voor de plasmide integratie en expressie.
Opmerking: de α-tubulin-EGFP-expressie plasmide die in de beschreven experimenten wordt gebruikt, draagt een puromycine-resistentie-gen en de RFP-H2B Expression plasmide draagt een blasticidin-resistentie-gen. Daarom worden 10 μg/mL puromycine en 2 μg/mL blasticidin gebruikt voor de selectie van α-tubulin-EGFP, RFP-H2B die hTERT RPE-1-cellen uitdrukken. De concentraties van antibiotica die voor de selectie worden gebruikt, kunnen verschillen voor verschillende gebruikte cellijnen. - Houd de cellen onder antibioticum selectie gedurende 5-7 dagen bij, waarbij het medium elke 3 dagen wordt vervangen door een vers medium dat geschikte selectie reagentia bevat.
Opmerking: cellen moeten tijdens de selectie in subsamenvloeiing worden gehandhaafd en moeten zo nodig worden uitgevouwen, zoals beschreven in stappen 1.1.1 tot en met 1.1.4. - Gebruik immunofluorescentie Imaging om de expressie van gelabelde constructies te bevestigen.
Opmerking: indien gewenst kunnen eencellige klonen worden afgeleid om uniforme uitdrukkings niveaus binnen de celpopulatie te verkrijgen. Zodra stabiele klonen worden bevestigd, kunnen cellen worden gehandhaafd onder de standaardcultuur omstandigheden bij afwezigheid van antibiotica selectie.
2. voorbereiding van cellen voor levende celbeeldvorming na mitotische spindel verstoringen
Opmerking: gebruik aseptische technieken en voer de stappen uit in een BSL2 veiligheidskast.
- Gebruik een steriele Pipet van het wegwerp glas Pasteur en zuig het medium op uit de kweek plaat met de cellijn die de uitdrukkings constructie (en) draagt (vanaf stap 1,7). Was de cellen kort met 10 mL steriele PBS. Draai om PBS over de bodem van het plaatje te verdelen en laat PBS met een steriele wegwerp glazen Pasteur pipet.
- Voeg 2 mL 0,05% trypsine toe aan de 10 cm plaat. Incuberen de plaat bij 37 °C gedurende 2-5 min of totdat de cellen van het plaat oppervlak zijn losgemaakt.
- Voeg 8 mL vers medium toe aan de plaat die trypsine bevat. Rebreng de cellen door met het zachtjes pipetteren en breng de suspensie over naar een steriele 15 mL conische buis. Plaats de conische buis in een gebalanceerde centrifuge en spin op 161 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen zachtjes te pellet.
- Zuig de supernatant voorzichtig op en regende in 10 mL PBS door voorzichtig te pipetteren met een serologische Pipet van 10 mL. Plaats de conische buis in een gebalanceerde centrifuge en spin op 161 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen zachtjes te pellet.
- Zuig de supernatant voorzichtig op en regende in 10 mL van het verse medium door voorzichtig te pipetteren met een serologische Pipet van 10 mL.
- Tel cellen, Bereken vervolgens het celgetal met behulp van een hemacytometer en Verdun tot een concentratie van 1-2 x 105 cellen/ml in het celkweekmedium. Zaad 500 μL van de celsuspensie aan elke put van een steriele 12-well beeld bodemplaat. Plaats de plaat in de celkweek incubator en laat de cellen zich aan het plaat oppervlak houden.
