Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

Samenvatting

Gepresenteerd hier is een protocol voor het verrijken van pachytene spermatocyten, ronde spermatiden, en rek spermatiden uit volwassen muis testes met behulp van een discontinu bovine serumalbumine dichtheidsgradiënt met standaard laboratoriumapparatuur.

Samenvatting

Om elke stap van de spermatogenese te karakteriseren, moeten onderzoekers verschillende subpopulaties van kiemcellen scheiden van de teelballen. Het isoleren van discrete populaties is echter een uitdaging, omdat de testis voor volwassenen een complexe mix van kiemcellen uit alle stappen van spermatogenese bevat, samen met bepaalde populaties somatische cellen. In de afgelopen decennia zijn verschillende technieken zoals centrifugale elutriation, fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en STA-PUT met succes toegepast op de isolatie van kiemcellen. Een nadeel is dat ze allemaal speciale apparaten en gespecialiseerde training nodig hebben. Volgende beginselen ten grondslag liggen aan de STA-PUT methode, is een eenvoudig protocol ontwikkeld voor de isolatie van pachytene spermatocyten, ronde spermatiden, en het verlengen van spermatiden van de testes van de muis. Na het klaarmaken van een eencellige suspensie van testiculaire cellen, worden specifieke celpopulaties verrijkt door zwaartekracht sedimentatie door middel van een discontinu-dichtheidsgradiënt van runderserum albumine (BSA). De celfracties worden vervolgens handmatig verzameld en microscopisch geanalyseerd. Deze aangepaste dichtheidsgradiënt voor ronde spermatiden (MDR) sedimentatie protocol kan op grote schaal worden toegepast, omdat hiervoor alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig is. Bovendien vereist het protocol minimale uitgangsmaterialen, waardoor de kosten en het gebruik van proefdieren worden verminderd.

Inleiding

Er is nog veel onbekend over de moleculaire en biologische gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de spermatogenese van zoogdieren, een complex proces waarbij mitose stamcellen transformeren tot zeer gespecialiseerde spermatozoa^1,2. Spermatogenese vindt plaats binnen de seminifereuze tubuli van de testis. De buisjes bevatten een mengsel van kiemcellen uit elke stap van differentiatie, met inbegrip van mitose stamcellen, mitotisch verdelen spermatogonia, Meiotische spermatocyten, en postmeiotische spermatieën (die haploïde differentiatie ondergaan van ronde spermatiden om spermatiden te verlengen, en tot slot tot volwassen spermatozoa). Somatische cellen van de testis omvatten Sertoli cellen die worden vermengd met geslachtscellen in de de buisjes, peritubulaire myoïde cellen die muren van de buisjes vormen, en testosteron-producerende Leydig cellen in de interstitiële ruimte tussen buisjes.

Het bestuderen van moleculaire en biochemische processen tijdens de spermatogenese vereist vaak scheiding van verschillende kiemcellen uit een complex mengsel van testzaadcel groepen. Er zijn veel verschillende strategieën ontwikkeld voor celverrijking. De meest succesvolle methoden zijn sta-put Velocity sedimentatie per eenheid zwaartekracht^3,4,5,6, centrifugaal elutriation op basis van tegenstroom centrifugeren^7,8, en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) die cellen scheidt op basis van DNA-inhoud en/of specifieke markers. Deze methoden worden vaak gebruikt bij spermatogenese onderzoekers en zorgen voor de efficiënte verrijking van specifieke typen kiemcellen. Een beperking van deze technieken is echter dat ze gespecialiseerde, dure hardware nodig hebben die expertise vereist.

Hier gepresenteerd is een eenvoudig en goedkoop protocol om verrijkte populaties van de drie meest overvloedige celpopulaties van muis teelballen te isoleren: ronde spermatiden, pachyteen spermatocyten, en rek spermatiden. Dit protocol wordt de gemodificeerde dichtheidsgradiënt voor ronde spermatiden (MDR) genoemd, omdat het bijzonder goed werkt voor het verrijken van ronde spermatiden. De MDR-methode is gebaseerd op dezelfde principes als de STA-PUT Velocity sedimentatie, maar vereist alleen standaard laboratoriumapparatuur. Levende cellen mogen sediment door middel van een handmatig bereide discontinu-dichtheidsgradiënt van runderserum (BSA) in een standaard buis van 50 mL onder het zwaartekracht veld van de aarde. Grotere cellen bewegen sneller door de gradiënt, die verschillende populaties van kiemcellen scheidt. Na sedimentatie worden verrijkte fracties van de drie celtypen handmatig verzameld. De zuiverheid van deze verrijkte celpopulaties is vergelijkbaar met die verkregen door de STA-PUT en centrifugale elutriation.

Naast het bedekken van de constructie en het gebruik van de BSA gradiënt voor Velocity sedimentatie, beschrijft het protocol ook een digestiemethode om testiculaire cellen vrij te geven van seminifereuze tubuli. Het protocol werd gewijzigd van die ontwikkeld door Romrell et al.⁹ en bevat sequentiële digestons met COLLAGENASE IV en trypsine. Sequentiële digestaten gecombineerd met het gebruik van een bicarbonaat buffer (d.w.z. de Krebs-oplossing) hebben aangetoond dat het de scheiding en levensvatbaarheid van de kiemcellen⁹sterk verbetert.

