Abbiategrasso Brain Bank Protocol voor het verzamelen, verwerken en karakteriseren van veroudering hersenen

Summary

Dit protocol beschrijft een methode om individuele hersenverouderingstrajecten te volgen via een hersendonatieprogramma en de juiste karakterisering van hersenen. Hersendonoren zijn betrokken bij een langdurige longitudinale studie met inbegrip van seriële multi-dimensionale beoordelingen. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de verwerking van de hersenen en een nauwkeurige diagnostische methodologie.

Abstract

In een voortdurend vergrijzende bevolking, de prevalentie van neurodegeneratieve aandoeningen zal naar verwachting stijgen. Inzicht in ziektemechanismen is de sleutel tot het vinden van preventieve en curatieve maatregelen. De meest effectieve manier om dit te bereiken is door middel van direct onderzoek van ziek en gezond hersenweefsel. De auteurs presenteren een protocol te verkrijgen, verwerken, karakteriseren en opslaan van goede kwaliteit hersenweefsel geschonken door individuen geregistreerd in een antemortem hersenen donatie programma. Het donatieprogramma omvat een persoonlijke empathische benadering van mensen, een verzameling aanvullende klinische, biologische, sociale en lifestyle-informatie en seriële multidimensionale beoordelingen in de loop van de tijd om individuele trajecten van normale veroudering en cognitieve achteruitgang te volgen. Omdat veel neurologische ziekten asymmetrisch zijn, biedt onze hersenbank een uniek protocol voor het snijden van verse exemplaren. Hersensecties van beide hemisferen worden afwisselend bevroren (bij -80 °C) of vastgezet in formaline; een vast plak op één hemisfeer beantwoordt aan bevroren op de andere hemisfeer. Met deze benadering kan een volledige histologische karakterisering van alle bevroren materiaal worden verkregen, en omics studies kunnen worden uitgevoerd op histologisch goed gedefinieerde weefsels van beide hemisferen waardoor een meer volledige beoordeling van neurodegeneratieve ziektemechanismen. Een correcte en definitieve diagnose van deze ziekten kan alleen worden bereikt door het klinische syndroom te combineren met de neuropathologische evaluatie, die vaak belangrijke etiologische aanwijzingen toevoegt die nodig zijn om de pathogenese te interpreteren. Deze methode kan tijdrovend, duur en beperkt zijn, omdat deze slechts een beperkt geografisch gebied bestrijkt. Ongeacht de beperkingen, de hoge mate van karakterisering biedt kan de moeite waard zijn. Ons uiteindelijke doel is om de eerste Italiaanse Hersenbank op te richten, terwijl de nadruk ligt op het belang van neuropathologisch geverifieerde epidemiologische studies.

Introduction

Volgens de WHO lijden momenteel ongeveer 50 miljoen mensen aan dementie, een cijfer dat tegen 2050 naar verwachting zal verdrievoudigen. De ziekte van Alzheimer is de belangrijkste oorzaak van dementie, gevolgd door cerebrovasculaire ziekte en andere leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoeningen. In 2017 ontwikkelde de WHO het Global Dementia Observatory om het bewustzijn van dementie te vergroten en een wereldwijd actieplan tegen het te stimuleren¹. Elk individu heeft zijn eigen hersenverouderingstraject, daarom kan het zoeken naar de genezing uitdagend zijn vanwege de complexiteit van de pathogenese van neurodegeneratieve ziekten. Misschien bezit elke persoon zijn of zijn eigen pathogenese geschreven in het hersenweefsel die een gepersonaliseerde aanpak vereist. Zo zal de studie van hersenweefsel de sleutel zijn tot het begrijpen van de mechanismen van neurodegeneratie.

