In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

Samenvatting

Decennia van onderzoek in veel model organismen hebben geleid tot het huidige concept van synaptische plasticiteit onderliggende leren en Geheugenvorming. Learning-geïnduceerde veranderingen in de synaptische transmissie zijn vaak verdeeld over vele neuronen en niveaus van verwerking in de hersenen. Daarom, methoden voor het visualiseren van leer afhankelijke synaptische plasticiteit over neuronen nodig zijn. De fruitvlieg Drosophila melanogaster vertegenwoordigt een bijzonder gunstig modelorganisme om neuronale circuits onderliggende leren te bestuderen. Het protocol hier gepresenteerd toont een manier waarop de processen die aan de vorming van associatieve reuk geheugens, dat wil zeggen, synaptische activiteit en hun veranderingen, kunnen worden gemonitord in vivo. Met behulp van de brede waaier van genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila, is het mogelijk om genetisch gecodeerde calcium indicatoren expliciet uit te drukken in bepaalde celpopulaties en zelfs enkelvoudige cellen. Door het bevestigen van een vlieg op zijn plaats, en het openen van de hoofd capsule, is het mogelijk om de calcium dynamica in deze cellen te visualiseren terwijl olfactorische stimuli worden gegeven. Daarnaast demonstreren we een set-up waarin de vlieg gelijktijdig kan worden blootgesteld aan elektrische schokken aan het lichaam. Dit biedt een systeem waarin vliegen klassieke olfactorische conditionering kan ondergaan-waarbij een eerder naïeve geur wordt geleerd te worden geassocieerd met elektrische schok straf-op hetzelfde moment als de representatie van deze geur (en andere ongetrainde geuren) is waargenomen in de hersenen via twee-photon microscopie. Ons laboratorium heeft eerder de generatie van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren gerapporteerd, waardoor men de fluorescerende calcium signalen kan beperken tot pre-of postsynaptische compartimenten. Two-photon microscopie biedt een manier om ruimtelijke structuren op te lossen. We illustreren dit door te focussen op neuronen die informatie van het paddestoel lichaam integreren, een hoger-orde centrum van het insecten brein. Over het algemeen, dit protocol biedt een methode voor het onderzoeken van de synaptische verbindingen tussen neuronen waarvan de activiteit wordt gemoduleerd als gevolg van reuk leren.

Inleiding

Ontcijferen waar en hoe de informatie wordt verworven in de hersenen door te leren en vervolgens opgeslagen als geheugen vormt een van de meest uitdagende taken in neurowetenschappen¹. Neurowetenschappelijk onderzoek heeft geleid tot het concept van een verandering in de synaptische transmissie als de neuronale substraat dat ten grondslag ligt aan leren en Geheugenvorming^2,3. Het is veronderstelde dat, tijdens het leren, synaptische verbindingen tussen neuronale ensembles die actief zijn tijdens de perceptie van een stimulus zodanig worden gewijzigd dat hun gecombineerde activiteit patroon kan worden opgehaald tijdens geheugen terugroepen, waardoor het instrueren toekomstige gedrags actie⁴. Deze "engram cellen" en hun synapsen zijn vaak verdeeld over hersengebieden en niveaus van verwerking, waardoor het moeilijk is om waargenomen veranderingen in synaptische transmissie toe te wijzen aan het leren van een taak of een stimulus. Om te lokaliseren en visualiseren van die synaptische veranderingen die causaal gekoppeld aan een specifieke leer taak men moet een juiste modelsysteem dat het mogelijk maakt voor het nauwkeurig beperken van die synapsen.