Tijdens de MDR-verrijking brengen cellen rond de 4 uur samen buiten de omgeving van de seminifereuze tubuli en worden ze niet blootgesteld aan stressvolle mechanische krachten, waardoor het verzamelen van zeer levensvatbare cellulaire fracties voor downstream-analyse mogelijk is. Bovendien, vergelijkbaar met de centrifugale elutriation en STA-PUT, vereist het MDR-protocol geen chemische behandeling of etikettering van cellen, wat ook bijdraagt aan het behoud van hun levensvatbaarheid. Belangrijk is dat zo weinig als twee volwassen muis testes voldoende zijn voor de MDR-isolatie en daarom biedt één volwassen muis voldoende verrijkte cellen voor zowel RNA-als eiwitanalyse. Standaard STA-PUT protocol beveelt het gebruik van maar liefst 12 volwassen muizen voor celisolatie⁶; Hoewel, op basis van eerdere ervaring, is het bekend dat succesvolle isolatie kan worden gedaan van drie tot vier volwassen muizen. De laagste hoeveelheid uitgangsmateriaal die naar verluidt voldoende is voor centrifugale elutriation is zes muis testes (drie muizen)⁸. Daarom, naast het elimineren van de noodzaak van dure gespecialiseerde apparatuur, vermindert het MDR-protocol het aantal vereiste laboratoriumdieren.

Protocol

Het onderhoud van laboratorium muizen en alle experimenten werd uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. uitrusting en reagens opstelling

1. Stel het waterbad in op 37 °C.
2. Zet de celkweek incubator op 34 °C, 5% CO₂, 95% vochtigheid. Plaats de buis Rotator in de incubator.
   Opmerking: Incubators vereisen een lange tijd om de interne temperatuur te veranderen. Als een incubator die constant op 34 °C is ingesteld niet beschikbaar is, stelt u één tot 1 dag voor het experiment in.
3. Voorbereiding en etikettering van de juiste hoeveelheid microscopie glaasjes. Teken een ring van ~ 1 cm in diameter met een vetpen en laat het vet drogen.
4. Bereid 1x Krebs buffer, pH 7,8 (tabel 1). Zet twee conische buisjes met 50 mL 1x Krebs tot 34 °C om voor de stappen 2.5 − 2.8 te verwarmen. Bewaar de rest van de 1x Krebs bij 4 °C of op ijs.
5. Bereid BSA-oplossingen voor. Maak eerst 25 mL 10% (w/v) BSA-oplossing in Krebs door het oplossen van 2,5 g BSA in 1x Krebs-buffer tot een eindvolume van 25 mL. Verdun de 10% BSA-oplossing met 1x Krebs-buffer om verschillende BSA-concentraties te verkrijgen (tabel 2). Houd alle BSA-oplossingen bij 4 °C.
   Opmerking: Bereid oplossingen op dezelfde dag van de procedure en bewaar deze bij 4 °C tot het gebruik.
6. Bereid de verteringsenzymen voor door de juiste hoeveelheid trypsine en collagenase te wegen tot 50 mL conische buisjes (tabel 3).

2. dierlijke dissectie en bereiding van de suspensie van kiemcellen

Opmerking: Dit duurt ongeveer 1 uur om te voltooien.