Terugkijkend op de geschiedenis van de neurowetenschappen, realiseren we ons dat de meest indrukwekkende en baanbrekende ontdekkingen nooit hadden kunnen plaatsvinden zonder het directe onderzoek van het menselijk brein. Door de tijd heen is de bron van hersenweefsel veranderd van ruwe dissecties, willekeurige 'toevallige ontmoetingen' en, in sommige gevallen, illegale handel, naar georganiseerde hersencollecties en strategische moderne hersenbanken. De overweging van vele ethische aspecten is een van de belangrijkste factoren die moderne hersenbanken onderscheiden van de hersenverzamelingen uit het verleden. De eerste echte moderne Brain Banks (BB's) werden ingesteld^th in de tweede helft van de 20e eeuw. Nicholas Corsellis en Wallace Tourtelotte kunnen worden beschouwd als pioniers van de moderne hersenen bankieren. In het Verenigd Koninkrijk, Corsellis geassembleerd een collectie bedrijf meer dan 1000 goed gedocumenteerde hersenen getroffen met verschillende psychische en neurologische aandoeningen². Bovendien heeft Corsellis geholpen de noodzaak aan het licht te brengen om vers hersenweefsel in ijs te bewaren omwille van biochemische tests³. Ondertussen in de VS, Wallace Tourtelotte introduceerde antemortem hersenen donatie programma's om het werven van potentiële hersendonoren te vergemakkelijken en ervoor te zorgen dat de verzamelde hersenen vergezeld gaan van een volledige medische en neurologische geschiedenis^4,5. Voor een historisch overzicht van hersencollecties en moderne BB's, zie Carlos et al. ⁶.

Waarom hebben we nog steeds menselijke hersenen nodig? Hersenziekten kunnen alleen een definitieve diagnose krijgen na neuropathologisch onderzoek. Neuropathologie daagt de klinische diagnose uit en is de sleutel tot een correcte interpretatie van de klinische symptomen en de ontdekking van de histologische grondslagen van nieuwe syndromische varianten. De diagnose kan namelijk opnieuw worden gedefinieerd op basis van het pathologische beeld. Niettemin, de autopsie tarief is gedaald in de laatste decennia als gevolg van de recente ontwikkeling van innovatieve neuroimaging technieken. Door middel van beeldvorming in de hersenen kunnen de morfologische, functionele en metabole veranderingen in de hersenen, evenals de omvang van eiwitmismappen, in vivoworden beoordeeld. Echter, in vivo neuroimaging en andere biomarker studies kan alleen een "schatting" van het pathologische beeld te geven als ze niet in staat zijn om subtiele cellulaire en moleculaire veranderingen te detecteren. De vooruitgang in moleculaire beeldvorming en de ontdekking van nieuwe biomarkers, doelmoleculen, en tracers⁷ (b.v., amyloïde, TAU, microglial tracers) maken het menselijke hersenen nog onontbeerlijker aan de interpretatie van gegevens die uit klinische evaluaties en biomarker testen worden verkregen. Bovendien zijn de omics-technologieën (genomics, epigenomics, transcriptomics, metabolomics, proteomics, lipidomics, enz.), uitgevoerd op vers en bevroren hersenweefsel, opende nieuwe mogelijkheden voor het begrijpen van ziektemechanismen en het ontdekken van risicogenen, nieuwe diagnostische en prognostische markers, en potentiële medicijndoelen^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18},^{19,20 , 2121,22,23}.^,,

Voor deze doeleinden archiveren moderne BB's goed gekarakteriseerde, hoogwaardige hersenweefsels die ze beschikbaar maken voor de wetenschappelijke gemeenschap^3,24. De hersenen die door BB's worden geleverd, moeten gepaard gaan met een volledige klinische geschiedenis. De activiteit van een BB omvat het volgende: (1) Erkenning en rekrutering van zieke en gezonde individuen aan hersendonatieprogramma's; de ideale voorwaarde zou zijn om gedurende het hele leven een multidisciplinaire follow-up van donoren te bereiken om een volledige klinische, levensstijl en sociale geschiedenis en biomarkerprofielen te verkrijgen; inderdaad, cognitieve reserve en hersenstructuur zijn afhankelijk van levensstijl en sociaal-educatieve factoren^25,26, dus deze informatie verrijkt de totale gegevens bij de hand. (2) Verwerving van de hersenen (bestaande uit cerebrum, cerebellum en hersenstam) en aanverwante weefsels (bijvoorbeeld ruggenmerg, schedelzenuwen en ganglia, enz.) na de ondergang van de donor, terwijl de gestandaardiseerde wettelijke en ethische voorschriften in acht worden nemen. (3) Passende verwerking (dissectie, fixatie, bevriezing) van de hersenen, zoals gedefinieerd in een gestandaardiseerd operatief protocol, om weefsel van hoge kwaliteit te verkrijgen en om toekomstig gebruik in multidisciplinair onderzoek mogelijk te maken. (4) Gedetailleerde neuropathologische karakterisering die een definitieve definitieve diagnose geeft. (5) Opslag en distributie van weefselmateriaal aan onderzoeksgemeenschap^27,28.

