De co-cultuur interactie testen gepresenteerd in dit protocol zijn goedkoop, hoge doorvoer, en eenvoudig. Deze testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties in co-cultuur te observeren, interactie patronen te identificeren en het remmende potentieel van een microbiële stam van belang tegen menselijke en milieu pathogenen te karakteriseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De studie van interacties tussen micro-organismen heeft geleid tot tal van ontdekkingen, van nieuwe antimicrobiële stoffen tot inzichten in microbiële ecologie. Veel benaderingen die worden gebruikt voor de studie van microbiële interacties vereisen gespecialiseerde apparatuur en zijn duur en tijd intensief. Dit artikel presenteert een protocol voor co-cultuur interactie testen die goedkoop, schaalbaar zijn tot grote sample-nummers, en gemakkelijk aanpasbaar aan tal van experimentele ontwerpen. Micro-organismen worden samen gekweekt, waarbij elk goed één paarsgewijze combinatie van micro-organismen vertegenwoordigt. Een testorganisme wordt aan één zijde van elk goed gekweekt en eerst geïnineerd in monocultuur. Vervolgens worden doelorganismen gelijktijdig op de tegenoverliggende zijde van elke put geënt met behulp van een 3D-gedrukte inoculatie stempel. Na co-cultuur worden de voltooide testen gescoord voor visuele fenotypes, zoals groei of remming. Deze testen kunnen worden gebruikt om fenotypes te bevestigen of patronen te identificeren tussen isolaten van belang. Met deze eenvoudige en effectieve methode kunnen gebruikers combinaties van micro-organismen snel en efficiënt analyseren. Deze co-cultuur aanpak is van toepassing op antibiotica ontdekking, evenals op cultuur gebaseerde microbiome onderzoek en is al met succes toegepast op beide toepassingen.
Inleiding
In de natuur bestaan micro-organismen zelden geïsoleerd; Dientengevolge, ze zijn voortdurend interactie met andere organismen. Daarom is het essentieel om een veelheid van microbiële gedragingen te begrijpen1, om te bestuderen hoe micro-organismen met elkaar omgaan. Microbiële interacties kunnen mutualistisch, commensaal of antagonistisch zijn. Deze in teractions kan invloed hebben op niet alleen de micro-organismen zelf, maar ook de omgevingen en hosts die de micro-organismen koloniseren1,2.
Veel wetenschappers bestuderen microbiële interacties om nieuwe antimicrobiële moleculen te identificeren. Een van de eerste klinisch belangrijke antimicrobiële moleculen werd gevonden door de studie van microbiële interacties. Sir Alexander Fleming observeerde een contaminerend Penicillium spp. isolaat dat de groei van een Staphylococcus -stam inhiemde, wat leidde tot de ontdekking van de veelgebruikte antibiotica penicillaire3. Karakterisering van de mechanismen die micro-organismen gebruiken om hun concurrenten te antagoniseren blijft een vruchtbare bron voor de ontdekking van antimicrobiële moleculen. Bijvoorbeeld, het werd onlangs aangetoond dat Streptomyces SP. stam Mg1 produceert antibioticum linearmycinen, die hebben een lytische en degradatieve activiteit tegen Bacillus subtilis4.
Verder werd een niet-ribosomaal gesynthetiseerd peptide, genaamd lugdunin, onlangs ontdekt na de constatering dat de nasale commensale Staphylococcus Lugdunensis Staphylococcus aureus5remt. Studies hebben ook aangetoond dat mutualistische interacties tussen micro-organismen even krachtig zijn als antagonistische interacties voor de ontdekking van antimicrobiële moleculen. Bijvoorbeeld, veel schimmel-landbouw mieren in de stam attini haven symbiotische bacteriën genoemd pseudonocardia op hun exoskelet die schimmelwerende moleculen produceert voor de remming van een verplicht pathogeen van hun schimmel gewas6. Omdat de studie van microbiële interacties gunstig is geweest voor het ontdekken van antimicrobiële moleculen, kan het gebruik van hoge doorvoer schermen resulteren in de ontdekking van nieuwe antimicrobiële moleculen.