1. Offer een volwassen mannelijke muis (leeftijd 7 weken of ouder, Testis gewicht 80 − 120 mg afhankelijk van de stam en leeftijd) via cervicale dislocatie of CO₂ asphyxiation.
2. Spray de ventrale buik van de muis met 70% ethanol. Open de abdominopelvic-holte met een schaar en maak een V-vormige opening.
3. Trekken op de epididymale Fat pad met Tang, lokaliseren van de teelballen en verwijder ze met een schaar. Vermijd het verstoren van het tunica albuginea. Leg de teelballen op een 6 cm Petri schaaltje met 1x Krebs.
4. Decapsulate de teelballen en gooi het tunica albuginea. De seminifereuze tubuli lichtjes dispergeren door ze zachtjes te plagen met een tang.
5. Gebruik de Tang voor het overbrengen van de seminifereuze tubuli in een conische buis van 50 mL met 2 mL vers bereide Collagenase oplossing (tabel 3).
6. Inbroed de tubuli in het waterbad van 37 °C gedurende 3 min. agitate zachtjes door de buis te rocken.
   Opmerking: Vrij zwevende tubuli moeten binnen 3 min optreden als gevolg van het verwijderen van interstitiële cellen. De fysiologische temperatuur voor testiculaire cellen is 34 °C; Daarom worden lange digestons meestal gedaan bij deze temperatuur. De korte spijsvertering van 3 minuten kan echter worden uitgevoerd bij 37 °C (aanbevolen temperatuur door de fabrikant). Merk op dat als 34 °C wordt gebruikt, de verterings tijd opnieuw moet worden geoptimaliseerd.
7. Voeg ten minste 40 mL warme 1x Krebs toe en laat de buisjes sediment (~ 1 min) bij kamertemperatuur (RT). Verwijder de supernatant en herhaal 1x.
8. Voeg 25 mL vers bereide trypsine-oplossing (tabel 3) toe, plaats de buis op de buis Rotator in de 34 ° c-incubator en incuberen 15 − 20 min (~ 15 rpm). Controleer sporadisch de status van de tubuli. Zodra de oplossing troebel wordt en slechts kleine stukjes tubuli blijven, plaats de buis op ijs en ga onmiddellijk door naar de volgende stap.
   Opmerking: Om overspijs vertering en cellysis te voorkomen, beweegt u snel naar de volgende wasstappen. Sommige protocollen omvatten de deactivering van trypsine door foetaal runderserum (FBS). In dit protocol wordt de behandeling met FBS weggelaten, en in plaats daarvan wordt trypsine verwijderd door onmiddellijke centrifugeren en daaropvolgende wassingen met koude 1x Krebs.
9. Filtreer de oplossing door een celzeef van 40 μm in een nieuwe conische buis van 50 mL op ijs.
10. Centrifugeer 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c om de cellen te pellet.
    Opmerking: Centrifugeren met een te sterke kracht kan schadelijk zijn voor de cellen.
11. Verwijder supernatant door het voorzichtig uit te gieten.
12. Tik op de celpellet om de cellen in de rest van 1x Krebs te hervatten.
13. Voeg ten minste 40 mL koude 1x Krebs toe aan de geresuspendeerde cellen.
14. Herhaal de stappen 2,10 en 2,11.
15. Tik op de buis met de celpellet om de cellen te hervatten. Voeg 1 mL 0,5% BSA toe in 1x Krebs en met een uitgesneden pipetpunt u de cellen hervatten door de oplossing op en neer te pipetteren. Vermijd het maken van bubbels.
16. Voeg ten slotte 1 − 3 mL 0,5% BSA in 1x Krebs toe, zodat het uiteindelijke volume ~ 3 mL is. Filtraat de suspensie voor kiemcellen door een celzeef van 40 μm en ga onmiddellijk verder met het laden van de cellen op de BSA-gradiënt.

3. scheiding van kiemcellen door de discontinue BSA-gradiënt

Opmerking: Deze sectie duurt ongeveer 2 uur om te voltooien. Begin met het voorbereiden van de discontinue BSA-gradiënt tijdens de wasstappen (stappen 2.10 − 2.14) om de cellen te laden zodra de voor behandeling klaar is.

1. Plaats een buis van 50 mL verticaal op ijs zodat het mogelijk is om één kant van de buis te zien. U het protocol ook uitvoeren in een koude kamer bij 4 °C, in welk geval er geen ijs nodig is.
2. Snijd de punt van een serologische Pipet van 10 mL ongeveer 5 − 10 mm van de punt om een groter diafragma (Figuur 1a) te verkrijgen en monteer het op de pipet controller (Figuur 1C).
   Opmerking: Dit zal de snelheid tijdens het pipetteren verminderen, wat het stapelen van de verschillende BSA-oplossingen vergemakkelijkt. U ook een mechanische Pipet van 1 mL met een gladde zuiger gebruiken en de pipetpunten knippen met een diafragma van ongeveer 3 mm in diameter (Figuur 1B).
3. Begin met het pipetteren van 5 mL 5% BSA-oplossing naar de bodem van de 50 mL-buis.
4. Pipet dan langzaam 5 mL 4% BSA-oplossing bovenop de 5%-oplossing. Begin met het zachtjes aanraken van het oppervlak van de 5%-oplossing met de snijpunt van de pipet en laag de twee oplossingen terwijl u het contact met het oppervlak zorgvuldig onderhoudt, zodat de pipetpunt niet kan worden ondergedompeld.
   Opmerking: Een duidelijke lijn moet zichtbaar zijn tussen de twee lagen aan het einde van deze stap.
5. Herhaal stap 3,4 met de andere BSA-oplossingen krijgen een discontinu verloop van 5% tot 1% (Figuur 1D).
6. Laad de eencellige suspensie voorzichtig bovenop de helling zonder te storen. Laat de cellen door de gradiënt sediment voor 1,5 h bij 4 °C of op ijs.

4. verzameling van verrijkte kiemcellen

Opmerking: Deze sectie duurt ongeveer 30 minuten om te voltooien.

1. Monteer een pipetpunt van 1 mL op een mechanische Pipet van 1 mL en snijd de punt zodanig dat het diafragma ~ 3 mm in diameter is (Figuur 1B).
2. Verzamel voorzichtig ~ 1 mL fracties in afzonderlijke 1,5 mL buisjes, beginnend vanaf de bovenkant van de BSA gradiënt, en bewaar ze op ijs. Het aantal buisjes in dezelfde volgorde als de fracties worden verzameld.
   Opmerking: Op dit punt, moet er een reeks van ~ 28 buizen met cel suspensies. Gebruik een mechanische Pipet van 1 mL met een gladde zuiger en snijd de pipetpunten om het risico op verstoring van de BSA-gradiënt te minimaliseren.
3. Centrifugeer de kiem fracties bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
4. Wees voorzichtig om de pellet niet te storen, gooi het grootste deel van het supernatant weg en regeer de celpellet door de buis te flikken. Voeg 1 mL ijskoude 1x Krebs buffer toe aan elke buis en herhaal centrifugeren.
   Opmerking: Herhaal de wasstap als BSA interfereert met de downstream-analyse.
5. Gooi het grootste deel van het supernatant weg, maar laat ~ 100 μL na de laatste wasbeurt. Respendeer de celpellet zorgvuldig.
   Opmerking: Door de cellen opnieuw op te schorten zorgt u ervoor dat het monster uit deze oplossing alle cellen van de opgegeven breuk vertegenwoordigt. Houd de celsuspensies op ijs tijdens het voorbereiden van de dia's.