Voor een dergelijke inspanning is Drosophila melanogaster bijzonder geschikt omdat het relatieve hersen eenvoud, gedrags rijkdom en experimentele toegankelijkheid combineert. Onder de gevestigde model organismen, Drosophila is gelegen tussen de nematode C. elegans en genetisch Tractable zoogdieren zoals muizen in termen van neuronale complexiteit. Het type aantal neuronen (~ 300) en het beperkte gedrags repertoire wordt waargenomen bij C. elegans. Zoogdieren, aan de andere kant, hebben miljoenen neuronen en duizelingwekkende gedrags complexiteit. De hersenen van de fruitvlieg is, met zijn ~ 100.000, neuronen aanzienlijk kleiner dan de hersenen van de meeste gewervelde dieren, en veel van de neuronen zijn individueel identificeerbaar⁵. Toch toont Drosophila een breed spectrum van complexe gedragingen, waaronder een vermogen om robuuste associatieve olfactorische leer-en Geheugenvorming te vertonen, die voor het eerst werd beschreven 40 jaar geleden⁶. In de loop van deze klassieke conditionerings procedure worden groepen vliegen onderworpen aan een geur als de geconditioneerde stimulus (CS⁺) terwijl ze een punierende elektrische schok krijgen als de ongeconditioneerde STIMULUS (VS). Een tweede geur (CS^-) wordt dan gepresenteerd zonder straf. Daardoor leren de dieren om de geur geassocieerd met de straf te vermijden, die kan worden getest in een latere keuze situatie tussen de twee geuren, CS⁺ en CS^-. Werk aan het ontleden van de neuronale substraat onderliggende dit gedrag in Drosophila heeft de paddestoel lichamen geïdentificeerd (MB) als de primaire site van de "engram"^7,8,9,10 en daarom, de circuits van dit hersengebied was en is het onderwerp van intens onderzoek om de logica te achterhalen waarmee een geheugen-engram wordt verworven en opgeslagen (onlangs beoordeeld in^11,12).

De Drosophila MB bestaat uit ~ 2.000 intrinsieke neuronen (Kenyon cellen) per halfrond, georganiseerd in parallelle axonale projecties¹³. Axonen van olfactorische projectie neuronen worden uitgebreid naar de laterale protocerebra en naar de MB calyces, de belangrijkste dendritische ingangs plaats van de MB en ontvangen olfactorische input van antennal lobben. De lange, parallelle axonen-bundel van Kenyon-cellen vormen de bloem en de lobben. De meeste Kenyon-cellen vormen horizontale β/β'-lobben door een onderpand uit te breiden naar de middenlijn van de hersenen, en de verticale α/α'-lobben door het uitbreiden van tweede onderpand dat projecteren in de dorsale-anterieure richting. De andere groep van Kenyon cellen vormt de horizontale γ-lobben¹³ van de MB waar het leerproces en de daaropvolgende korte-termijn Geheugenvorming zou kunnen worden gelokaliseerd¹⁰. De MB-lobben krijgen een afferente input en zorgen voor een efferente output, die beide meestal beperkt zijn tot verschillende compartimentele subregio's langs de Kenyon Cell axonen^14,15,16. In het bijzonder is aangetoond dat de afferente Dopaminerge MB-input neuronen bemiddel op waarde gebaseerde, bijvoorbeeld, punitieve, versterkende effecten in associatieve reuk Learning^15,17. Stereotypic en individueel identificeerbare efferente MB-output neuronen uit de paddestoel Body lobben integreren informatie over grote aantallen Kenyon cellen, richten diverse hersengebieden en dragen gedrag-leerzame eetlust of aversieve informatie¹⁵ . Deze neuronale architectuur heeft geleid tot een concept van de organisatie van het associatieve engram. Geuren zijn relatief nauwkeurig gecodeerd door dun geactiveerde ensembles van Kenyon-cellen. De samenvallen activiteit van deze Kenyon celensembles en het vrijkomen van dopamine-opgeroepen door het straffen van stimuli-moduleert transmissie van Kenyon Cell presynapses op MB uitgangs neuronen zodanig dat de dieren vervolgens deze bijzondere geur zal vermijden^{10 ,12}. We gebruiken dit nogal nauwkeurig gedefinieerde en gelokaliseerde engram als een paradigmatische zaak om te illustreren hoe deze leer afhankelijke veranderingen in synaptische activiteit kunnen worden bepaald en gemonitord.