Met betrekking tot de kosten en het gemak van de prestaties, de methoden die worden gebruikt voor het bestuderen van microbiële interacties variëren van eenvoudig tot complex. Een agar-plug assay is bijvoorbeeld een goedkope en eenvoudige methode die kan worden gebruikt om antagonisme tussen meerdere micro-organismen7te onderzoeken. Een agar-plug assay is echter geen efficiënte procedure en kan arbeidsintensief zijn voor veel Pairwise-combinaties. Om de effecten van microbieel geproduceerde producten op doel isolaten van belang in een hoge doorvoer manier te beoordelen, gebruiken veel laboratoria schijf diffusie testen8. Deze assays zijn gemakkelijk en goedkoop en kunnen schaalbaar zijn tot hogere aantallen monsters7. Deze bepaling vereist echter het opwekken van microbiële extracten en kan misleidende resultaten opleveren voor bepaalde combinaties van doelorganismen en antibiotica, zoals salmonella en cefalosporinen9.
De voorgaande benaderingen zijn afhankelijk van geïsoleerde componenten om een reactie te lokken in een doelorganisme, in plaats van het toestaan van micro-organismen om met elkaar te communiceren. Dit is van merk, omdat de interacties tussen microben kan de productie van "cryptische" antimicrobiële moleculen die niet worden geproduceerd in monocultuur ontlokken. Bijvoorbeeld, het werd onlangs aangetoond dat de antimicrobiële keyicin alleen wordt geproduceerd door een Micromonospora SP. Wanneer co-gekweekte met een Rhodococcus SP. dat is geïsoleerd van dezelfde spons microbiome10. Complexere interactie methodieken omzeilen deze potentiële monocultuur belemmering. De iChip is bijvoorbeeld handig voor het isoleren van zeldzame en moeilijk te kweken bacteriën uit milieu monsters en maakt het mogelijk om microbiële interacties te observeren door middel van groei in situ11. Om interacties in detail te onderzoeken, kan matrix geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-Flight Imaging Mass spectrometrie (MALDI-TOF-IMS) worden gebruikt. Deze aanpak biedt gedetailleerde informatie over de samenstelling en distributie van kleine moleculen en peptiden geproduceerd door het interageren van microbiële kolonies met een hoge ruimtelijke resolutie. MALDI-tof-IMS is ook gebruikt in meerdere studies van bacteriële interacties om de mechanismen van de competitie te karakteriseren12,13,14,15. Echter, MALDI-TOF-IMS vereist vaak bewerkelijk monstervoorbereiding, gespecialiseerde expertise om de apparatuur te bedienen, en dure en gespecialiseerde massaspectrometers. Om deze redenen is het een moeilijke techniek om te gebruiken voor studies met een hoge doorvoer. Dus, een eenvoudige, schaalbare en co-cultuur test met hoge doorvoer voor microbiële interacties die veel beperkingen van de bovenstaande benaderingen overkomt, zou gunstig zijn.
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een hoge doorvoer van microbiële co-cultuur. Deze test is eenvoudig en gemakkelijk te integreren in reeds bestaande onderzoeken naar microbiële interacties. In tegenstelling tot veel veelgebruikte methoden voor de studie van microbiële interacties, onze methode is eenvoudig, goedkoop, en is vatbaar voor onderzoek naar grote aantallen interacties. Deze testen zijn niet alleen gemakkelijk uit te voeren, maar de materialen zijn op grote schaal verkrijgbaar bij de meeste laboratorium leveranciers of openbare bronnen (bijv. bibliotheken en makerspaces). Bijgevolg is deze test voordelig als een eerste onderzoekslijn om interessante patronen te identificeren en te parseren tussen vele combinaties van micro-organismen, die vooral nuttig kunnen zijn voor het onderzoek naar microbiële ecologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de ouders van de donor en het Comité voor de menselijke proefpersonen van de Universiteit van Wisconsin-Madison keurde het onderzoek goed (institutioneel Beoordelingsbord [IRB] goedkeuringsnummer H-2013-1044).
1. monster cultuur
Opmerking: Deze procedure wordt hier gebruikt voor de studie van interacties tussen bacteriën isolaten uit de menselijke neusholte. In principe zijn de volgende methoden van toepassing op elke cultuur voorwaarde. Hersenen-hart-infusie Bouillon (BHI) wordt gebruikt voor algemene vermeerdering van nasale bacteriën. Alle platen worden met 1,5% agar gestijgd. Voor deze studie worden monsters genomen van een zoute oplossing die in de neus van een donor wordt gespoeld (nasale spoeling), overgebracht naar micro centrifugebuizen en bevroren bij-80 °C.
- Gebruik standaard kweektechnieken om 100 μL van elk van de ontdooide spoeling monsters op BHI-platen te plaat.
- Inbroed de platen gedurende 1 week aëroob bij 37 °c.
- Na incubatie, selecteer ≥ 2 kolonies van elk afzonderlijk morfoype per plaat en doorgang de isolaten aëroob op BHI platen door het strepen van een kolonie van de eerste plaat op een nieuwe BHI plaat en het incuberen van de plaat bij 37 ° c. Herhaal dit tot de bacterieculturen zuiver zijn.