5. analyse van Celbreuken

Opmerking: De analyse duurt 2 uur om te voltooien.

1. Een voor een pipet keer 20 μL van 4% Paraformaldehyde (PFA) in elke vetpen ring op een genummerde microscopie dia.
2. Voeg onmiddellijk 2 μL van de resuspendeerde celsuspensie uit de corresponderende Fractie toe. Herhaal dit voor elke breuk.
   Opmerking: Houd tijdens het voorbereiden van dia's alle celsuspensies op ijs.
3. Droog de glaasjes bij RT gedurende 1 uur tot 's nachts (O/N).
   Opmerking: Tijdens deze stap, na het nemen van een monster van elke fractie, kunnen de cellen worden verwerkt voor downstreamanalyses of opslag (sectie 6).
4. Spoel de dia's één keer met 1x PBS en monteer met een bevestigings medium met 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (tabel van de materialen).
5. Analyseer de dia's onder een fluorescentiemicroscoop om te schatten welk type kiemcellen in elke fractie is verrijkt.
   Opmerking: Verschillende celtypen kunnen worden herkend door hun karakteristieke nucleaire morfologie, gevisualiseerd door DAPI-kleuring. Figuur 2 A toont representatieve fracties verrijkt met rek spermatiden, ronde spermatiden en pachyteen spermatocyten. De ronde spermatid Nucleus is klein (6 − 7 μm in diameter) en rond (Figuur 2A). Muis ronde spermatid kernen worden ook gekenmerkt door een enkele, ronde heterochromatide structuur genaamd de chromocenter. Nuclei van rek-spermatiden hebben een typische langwerpige vorm en een gereduceerde nucleaire grootte als gevolg van chromatine condensatie (Figuur 2a). Pachytene spermatocyt kernen zijn veel groter (diameter meer dan 10 μm) en meer onregelmatig in vorm, met gebieden van dicht verpakt chromatine verdeeld over de hele (Figuur 2A).
6. Indien nodig, voert u naast de DAPI-kleuring ook immunokleuring uit ter ondersteuning van de herkenning van de verschillende celtypen.
   1. In dit geval, spreidt u 2 μl celsuspensie uit met 20 μl een bevestigingsoplossing (4% PFA en 0,1% nietionogene oppervlakteactieve stof in PBS) in een vetpen ring. Na het drogen van de dia's, postfix de cellen met 4% PFA voor 10 min bij RT.
   2. Spoel met PBS, vervolgens permeabilize met 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof in PBS gedurende 5 min. Spoel af met PBS en deactiveer eventuele resterende PFA door de glijbanen in 100 mM NH₄cl gedurende 5 min.
   3. Spoel af met PBS en ga verder naar een standaard immunofluorescentie protocol dat bestaat uit blokkering en incubaties met specifieke primaire antilichamen en met fluor chroom gelabelde secundaire antilichamen. Monteer de dia's met antifade inbedmiddel met DAPI (Inhoudsopgave) en laat ze voor 24 uur instellen.
      Opmerking: Voorbeelden van bruikbare markers voor primaire antilichaam incubaties zijn onder andere pinda agglutinines (PNA; 1:2000 in blokkerende oplossing) die de acrosome in ronde en rek bare spermatiden, anti-DDX4 antilichaam (1:200 in blokkerende oplossing) die een enkele cytoplasmatisch korrel in ronde spermatiden, en anti-γH2AX antilichaam (1:100 in blokkerende oplossing) die geslachtsorganen herkent in pachytene spermatocyten. Zie de representatieve resultaten en Figuur 2C, D voor voorbeelden van immunofluorescentie analyse van de fracties.

6. verwerking van de resterende monsters voor opslag

Opmerking: Sectie 6 duurt ongeveer 20 minuten om te voltooien.

1. Zodra een monster van elke fractie is genomen voor een microscopie dia, voeg 1 mL ijskoude 1x Krebs toe aan elke fractie en centrifugeer de cellen bij 600 − 13000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
   Opmerking: Een lage-snelheid centrifugeren resulteert in een losse pellet, wat het moeilijk maakt om 1x Krebs volledig te verwijderen, terwijl een hogesnelheidcentrifugeren de cellen kan beschadigen. Kies de centrifugeersnelheid volgens de specifieke eisen van het downstream protocol.
2. Verwijder en gooi het supernatant weg en ga verder met de voorkeur stroomafwaartse analyse.
   Opmerking: Op dit punt kunnen de cellen worden vastgevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij-70 °C. Eens bekend met deze techniek, is het mogelijk om direct door te gaan met het downstream Protocol van voorkeur, maar het is altijd aan te raden om een monster te nemen en de zuiverheid van elke fractie te waarborgen. Totaal RNA kan worden geëxtraheerd, gekwantificeerd en geanalyseerd volgens methoden zoals omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (PCR) en RNA-sequencing. Totaal eiwitextracten kunnen ook worden bereid waaruit immunoprecipitatie of westerse blotting analyse kan worden uitgevoerd (Figuur 3).