De waarde van Drosophila als modelsysteem is sterk afhankelijk van de ongeëvenaarde genetische Toolbox die het mogelijk maakt om transgenen te uiten voor het identificeren, bewaken en beheersen van enkele neuronen binnen complexe circuits¹⁸. De opkomst van technieken voor Neuronale activiteit monitoring-zoals calcium Imaging, hier besproken-hebben toegestaan voor de bepaling van de neuronale activiteit patronen in reactie op een specifieke stimulans. Door het combineren van specifieke Gal4-driven expressie van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) met olfactorische stimulatie, kan men visualiseren de geur-opgeroepen calcium dynamiek van neuronen van belang¹⁹. In dit protocol wordt aangetoond dat door deze techniek verder te koppelen aan een klassiek conditionerings paradigma, het mogelijk is om deze olfactorische responsen in de context van leren te onderzoeken. Leer-geïnduceerde plasticiteit kan verder worden ontleed met behulp van GECIs die niet alleen gelokaliseerd zijn op één specifiek neuron, maar ook op specifieke subcompartimenten van een neuron. Pech et al.²⁰ heeft een selectie van tools opgezet die dit precies mogelijk maken. Door zich te richten op GCaMP3²¹ op de pre-of postsynapse-via-koppeling naar het gewervelde Syntophysin of dHomer, respectievelijk²⁰-de differentiële modulatie van deze sites kan worden onderscheiden. Deze lokalisatie verleent in dit verband een voordeel ten opzichte van de meeste GECIs die alomtegenwoordig aanwezig zijn in de cytosol-bijvoorbeeld GCaMP²², GCaMP3²¹of GCaMP6²³ -omdat dit betekent dat pre-en postsynaptische transiënten kunnen worden onderscheiden van de totale geïntegreerde calcium instroom die optreedt als gevolg van neuron activatie. Dit kan aanwijzingen geven over de locatie en de soorten plasticiteit die optreden als gevolg van of die leiden tot leren en Geheugenvorming. Als voorbeeld toont het protocol dat hier wordt geleverd de waarde van dit hulpmiddel bij het ontcijferen van de modulatie van MB-uitgangs neuronen tijdens olfactorische associatief leren door de expressie van de calcium sensor te richten op alleen de postsynapse. Door te monitoren, binnen een individuele vlieg, geur-Evoked activiteit voor en na olfactorische conditionering een directe vergelijking kan worden getrokken tussen een naïeve geur respons en een geleerde geur respons. Terwijl ze in dezelfde Imaging kamer zijn bevestigd, worden vliegen blootgesteld aan een selectie van geuren. Vervolgens krijgen ze een aversief associatief conditionerings protocol waarin een van deze geuren is gekoppeld aan elektrische schokken (de CS⁺) en een andere geur wordt gepresenteerd zonder versterking (de CS^-). Ten slotte worden de vliegen weer blootgesteld aan dezelfde geuren als in de eerste stap. Calcium dynamica wordt waargenomen met behulp van twee-photon microscopie.

Protocol

1. transgene vruchten vliegen, Drosophila melanogaster

1. Kruis vrouwelijke Maagd en mannelijke vliegen (verhoogd bij 25 °C in 60% relatieve vochtigheid op een 12 h licht/donkere cyclus) dragen van de gewenste Gal4 en UAS constructies²⁵, respectievelijk, om vliegen te produceren waarin specifieke neuronen van belang Express een genetisch gecodeerde calcium indicator.
2. Leeftijd de vrouwelijke nakomelingen van het bovenstaande Kruis totdat ze in het bereik van 3-6 dagen na Eclosion. Vrouwelijke vliegen hebben de voorkeur vanwege hun iets grotere omvang.

2. bereiding van de fruitvlieg voor in vivo calcium beeldvorming

1. Selecteer een enkele vrouwelijke Fly en verdol op ijs voor niet langer dan 5 min.
2. Met behulp van fijne Tang, plaats de vlieg in de Imaging kamer (gedemonstreerd in Figuur 1c). Zorg ervoor dat de thorax en benen in contact zijn met de elektrische draden in de bodem van de kamer en dat het hoofd plat ligt. Bevestig de positie van de vlieg met behulp van duidelijke plakband.
   Opmerking: dit protocol vereist een op maat gebouwde kamer waarin de vliegen zijn vast, met de hoofd capsule toegankelijk voor opening, en de vliegen in staat om beide geur stimulaties te ontvangen om de antennes en elektrische schokken aan de thorax en benen (Figuur 1).
3. Met behulp van een chirurgische scalpel zwaard bevestigd aan de scalpel handvat (Zie tabel van de materialen), snijd een venster in de tape rond het hoofd van de vlieg, waardoor de antennes bedekt en alleen het voorste-meest gedeelte van de thorax blootgesteld.
4. Omring de zijkanten en achterkant van het hoofd met blauw-lichtuithardende lijm, zorgvuldig gemanipuleerd met behulp van een insecten PIN vastgehouden door concave-bolle kaken. Stel de lijm in met een blauw lichtuitstralend LEDLAMPJE.
5. Controleer of de lijm volledig is ingesteld en Wis eventuele resterende niet-geharde lijm van het rugoppervlak van de vliegkop.
6. Breng een druppel Ringer's Solution²⁴ aan (Zie tabel met materialen) om de blootgestelde cuticula van het hoofd te bedekken.
7. Met behulp van een zeer fijn bladed steek mes, snijd door de cuticula. Voor de meest efficiënte verwijdering van de cuticula, snijdt u eerst over het achterste deel van het hoofd met behulp van de ocelli als uitgangspunt. Knip vervolgens elke kant, mediaal naar de ogen, om een flap van de cuticula te vormen die gemakkelijk kan worden afgebroken met behulp van een tang.
8. Verwijder eventuele overtollige cuticula die het hersengebied van belang kan blokkeren.
9. Verwijder voorzichtig het rugoppervlak van een luchtpijp met behulp van fijne Tang, Vermijd verstoring van het hersenweefsel zelf. Verwijder en vernieuw de oplossing van Ringer²⁴ (Zie tabel met materialen) zoals vereist om het gebied van weefsel puin te wissen.
10. Plaats de hypodermische geur leveringsnaald in positie, ongeveer 1 cm van het hoofd van de vlieg. Zorg ervoor dat er niets is dat de geur afgifte aan de antennes kan belemmeren.
11. Op de Microscoop, Verbind de Imaging kamer met de geur-afgiftesysteem via de hypodermische geur levering naald.
12. Om de vlieg volledig te herstellen van anesthesie en chirurgie, en aan te passen aan de luchtstroom, implementeren van een 10 min rustperiode in dit stadium.