Opmerking: Bacteriële isolaten kunnen worden geïdentificeerd door middel van kolonie morfologie, Gram-kleuring, 16S rRNA gensequencing, of een andere methode. Het is echter niet nodig de identiteit van de isolaat te kennen om het protocol voort te zetten. - Cryopreserve alle bacteriële isolaten bij-80 °C na het combineren van 1 mL 50% glycerol met 1 mL bacteriële nachtelijke cultuur (zie rubriek 3) in cryotubes.
2.3D Printing stempels
Opmerking: Polycarbonaat werd geselecteerd als het stem materiaal vanwege de hoge Glasovergangstemperatuur (147 °C) die de standaard autoclaaf temperaturen (121 °C) overschrijdt, waardoor de kans op vervorming na herhaald gebruik tot een minimum wordt beperkt.
- Laad de 3D-printer met polycarbonaat filament.
- Breng witte school lijm (Polyvinyl acetaat) aan op het printbed om te helpen in de hechting en Minimaliseer het kromtrekken van het inoculatie stempel tijdens de afdruk.
- Laad de. STL-model bestand (aanvullend gegevensbestand) voor het inoculatie stempel (Figuur 1) in de 3D-printersoftware.
- Druk de inoculatie stempel af bij een 290 °C nozzle-temperatuur, 60 °C bed temperatuur en laag hoogte van 0,38 mm.
- Wikkel de stempel in de aluminiumfolie en steriliseren door Autoclaveren voor 1,5 h op een zwaartekracht cyclus met 15 min drogen.
Opmerking: Hoewel polycarbonaat hygroscopisch is, behouden de postzegels slechts ongeveer 0,5% water gewicht na autoclaven.
3. bereiding van de nachtelijke culturen
- Pipetteer 3 mL steriele BHI-Bouillon in 14 mL kweek buizen met behulp van een serologische pipet.
- Gebruik een steriele 1 μL inoculerende lus en laat een bacterie kolonie in de Bouillon inenten. Zwenk de lus om ervoor te zorgen dat de klomp in de Bouillon verspreidt. Vortex de kweek buizen kort voor incubatie.
- Incuberen de kweek buizen bij 37 °C 's nachts (~ 16 uur) op een shaker bij 250 rpm.
- Vortex om de klonters van cellen te breken zodra de bacteriële culturen voldoende troebelheid bereiken (OD600 ≥ 1).
4. bereiding van de bioassay platen
Opmerking: Bioassay platen worden bereid in een laminaire flow kap om de steriliteit te behouden.
- Bereid BHI-media met 1,5% agar en steriliseren door autoclaven volgens de instructies van de fabrikant.
- Koel na autoclaven de BHI-media af tot 55 °C in een waterbad met temperatuurregeling.
- Pipetteer met behulp van een serologische pipet 3 mL gesmolten BHI-media in elk van de 12 putjes op een 12-putplaat. Zorg ervoor dat de putten zo exact en zelfs mogelijk zijn. Een liter media zal ~ 27 bioassay platen opleveren.
- Laat de agar 's nachts instellen.
5. inoculerende bioassay platen met het test organisme
Opmerking: Een testorganisme verwijst naar het organisme waarvoor de productie van remmende activiteit (bijv. antibiotica productie) wordt bepaald met behulp van de co-Culture interaction assay. Voor dit experiment zijn de testorganismen Actinobacteria geïsoleerd uit nasale lavages monsters.
- Beënt het testorganisme op een bioassay plaat door een steriele 10 μL inoculerende lus in de nachtelijke kweek te plaatsen en een kweek druppel over het linker derde deel van een plaat goed te strepen.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om slechts een derde van de put te streak, als overmatige groei van de goed verbiedt later inoculatie van doelorganismen. - Herhaal dit totdat alle 12 putjes op de plaat met het testorganisme zijn inocculeerd.
- Incuberen de platen gedurende 7 dagen op de juiste temperatuur. Bij hogere temperaturen (≥ 37 °C) of in drogere klimaten, bewaar de platen in een vochtige verpakking om te voorkomen dat de platen uitdrogen.
6. bereiding van doelorganismen
Opmerking: Een doelorganisme verwijst naar het organisme waarvan de inhibitie status wordt bepaald met behulp van de co-Culture interaction assay. Voor dit experiment zijn de doelorganismen Staphylococcus spp. geïsoleerd uit nasale lavages monsters.