Resultaten

Een voldoende verrijking van een kiem celtype wordt gewoonlijk geacht boven 80%⁶te liggen. Het MDR-protocol werkt bijzonder goed voor het verrijken van ronde spermatiden. Een groot aantal > 90% zuivere ronde spermatiden kan routinematig worden verkregen met behulp van deze techniek. Optimale fracties van pachytene spermatocyten en rek spermatiden zijn verrijkt tot ~ 75% en ~ 80%, respectievelijk. Het verlengen van spermatiden neiging om op de top van de gradiënt te blijven en worden verzameld met de eerste breuk. In het getoonde voorbeeld bevatte breuk 1 ~ 80% van de rek-spermatiden (Figuur 2B). De meeste rek-spermatiden die met deze techniek zijn verkregen, hebben gecondenseerde kernen, terwijl niet-gecondenseerde vroege rek-spermatiden schaars zijn (Figuur 2A). De volgende fracties bevatten verrijkte ronde spermatiden. In het voorbeeld was de verrijking van ronde spermatiden meer dan 90% in fracties 2, 3 en 4, en werd verrijking boven 80% geheel in zeven fracties (2 − 8) (Figuur 2B) waargenomen. Door hun grote grootte, pachytene spermatocyten sneller sediment en worden de laatste verzameld. In het zuiverings voorbeeld bedroeg de verrijking ongeveer 75% in fracties 14 en 15 (Figuur 2B).

Hoewel nucleaire morfologie, gevisualiseerd door DAPI-kleuring, meestal voldoende is voor de herkenning van de cellen, kan immunofluorescentie analyse worden uitgevoerd om de analyse te ondersteunen. PNA kleurt de ontwikkelende en van ronde en rekbare spermatieën, en het acrosomale uiterlijk kan worden benut om ronde spermatieën verder te categoriseren in stappen 1 − 8 van differentiatie¹⁰. Het onderscheiden van PNA-gekleurd rek en ronde spermatiden berust op de verschillen in hun nucleaire vorm (Figuur 2C, linker paneel). Anti-DDX4 antilichaam is een nuttige marker voor de ronde spermatid fracties, omdat het een enkele DDX4-positieve perinucleaire korrel visualiseert, het chromatoïde lichaam (CB), in het cytoplasma van elke ronde spermatid. Deze CB-specifieke kleuring is gemakkelijk te onderscheiden van breder verspreide cytoplasmische kleuring in spermatocyten (Figuur 2C, middelste paneel). Pachytene spermatocyten kan worden herkend door anti-γh2ax antilichaam dat de nucleaire seks lichaam etiquette die specifiek op de pachyteen fase van de eerste Meiotische divisie verschijnt (Figuur 2C, rechter paneel). In deze zuivering onthulde PNA-kleuring dat MDR-verrijkt ronde spermatid-fracties een mengsel van ronde spermatiden bevatte in verschillende stappen van differentiatie, alle met hun kenmerkende structuur, de DDX4-positieve CB (Figuur 2D, RS-Fractie). Anti-γH2AX heeft de verrijking van pachytene spermatocyten in fractie 16 verder gevalideerd (Figuur 2D, pspc-Fractie).

De celtelling toonde aan dat het aantal cellen in de ronde spermatid-en pachytene spermatocyten-fracties voldoende is voor verschillende downstreamanalyses. Ronde spermatid fracties (5 − 8) die elk ongeveer 2,5 x 10⁶ cellen bevatten. Daarom, door het bundelen van deze fracties, is het mogelijk om meer dan 10.000.000 cellen te verkrijgen. Pachytene spermatocyt fracties (14 en 15) bevatten meestal iets minder cellen. In deze isolatie werden ongeveer 1,5 − 2,0 x 10⁶ cellen per breuk geteld. De eerste breuk bevatte 0,75 x 10⁶ verlengende spermatiden.

Zoals weergegeven in Figuur 3A, VARIEERDE het totale RNA-bedrag van de meerderheid van fracties van 0,5 − 2,5 μg, wat voldoende is voor downstream RNA-analyses zoals reverse transcriptie-PCR, RNA-sequencing of het visualiseren van RNA op een gel. De hoeveelheid eiwit verkregen uit elke fractie varieert meestal van 20 − 140 μg (Figuur 3B), wat voldoende is voor verschillende westerse blots. Hele cellijnen werden bereid uit verzamelde fracties en de analyse van Western Blot werd uitgevoerd met behulp van antilichamen die DDX4, PIWIL1 en PIWIL2 werden gedetecteerd, die allemaal sterk zijn uitgedrukt in pachytene spermatocyten en ronde spermatiden, evenals de alomtegenwoordige uitgedrukt Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH).