3. in vivo calcium Imaging

1. Gebruik een multiphoton-Microscoop die is uitgerust met een infrarood laser en een wateronderdompelings doelstelling (Zie tabel met materialen), geïnstalleerd op een trillingsgeïsoleerde tafel. Voor de visualisatie van op GFP gebaseerde calcium indicatoren stemt u de laser af op een excitatie golflengte van 920 nm en installeert u een GFP band-pass filter.
2. Door de grove Z-instelknop te gebruiken, scant u de Z-as van de hersenen en zoekt u het hersengebied van belang. Gebruik de functie uitsnijden om het scannen op alleen dit gebied scherp te stellen om de scantijd te minimaliseren en om de scan weergave zodanig te roteren dat het voorste deel van het hoofd naar beneden wordt gericht.
3. Pas de framegrootte aan 512 x 512 px, scansnelheid naar > 4 Hz, en scan regio (in de Y-dimensie) zodat de neuronen van belang zijn bedekt.

4. visualisatie van geur-Evoked calcium transiënten via olfactorische conditionering

1. Gebruik een geur afgiftesysteem^19,26 dat verschillende geur stimuli kan leveren op een tijdelijke nauwkeurige manier.
   1. Gebruik een extra computer om het apparaat te bedienen en om te communiceren met de Imaging-Microscoop-software om geur stimulaties te coördineren met beeldopname tijdens experimenten.
   2. Een voorgeprogrammeerd macro pakket initiëren waarmee de software voorbeeld verwerving en het afleverings programma voor geuren kunnen worden gekoppeld (bijv. een VBA-macro pakket dat is geïnstalleerd in de Microscoop-besturingssoftware, Zie tabel met materialen) die reageert op een externe ingang door de initiatie van een geur leverings protocol in een apart programma).
2. Start de meting door het monitoren van "pre-training"/naïeve geur-opgeroepen calcium transiënten bij een resolutie van 512 x 512 PX en een frame rate van 4 Hz. lever een 2,5 s geur stimulus geflankeerd door extra beeld verwerving voor 6,25 s voorafgaand aan het stank-begin (om een F ₀ baselinewaarde) en 12,5 s na verschuiving van de geur. Herhaal dit met een tweede geurend en vervolgens met een derde geur.
3. Vervolg 3 minuten na deze meting met klassieke conditionering ("training") de vlieg.
   1. Selecteer een van de geuren die in de "pre-training"-fase worden gepresenteerd om de CS⁺ -geur te worden en een andere om de CS^- geur te worden. Presenteer de CS⁺ geur met behulp van de computergestuurde geur-leveren systeem voor 60 s naast 12 90 V elektrische schokken.
   2. Na een pauze van 60 s, presenteren de CS^- geur alleen voor 60 s. gebruik als geurstoffen 4-methylcyclohexanol en 3-octanol. De derde geur (bijv. 1-octen-3-OL) niet presenteren tijdens deze training, omdat deze alleen wordt gebruikt als controle vóór (stap 4,2.) en na (stap 4,4) de trainingsfase.
4. Meet de "post-training" geur-opgeroepen calcium transiënten opnieuw door het herhalen van de "pre-training" geur stimulatie Protocol (stap 4,2.) 3 min na het beëindigen van de trainingsfase (stap 4,3).
   Opmerking: de timing van deze stap moet de tijd van belang na de Geheugenvorming weerspiegelen (bijvoorbeeld, uitvoeren van deze stap 3-4 min na de conditionerings stap om te onderzoeken van de korte-termijn geheugen). Meestal, vliegen kan overleven voor enkele uren in deze voorbereiding.
5. Sla Imaging bestanden op in een geschikte indeling (bijvoorbeeld TIFF) voor latere beeldanalyse.