Opmerking: voor Live-celbeeldvorming moeten cellen goed worden nageleefd, zodat ze tijdens het verzamelen van afbeeldingen aan het Imaging-vlak blijven gekoppeld. De duur van de tijd die nodig is voor cellen om te hechten na plating kan verschillen van de ene cellijn naar de volgende en moet worden geoptimaliseerd voor de cellijn onder studie. - Tot 30 minuten voorafgaand aan het initiëren van timelapse-beeldvorming, voeg een relevante concentratie van een mitotische geneesmiddel toe aan een of meer van de putjes die met cellen zijn geseeldigd. Om rekening te houden met de potentiële impact van het organische oplosmiddel op cellulair gedrag, voegt u een gelijk volume van het verdunnings materiaal van de remmer toe aan cellen als besturingselementen. Zorg er bijvoorbeeld voor dat de toevoeging van 100 nM van de specifieke remmer van de mitotische kinase Aurora A (bijv. alisertib) wordt geëvenaard met een gelijk volume DMSO, het verdunningsmiddel voor dit medicijn, in een goed besturingselement van cellen.
Opmerking: vergelijkende analyse van dynamische veranderingen in de mitotische progressie vereist putten van cellen die moeten worden bereid bij afwezigheid van verstoringen, om de beeldvorming van normale behandeling parallel aan experimentele omstandigheden mogelijk te maken.
3. Microscoop ingesteld voor timelapse-beeldvorming van RFP-H2B, α-tubulin-GFP dat cellen uitdrukt (Figuur 1, Figuur 2)
- Plaats de celkweek plaat met de RFP-H2B, α-tubulin-GFP die de hTERT RPE-1-cellen uitdrukt om te worden afgebeeld in een geschikte fase insert op een omgekeerde epifluorescentie Microscoop die is uitgerust met een hoge resolutie camera (pixelgrootte van 0,67 μm bij 20x), een omgevings kamer voorverwarmd tot 37 °C, en een toedieningssysteem voor bevoficeerd 5% CO2.
Opmerking: de ingesloten omgevings kamers of de door een temperatuur geregelde wisselplaten kunnen geschikt worden geleverd met bevoficatie 5% CO2 kan worden geleverd en stabiele temperatuurregeling verkregen. - Gebruik een 20x lucht doelstelling met een numerieke opening van 0,5 en uitgerust voor het hoge contrast fluorescentie-en fase contrast of brightfield-beeldvorming. Bekijk cellen met het fase contrast of brightfield en pas de koers aan en zet de focus op de Microscoop om de cellen scherp te maken.
- Identificeer en stel de optimale belichtingstijden in voor de beeld verwerving van brightfield, GFP en RFP door de respectieve filter kubus te selecteren met de juiste excitatie en emissie voor de geimagde fluor Foren. U ook op de knop automatische belichting klikken om een vooraf bepaalde belichtingstijd in te voeren. Als het signaal niet intens genoeg is, selecteert u pixel binning om kortere belichtingstijden in te schakelen door te klikken op het tabblad binning en 2 x 2 pixel binning te selecteren in het vervolgkeuzemenu.
Opmerking: fototoxiciteit kan de mitotische progressie en de levensvatbaarheid van cellen aantasten. Het falen van mitotische cellen in controle populaties om normale behandeling te voltooien, kan een indicatie zijn dat de blootstellings tijden en/of de beeldvormings duur verder moeten worden geoptimaliseerd. - Gebruik een acquisitie-en analyse software waarmee multi-coördinaat, multi-well Imaging gelijktijdig kan worden verkregen en de parameters voor de beeld verwerving kan worden gedefinieerd.
- Selecteer en Kalibreer de Microscoop fase naar de multi-well schaal volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik de software voor het verzamelen van afbeeldingen om de putten te markeren of anderszins te selecteren die worden afgebeeld door op de betreffende putjes in het diagram van het plaat formaat te klikken dat wordt gebruikt.
- Definieer onder het Configuratiescherm Generatedpoints (afbeelding 2) de coördinaten binnen elke put die worden afgebeeld door op het tabblad punt plaatsing te klikken en vooraf gedefinieerde of willekeurige coördinaat plaatsing te selecteren van het vervolgkeuzemenu. Selecteer het tabblad werkgebied en selecteer beperkt in het vervolgkeuzemenu om het coördinaten selectiegebied te beperken om de grenzen van de put uit te sluiten. Klik op de tabbladen aantal en distributie om het aantal en de verdeling van de punten die moeten worden vastgelegd per put, respectievelijk te selecteren.