In dit protocol was 10% van de eiwithoudende lysaten afkomstig van enkelvoudige fracties voldoende om al deze eiwitten duidelijk op te sporen op een standaard Western Blot-instelling (Figuur 3C). De hoeveelheid eiwit in één fractie bleek ook voldoende te zijn voor immunoprecipitatie met een antilichaam tegen PIWIL1, alsook voor de opsporing van co-immunoprecipitated PIWIL2 (Figuur 3D). Bovendien is dit protocol met succes gebruikt voor het verkrijgen van verrijkte fracties van pachytene spermatocyten en ronde spermatiden van controle en genetisch gemodificeerde muizen voor downstreamtoepassingen zoals kwantitatieve reverse transcriptie PCR¹¹ en hoge doorvoer RNA-sequencing¹².

Figuur 1: voorbereiding van een discontinu BSA-verloop. A) eenserologische pipetpunt van 5 ml voor de bereiding van het verloop. B) een pipetpunt van 1 ml voor de bereiding van het verloop en de verzameling van de kiemcellen na sedimentatie. C) de uitrusting die nodig is voor de bereiding van de helling. D) zijdelingse weergave van de discontinu-dichtheid van de BSA, van de 5% (onder) tot de 1% (top) BSA-oplossing; de 2% en 4% BSA oplossingen zijn blauw van kleur voor een betere visualisatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: representatieve beelden van de verzamelde celfracties en de verrijkings analyse. (A) DAPI-gekleurd testiculaire cellen. De bovenste rij toont testiculaire cellen in het intacte seminifereuze epitheel van een PFA-vaste, paraffine ingesloten testis-sectie (links) of in suspensie (rechts). De onderste rij bevat fracties van verrijkte rek-spermatiden (ES), ronde spermatiden (RS) of pachyteen spermatocyten (PSpc). Schaal staven = 20 μm voor de bovenste rij en 10 μm voor inzetstukken van de onderste rij. B) de relatieve kwantificering van de verschillende typen kiemcellen in elke fractie. Cellen werden handmatig geteld met behulp van de ImageJ-software en geclassificeerd in RS, ES, PSpc, Sertoli-cellen en andere cellen. De breukgetallen en de respectieve percentages van BSA in het verloop worden aangegeven op de x-as. C) immunofluorescentie analyse van testiculaire cellen. Linker paneel: Rhodamine-gelabeld PNA vlekken de acrosome in zowel ES (gele pijl) en RS (witte pijl). Middelste paneel: DDX4 antilichaam vlekken een enkele perinucleaire korrel in RS, die is gemakkelijk te onderscheiden van de meer diffuse cytoplasmisch signaal in spermatocyten (blauwe pijl). Er wordt geen DDX4-signaal gedetecteerd in ES (oranje pijl). Rechter paneel: γH2AX antilichaam herkent de karakteristieke nucleaire geslachts opbouw die alleen aanwezig is in pachytene spermatocyten (γH2AX-negatieve cellen gemarkeerd met een wit sterretje). Schaal staven = 10 μm.D) MDR verrijkte celfracties werden GEËTIKETTEERD met PNA (RS-Fractie), anti-DDX4 (RS-Fractie) en anti-γH2AX (pspc-Fractie) om de celverrijking in elke fractie verder te valideren. Schaal staven = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: downstream-analyses na MDR-celverrijking. A) RNA werd uit elke fractie geëxtraheerd na een representatieve MDR-celverrijking en gekwantificeerd. De breukgetallen en de respectieve percentages van BSA in het verloop worden aangegeven op de x-as. B) eiwitten werden uit elke fractie gewonnen door lyseren van de celpellet in een radioimmunoprecipitation assay (Ripa) buffer dan gekwantificeerd. C) de extracten van gehele cellen werden bereid en geanalyseerd met behulp van antilichamen tegen DDX4, PIWIL1, PIWIL2 en gapdh door Western blotting. 10% van het lysaat werd van elke aangegeven breuk geladen. (D) immunoprecipitatie werd uitgevoerd vanuit aangegeven fracties met anti-PIWIL1, gevolgd door westerse blotting met anti-PIWIL1 en anti-PIWIL2 antilichamen. Het ingangs monster bevat een mengsel van eiwithoudende lysaten uit verschillende fracties, en de controle immunoprecipitatie (IP) met behulp van konijnen IgG werd ook uitgevoerd vanuit een gemengd lysaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: schematische weergave van het MDR-protocol en de benodigde tijd voor het voltooien van elke stap. Uitgangsmateriaal bestaat uit twee teelballen van een volwassen muis. Het gemiddelde aantal cellen en de hoeveelheid RNA en eiwitten die uit één fractie zijn verkregen, worden aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Buffer	Reagentia	Voorbereiding	Opslag
Krebs-buffer (10x)	3,26 g KH2po4	Breng naar 2 L met H2O, filter 0,22 μm en autoclaaf.	Kan gedurende enkele maanden bij 4 °C worden bewaard
	139,5 g NaCl
	5,89 g MgSO4 •7h2O
	50 g dextrose
	3,78 g CACL2•2H2O
	7,12 g KCl
Krebs-buffer (1x)	4,24 g NaHCO3	Los NaHCO3 op 100 ml H2o, voeg 200 ml van 10x Krebs buffer, en breng aan 2 L met H2o.	Om vers te worden bereid
	200 mL 10x Krebs buffer

Tabel 1: voorbereiding van de Krebs-buffer.