- Nadat de bioassay-platen gedurende 6 dagen zijn gebroed, bereidt u de nachtelijke culturen van de gespecificeerde doelorganismen voor, zoals hierboven is gedaan (zie rubriek 3).
7. doelorganisme-inoculatie
Opmerking: Na een nachtelijke incubatie, zorg ervoor dat de culturen troebel zijn (OD600 ≥ 1). Sommige bacteriële culturen kunnen vlokken aan de onderkant van de cultuur buis. Vortex de cultuur buizen om klonters te dispergeren en de cultuur troebelheid te beoordelen.
- Bereid de doelplaat voor door elke put van een lege 12-put plaat te vullen met 1,8 mL BHI en 200 μL van de beoogde nachtelijke kweek.
- Wikkel en plaats een steriel inoculatie stempel in de doelplaat. Zwenk de culturen zachtjes rond in de putten en zorg ervoor dat de culturen de naburige putten niet besmetten.
- Til de inoculatie stempel en zorg ervoor dat er een druppel van de verdunde doel cultuur op elke postzegel punt zit.
-
Maak een monocultuur controle plaat door het inoculatie stempel op een niet-inocculeerde bioassay plaat te plaatsen en de stempel voorzichtig te rocken, zodat een kweek druppel elk goed inoculseert. Zodra het inoculatie stempel is verwijderd, moet een druppel van cultuur zichtbaar zijn in de putjes van de bioassay plaat.
- Als er geen putjes zijn geënt met de inoculatie stempel als gevolg van oneffen media, spot dan 3 μL van de verdunde overnachtings cultuur aan de rechterkant van de putjes met behulp van een pipet.
- Beënt de bioassay platen zoals hierboven gedaan (zie stap 7.4.1), maar lijn de stempel zo uit dat de uiteinden uitgelijnd zijn met de rechterkant van de 12 goed plaat. Zorg ervoor dat de postzegel geen contact met de bestaande bacteriële kolonie bij het inoculeren van de putten.
- Verwijder voorzichtig de stempel en plaats deze terug in de doelplaat.
- Herhaal de inoculatie voor elke bioassay-plaat totdat alle platen zijn inocculeerd.
- Incuberen de bioassay platen gedurende 7 dagen op de juiste temperatuur.
8. scoren
-
Na de co-culturing van de test en doelorganismen gedurende 1 week, scoor de interacties op basis van de volgende visuele beoordeling:
- Scoor de putten met de groei van het doelorganisme die de groei vertoont die niet te onderscheiden is van de monocultuur controle als "0" (geen remming) (Figuur 2A, B).
- Scoor de putten met het doelorganisme dat verminderde groei vertoont ten opzichte van de controle als "1" (zwakke remming) (Figuur 2C).
- Scoor de putjes waar het doelorganisme niet opgroeit als "2" (sterke remming) (Figuur 2D).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Co-cultuur interactie testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties te begrijpen, patronen van belang te identificeren en microbiële isolaten met intrigerende activiteiten te ontdekken. In deze onderzoeken is een testorganisme monocultureerd aan één zijde van een 12 well agar-plaat en gedurende 7 dagen geïnpoleerd. Vervolgens wordt een doelorganisme naast het testorganisme gespot en werden de twee microben gedurende 7 dagen vóór het scoren voor het groei fenotype van het doelorg...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Antibiotica en andere secundaire metabolieten die microbiële interacties bemiddelen, zijn nuttig voor een veelheid aan toepassingen, waaronder het opsporen van geneesmiddelen. Hierin wordt een protocol voor co-Culture-assays gepresenteerd om grote aantallen microbiële interacties te beoordelen. Deze co-cultuur interactie assays zijn een eenvoudige, betaalbare, schaalbare en hoge doorvoer middelen om te onderzoeken veel Pairwise combinaties van micro-organismen in tandem. Doelorganismen worden naast testorganismen in een ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
We danken Daniel May, Marc Chevrette en Don Hoang voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk, met inbegrip van de inspanningen van Cameron R. Currie, werd gesteund door de Universiteit van Wisconsin-Madison, kantoor van de vice-kanselier voor onderzoek en Graduate Education met financiering van de Wisconsin Alumni Research Foundation, financiering ook verstrekt door de National Institutes of Health Centers for Excellence voor translationeel onderzoek (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck werd gesteund door een nationale bibliotheek van geneeskunde opleiding subsidie aan de berekening en informatica in biologie en geneeskunde opleiding programma (NLM 5T15LM007359). De financiers hadden geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en interpretatie, of de beslissing om het werk voor publicatie in te dienen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
Referenties
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234(2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226(1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722(2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516(2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