Opmerking: het aantal coördinaten dat per put kan worden afgebeeld binnen de tijdsinterval van 5 min wordt beperkt door het aantal putjes dat moet worden afgebeeld, evenals de belichtingstijd voor elk kanaal. Typisch, 5-8 coördinaten per goed zijn voldoende om te observeren ten minste 50 cellen in elke toestand voortgang via mitose binnen 4 h. - Selecteer en voer het tijdsinterval en de duur voor het verzamelen van afbeeldingen door te klikken op en invoeren van de waarden in de time sequence Configuratiescherm.
Opmerking: het verwerven van beelden om de 1 tot 5 minuten is geschikt om de dynamiek van de mitotische progressie te bewaken. De totale duur van de beeldvorming moet het gewenste eindpunt en proliferatie percentage van de cellijn weergeven. Bijvoorbeeld, 4 uur is voldoende om te zien veel cellen vooruitgang door middel van mitose, 16 uur is voldoende om te zien van de meeste RPE-1 cellen in een asynchrone populatie voortgang door middel van mitose.
4. time-lapse beeldanalyse om te bepalen metafase timing en mitotische cel lot na mitotische spindel verstoringen
Opmerking: Voer de beeldanalyse uit met behulp van een software voor het verzamelen van afbeeldingen (tabel met materialen), imagej of vergelijkbare beeldanalyse software.
- Visualiseer RFP-H2B met het label chromatine door de afbeeldingen te selecteren die zijn vastgelegd met de RFP-filter kubus. Identificeer een cel die mitose invoert, zoals aangegeven door initiële chromatide verdichting (Figuur 2C, blauwe pijlpunt) en afbreken van de nucleaire envelop (wanneer α-tubuline-EGFP niet langer wordt uitgesloten door de nucleaire grens).
- Bepaal de mitotische timing van metafase uitlijning en anafhase aanvang in afzonderlijke cellen: Volg de cel door opeenvolgende tijdspunten in de verworven film om het aantal tijdpunten/minuten van de mitotische invoer te bepalen tot RFP-H2B-gelabeld chromatine voltooit de uitlijning op de celevenaar tijdens de metafase (Figuur 2C, gele pijlpunt).
- Om de mitotische timing, mitotische getrouwheid en het lot van cellen te bewaken, blijft u de cel volgen door opeenvolgende tijdspunten om de tijd coördinaat te identificeren waarbij anafhase chromosoomsegregatie zichtbaar is (Figuur 2C, witte pijlpunt) en/of waar chromatine decompactie en nucleaire envelop Reformatie (zoals aangegeven door tubuline-uitsluiting van de Nucleus) is opgetreden.
Opmerking: perturbaties in spindel assemblage of mitotische progressie kunnen worden beoordeeld als een functie van de tijd die nodig is om een bipolaire mitotische spil te verkrijgen en volledige chromosoom uitlijning te bereiken, of om anafase chromosoomsegregatie te voltooien. - Visualiseer RFP-H2B om cellen in elke populatie te identificeren die mitotische defecten vertonen, waaronder achterblijvende chromosomen en chromatide bruggen tijdens anafase chromosoomsegregatie.