BSA-concentratie (w/v)	10% BSA oplossing	1x Krebs-buffer
0,50%	0,5 mL	9,5 mL
1	1 mL	9 mL
2	2 mL	8 mL
3	3 mL	7 mL
4	4 mL	6 mL
5	5 mL	5 mL

Tabel 2: bereiding van BSA-oplossingen.

Spijsvertering oplossing	Werkconcentratie	Reagentia	Voorbereiding
Collagenase	1 mg/mL	Collagenase IV	Weeg 2 mg Collagenase IV af op een conische buis van 50 mL en voeg 2 mL warme 1x Krebs-buffer vlak voor de spijsvertering toe (stap 2,3).
Trypsine	0,6 mg/mL	Trypsine	Weeg 15 mg trypsine af op een conische buis van 50 mL en voeg 25 mL warme 1x KREBS-buffer en 40 μL DNase I toe vlak voor de spijsvertering (stap 2,6).
	> 3.2 ku/mL	DNase I

Tabel 3: bereiding van de spijsverteringsenzymen.

Discussie

Hier gepresenteerd is een eenvoudig en goedkoop protocol om verrijkte populaties van ronde spermatiden te isoleren, pachytene spermatocyten, en rek spermatiden met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur (overzicht van het protocol getoond in Figuur 4). Hoewel er geen expertise of dure machines nodig zijn, zijn er enkele kritische stappen die moeten worden overwogen tijdens de vertering van het weefsel, de constructie van het verloop en het laden van de celsuspensie op het verloop.

Kiemcellen worden door twee opeenvolgende enzymatische digestonen vrijgelaten uit seminifereuze tubuli. De eerste spijsvertering met collagenase IV scheidt seminifereuze tubuli door het verwijderen van interstitiële cellen. Langdurige digestie tijd kan de tubuli beschadigen en leiden tot verlies van spermatiden, als (indien vrijgelaten uit de buisjes tijdens deze stap) ze zullen worden weggegooid in de volgende stappen. De tweede digestie stap met trypsine brengt kiemcellen uit de seminifereuze tubuli. Er kunnen af en toe cellyse zijn en meestal enkele klonten vorm als gevolg van vrijgegeven genomisch DNA. Overschrijding van de voorgestelde duur of temperatuur van de spijsvertering wordt niet geadviseerd, omdat dit kan leiden tot slechtere levensvatbaarheid, verhoogde cellysis, en klonteren. Als er milde klontering optreedt, kunnen de klontjes worden genegeerd. Echter, in gevallen van aanzienlijke klontering en verlies van cellen, trypsine digestie tijd of concentratie moet worden verlaagd. Ook moet worden opgemerkt dat de enzymatische activiteit van trypsine kan variëren tussen batches en tijdens langdurige opslag tijden. De hoeveelheid DNase I tijdens trypsine-spijsvertering kan ook worden verhoogd om overtollige klonters te verwijderen, maar dit moet worden beschouwd als een secundaire oplossing. Het is belangrijk om aan het einde van de voor behandeling een homogene eencelsuspensie te verkrijgen, aangezien samengeklonteerde cellen sneller zullen bezeren, de fracties vervuilend en het verloop verstoren.

Het opbouwen van het verloop kan enige oefening vergen. Als er ongemak is met een pipetpunt van 5 mL met een pipet controller, is het raadzaam om een normale 1 mL mechanische pipet met een gladde zuiger te gebruiken en vervolgens de pipetpunten te knippen tot een diafragma van ~ 3 mm in diameter (Figuur 1B). Een breder diafragma en een soepele belasting van de BSA-oplossingen zal het risico op het mengen van het verloop verminderen. Wanneer goed voorbereid, is het mogelijk om de grenzen te zien tussen de aangrenzende BSA oplossingen als gevolg van hun verschillende brekingsindices. Het verloop moet direct vóór gebruik worden geproduceerd. Ook moet worden opgemerkt dat een klein schudden of trillen de helling kan verstoren, zodat het verloop moet worden ingesteld in een omgeving waar het niet zal worden verstoord.

Het laden van de celsuspensie op het verloop moet zeer zorgvuldig gebeuren. Na het laden moet de celsuspensie bovenop de gradiënt blijven, waarvan de cellen langzaam door de eerste laag zullen gaan bezinksel. Als grote groepen cellen snel door het verloop worden gezien, werden de cellen waarschijnlijk niet zorgvuldig geresuspendeerd of is er sprake van overmatige klontering. Als de cellen na het laden niet op de bovenkant van de discontinue BSA-gradiënt blijven, maar onmiddellijk tussen de 1% en 2% BSA-lagen (stap 3,6) zinken, is de celsuspensie waarschijnlijk te dicht. Dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van twee teelballen van een volwassen muis (80-120 mg/testis) als uitgangsmateriaal; Hoewel, succesvolle isolaties met behulp van verminderde hoeveelheid startmateriaal is uitgevoerd. Om het protocol te kunnen opschalen en meer verrijkte kiemcellen te verkrijgen uit hogere aantallen teelballen, moeten meer 50 mL buisjes met de gradiënt worden geïntroduceerd.