5. beeldanalyse

1. Voor het analyseren van afbeeldingen, open TIFF (of soortgelijke) bestanden in de beeldanalyse software zoals Fiji²⁷.
2. Lijn de stapels uit met behulp van een algoritme voor bewegings correctie om een minimale beweging in de X-en Y-richting te garanderen. Gooi alle opnames weg die een sterke beweging in de Z-as vertonen.
3. Selecteer de tool van de software die wordt gebruikt om een regio van belang (ROI) te markeren rond het gebied dat moet worden onderzocht. Dit moet zo nauwkeurig mogelijk zijn om de invloed van de achtergrond fluorescentie te beperken.
4. Gebruik de respectieve tool van de software om temporele fluorescentie intensiteitsgegevens te extraheren als gegevensbestanden van de geselecteerde ROI, zodat voor elk frame van de opname een waarde wordt gegenereerd.
5. Open de gegevens met behulp van een Data-analyseprogramma om de ΔF/F₀ -waarden voor elke geur tracering te berekenen. F₀ = gemiddelde fluorescentie in de 2 s vóór het begin van de geur. ΔF = het verschil tussen de ruwe fluorescentie in een gegeven frame en F₀. Bereken uit deze waarden een ΔF/F₀ -waarde voor elk frame dat tegen de tijd kan worden uitgezet om de relatieve fluorescentie tijdens de geur stimulus periode weer te geven.

Resultaten

Een voorbeeld van afbeeldingen die met het bovenstaande protocol zijn verkregen, is te zien in Figuur 2. d Homer-GCaMP3 wordt uitgedrukt in een MB-output neuron waarvan dendrites innervate het compartiment 1 van de MB γ-kwbe (het neuron wordt genoemd MVP2^28,29) en is genetisch gericht met behulp van de split-Gal4 lijn MB112C¹⁶. Ook, gedemonstreerd is het verschil in de...

Discussie

De dissectie van de neurale circuits onderliggende leren en geheugen is een prominente doel op het gebied van de neurowetenschappen. De genetische bereikbaarheid van Drosophila en de breedte en het gemak van gedragstesten maken dit een ideaal instrument om dergelijke verschijnselen te onderzoeken. Hier wordt een methode gepresenteerd waarmee het mogelijk is om binnen individuele vliegen de modulatie te visualiseren die optreedt op een subcellulair niveau als gevolg van olfactorische conditionering. Door het uitv...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemische stof gebruikt als geurmiddel
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemische stof gebruikt als geurmiddel
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemische stof gebruikt als geurmiddel
Bandpass filter voor EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Duitsland
Klaar plakband	Tesa SE, Norderstedt, Duitsland		Standaard helder plakband
Concaaf-convexe kaken	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	Meshouders met concaaf-convexe kaken
Fijne pincetten	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	Pincet met punt 0,1 x 0,06 mm
Hypodermische naald	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Duitsland	4665120	1,20x40 mm
Insecten Miniutien-spelden	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	Diameter 0,1 mm, punt 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blauw lichthardende lijm
Microscoopglas	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Duitsland	0656.1	Standaard objectiefglas 76 x 26 mm
Mineralolie	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Gebruikt als verdunningsmiddel voor geurstoffen
Mode-locked Ti-Saffier laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Afstelbare infrarode femtosecondelaser
Multifotonmicroscoop LSM 7MP uitgerust met BiG-detectoren	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Duitsland		Multifotonmicroscoop, meerdere bedrijven bieden vergelijkbare apparaten.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0) water-immersieobjectief	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Duitsland	421452-9900-000	Objectief W "Plan-Apochromat" 20x/1,0 DIC M27 70mm
Ringer's oplossing	n.v.t.	n.v.t.	5 mM KCl, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM Hepes-NaOH, 36 mM sucrose, pH = 7,4
Steekmes	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5,0 mm Rechte beperkte mesbladdiepte
Chirurgisch scalpelmes	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Productnr. 11
Chirurgisch scalpelhandvat	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Productnr. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software om een trigger te ontvangen van het geurtoedieningsapparaat en het elektrische schoktoedieningsapparaat (voeding) om te communiceren met de ZEN-software van Zeiss die de microscoop bestuurt.	Op maat geschreven en op aanvraag beschikbaar	n.v.t.	n.v.t.