Opmerking: gecompromitteerde mitotische getrouwheid kan ook resulteren in meerkernige of met micronuclei dochtercellen en kan worden gevisualiseerd in cellen na een mitotische uitgang, zoals in Figuur 3.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Beoordeling van de mitotische progressie in de aanwezigheid van spil perturbaties
De regulering van spil paal focus is een essentiële stap in de juiste bipolaire spindel vorming. Verstoring in dit proces door eiwit depletie, remming van de drug, of wijzigingen in centrosoom aantal corrupte spil structuur en vertragen of stoppen mitotische progressie10,11,12,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De tijdelijke resolutie die wordt geleverd door de time-lapse Imaging zorgt voor de visualisatie en beoordeling van sequentiële cellulaire gebeurtenissen binnen enkele cellen. Benaderingen die gebruikmaken van cellulaire synchronisatie gevolgd door het verzamelen en fixeren van cellen op opeenvolgende tijdstippen zijn beperkt in die vergelijkingen worden uiteindelijk gemaakt tussen populaties van cellen. In contexten waar de cellulaire respons op verstoringen niet uniform kan zijn, of waar het proces dat wordt gevisualis...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
DLM wordt ondersteund door een NSF GRFP. ALM wordt ondersteund door financiering uit de Smith Family Award for Excellence in biomedisch onderzoek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | Een serine protease gebruikt om adherante cellen vrij te maken van kweekschotels |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objectief | Nikon | Voor gebruik in Live-cell beeldvorming om zowel helder veld als fluorescentie te visualiseren | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | Voor gebruik in retrovirale transfectie; gebruikt in stap 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expressievector voor alfa tubuline gefuseerd met een groen fluorescent eiwit tag; voor gebruik in de visualisatie van tubuline in live-cell beeldvorming: commercieel verkrijgbaar via addgene en andere leveranciers |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Klein molecuulremmer van de mitotische kinase Aurora A. Stockconcentratie wordt bereid op 10mM in DMSO, en gebruikt bij een eindconcentratie van 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibioticum selectiemiddel; gebruikt om a-tub-EGFP expresserende cellen te selecteren |
| C02 | Airgas | Voor gebruik in celkweek en levende cel beeldvorming | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitatiegolflengte 545nm met 25nm bandbreedte en emissie bij 605nm golflengte met 70nm bandbreedte; voor visualisatie van H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitatiegolflengte 470nm met 40nm bandbreedte en emissie bij 525nm golflengte met 50nm bandbreedte; voor visualisatie van GFP-tubuline |
| disposable glass Pastuer pipets, gesteriliseerd | Fisher Scientific | 13-678-6A | Voor gebruik bij het afzuiging van cellen |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Celkweekmedium voor de groei van RPE-1 en 293T cellen |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Celkweekmediumsupplement |
| Lipofectamine 3000 en p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipide gebaseerde transfectiereagent voor transfectie van plasmiden; gebruikt in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | voor gebruik in celkweek, transfectie/infectie, en levende cel beeldvorming |
| Nikon Ti-E microscoop | Nikon | Inverteerde epifluorescentiemicroscoop voor gebruik in live-cell beeldvorming | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Beeldverwervings- en analysesoftware; gebruikt in secties 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Serumarm medium voor celtransfectie; gebruikt in stap 1.1.3 |
| Penicilline/Streptomycine | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibioticum gebruikt in celkweekmedium |
| fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | steriele zoutoplossing voor gebruik met celkweek |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentivirale VSV-G envelop expressieconstruct; gebruikt in stap 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Kationisch polymeer gebruikt om de efficiëntie van virale infectie te verbeteren; gebruikt in stap 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2e generatie lentivirale verpakkingsplasmide; gebruikt in stap 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibioticum selectiemiddel; gebruikt om RFP-H2B expresserende cellen te selecteren |
| RFP- Histon 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expressievector voor rood fluorescent eiwit-gelabelde histon 2B; voor gebruik in de visualisatie van chromatine in live-cell beeldvorming: commercieel verkrijgbaar via Addgene en andere leveranciers |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipide gebaseerde transfectiereagent voor transfectie van siRNA constructen |
| RPE-1 cellen | ATCC | CRL-4000 | Menselijke retinale pigment epitheelcel lijn |
| Weefselkweekschaal 100x20mm | Corning | 353003 | voor gebruik bij het kweken van adherante cellen |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera bevestigd aan de microscoop, gebruikt voor het vastleggen van beelden van cellen |
Referenties
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491(2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131(2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564(2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