Het protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld en geoptimaliseerd om haploïde ronde spermatiden te verrijken van volwassen muis testes, en de zuiverheid van ronde spermatid fracties wordt naar verwachting meer dan 90%. Naast zeer zuivere ronde spermatid fracties werden bevredigende resultaten verkregen voor de verrijking van pachyteen spermatocyten en rek-spermatiden. Opgemerkt moet worden dat erytrocyten de rek-spermatid fracties kunnen verontreinigen, en verdere stappen om deze te elimineren moeten worden genomen als hun aanwezigheid naar verwachting interfereert met downstreamanalyses. We zijn niet in staat geweest om andere celtypen, zoals premeiotische of vroege Meiotische cellen (vóór de pachytene-fase) van volwassen muizen te verrijken met het MDR-protocol.

Bovendien is de STA-PUT sedimentatie met succes gebruikt voor het verkrijgen van verrijkte fracties van spermatogonie of preleptotene, leptotene en zygotene spermatocyten met behulp van juveniele teelballen verzameld op bepaalde tijdstippen na de geboorte¹³. Deze aanpak maakt gebruik van het uiterlijk van deze celtypen tijdens de eerste golf van spermatogenese. Dezelfde aanpak kan waarschijnlijk worden toegepast op MDR-verrijking, maar is in de praktijk nog niet getest. Een andere methode die een goede optie is voor de zuivering van premeiotische en Meiotische cellen in specifieke stadia van differentiatie is FACS, die het belangrijke voordeel heeft van het toestaan van de isolatie van specifieke cellen typen op basis van de aanwezigheid specifieke markers^{14 ,15,16,17}.

In het algemeen dient de MDR-snelheids sedimentatie als een nuttige methode voor de verrijking van kiemcellen. Hoewel deze methode niet superieur is aan andere gevestigde methoden in termen van de zuiverheid of kwantiteit van verrijkte cellen, zijn duidelijke voordelen de eenvoud en lage set-up kosten. Dit, samen met de lage hoeveelheid vereiste uitgangsmaterialen, maken dit protocol een geweldige optie voor onderzoekers in de spermatogenese veld en die in andere gebieden die misschien niet willen investeren in gespecialiseerde hardware of grote groepen van dieren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4% Paraformaldehyde	Voorkeur van onderzoeker
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A-31571
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9647
CaCl2·2H2O	Voorkeur van onderzoeker
Collagenase IV	Sigma	C5138
Complete protease inhibitor cocktail	Roche	11836145001
DDX4 antibody	Abcam	ab13840
Dextrose	Voorkeur van onderzoeker
DNase I	Worthington	LS006355
GAPDH	HyTest	5G4
HRP-linked anti-mouse IgG	GE Healthcare Life Sciences	NA931
HRP-linked anti-rabbit IgG	GE Healthcare Life Sciences	NA934
KCl	Voorkeur van onderzoeker
KH2PO4	Voorkeur van onderzoeker
MgSO4·7H2O	Voorkeur van onderzoeker
NaCl	Voorkeur van onderzoeker
NaHCO3	Voorkeur van onderzoeker
NH4Cl	Voorkeur van onderzoeker
Pierce BCA protein assay kit	Life Technologies	23227
PIWIL1	Cell Signaling Technology	G82
PIWIL2, clone 13E-3	Millipore	MABE363
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36962	voor Alexa Fluor immunokleuringen
Rabbit IgG	Neomarkers	NC-100-P
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)	Vector Laboratories	RL-1072
RIPA buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0,5% w/v natriumdeoxycholaat, 0,05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x proteaseremmercocktail, 0,2 mM PMSF en 1 mM DTT
TRIsure	Bioline	BIO-38033
Triton X-100	Voorkeur van onderzoeker		nonionogene oppervlakteactieve stof
Trypsin	Worthington	LS003703
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	voor standaard DAPI-analyse van celfracties
γH2AX antibody	Millipore	05-636
0,22 µm filter	Sartorius	Sartolab BT 180C6	of equivalent
1 mL mechanische pipet	Voorkeur van onderzoeker
1,5 mL of 2 mL buisjes	Voorkeur van onderzoeker
40 µm celzeef voor 50 mL buisjes	Greiner Bio-One	542040	of equivalente celzeven
5 mL serologische pipetten	Sarstedt	86.1254.001	of equivalent
50 mL conische buisjes	Voorkeur van onderzoeker
6 cm Petri schotels	Voorkeur van onderzoeker
Celcultuur incubator	Voorkeur van onderzoeker
Centrifuge voor 50 mL buisjes	Voorkeur van onderzoeker
Vetpen voor microscoopglazen	Voorkeur van onderzoeker
HulaMixer Sample Mixer	Thermo Fisher Scientific	15920D	of equivalent celrotator
Microdissectietang	Voorkeur van onderzoeker
Microdissectie schaar	Voorkeur van onderzoeker
Microscoopglazen en dekvlakken	Voorkeur van onderzoeker
Nanodrop 1000	Thermo Scientific
Pipetboy Acu 2	Integra	155 000	of equivalent pipetregelaar
Gekoelde centrifuge voor 1,5 mL buisjes	Voorkeur van onderzoeker
Tips voor 1 mL mechanische pipet	Voorkeur van onderzoeker
Waterbad	Voorkeur van onderzoeker
Widefield fluorescentiemicroscoop	Voorkeur van onderzoeker