Alle BB's slaan zowel bevroren als formaline-vaste-paraffine ingebedde weefsels op. Elke BB heeft zijn eigen protocol. Behalve voor bepaalde studies, zoals het bihemispheric snijden protocol van het Biomedical Research Institute (New Jersey)²⁹ en de Deramecourt's studie van cerebrovasculaire pathologie³⁰, de grootste BB's in de wereld gewoon snijd de cerebrum, cerebellum en hersenstam langs de middellijn (sagitttal vlak). De ene helft wordt vers ontleed en vervolgens ingevroren voor biochemische studies, terwijl de andere in formaline wordt vastgesteld voor histopathologische beoordeling. Biochemische en histopathologische analyses worden dus afzonderlijk uitgevoerd op elk halfrond. De beslissing over welke zijde vast of bevroren is (lateraliteit), hangt af van de bijzondere bank^{31,32,33,34,35}. Omdat veel neurologische ziekten asymmetrisch zijn, biedt onze BB een uniek protocol voor het snijden van verse hersenen: aangrenzende delen van de hersenstam en elk halfrond worden afwisselend vast en bevroren; een vast plak op één hemisfeer beantwoordt aan bevroren op de andere hemisfeer. Door middel van deze methode wordt het gebruik van hersenweefsel geoptimaliseerd en kan een volledige histologische karakterisering van al bevroren materiaal worden bereikt met de mogelijkheid om histologische en biochemische informatie uit alle gebieden van beide halfronden te verkrijgen en te vergelijken.

Het frame van ons hersenbank project is de stad Abbiategrasso. Abbiategrasso is een kleine stad ongeveer 22 km ten zuidwesten van de stad Milaan, in Noord-Italië. Het heeft een bevolking van ongeveer 32.600 mensen. Het is de thuisbasis van de Golgi-Cenci (GC) Foundation. GC Foundation maakt deel uit van een groot Revalidatie Geriatrisch Ziekenhuis (ASP Golgi-Redaelli), en is een instituut gericht op onderzoek naar veroudering en ouderenzorg. In het bijzonder richt het zich op het bestuderen van mentale veroudering, de sociale en gedragsfactoren die het beïnvloeden, en de biologie en pathologie die ten grondslag liggen aan leeftijdsafhankelijke neurocognitieve aandoeningen (NCD's). In 2009 lanceerde de GC Foundation een nieuwe longitudinale studie met 1321 deelnemers (van de 1644 in aanmerking komende proefpersonen: initiële respons van 80,3%) geboren tussen 1935 en 1939 (tussen 70-75 jaar), van Kaukasische etniciteit, die in het zelfde kleine geografische gebied leeft. De studie heette InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; in het Engels: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) en is momenteel aan de gang. InveCe.Ab is gepland om een cohort met maximale homogeniteit en minste variabiliteit te verkrijgen om de incidentie, prevalentie en natuurlijke geschiedenis van dementie te beoordelen, samen met de mogelijke risico's of beschermende factoren, waaronder gedrags-, psychosociale, klinische en biologische variabelen³⁶. De kenmerken van het cohort zijn opgenomen in figuur 1 en tabel 1. De epidemiologische gegevens komen overeen met de dementietrend bij de Europese bevolking^37,,38 en InveCe.Ab-deelnemers hebben homogene genetische en milieukenmerken, die een goed model vertegenwoordigen om het traject te bestuderen van normale veroudering tot neurocognitieve aandoeningen. Homogene populaties vereisen immers minder proefpersonen om voldoende statistische macht te bereiken. De InveCe.Ab-methode is al elders gemeld^36, maar het is belangrijk om de multidimensionale aanpak te onderstrepen door middel van periodieke controles (om de 2-3 jaar) met behulp van dezelfde set evaluaties, waaronder: bloedbemonstering (metabole paneel, homocysteïne en vitaminen, DNA-extractie om Apolipoprotein E (APOE) en andere genetische polymorfismen gerelateerd aan cognitie en veroudering te profileren), antropometrische metingen (gewicht, lengte en taille), Talking While Walking Test (dubbele taaktest), een interview om levensstijl te beoordelen (mediterrane dieettrouw, niveaus van fysieke activiteit en cognitieve betrokkenheid) en sociale factoren (sociale betrokkenheid, eenzaamheid), een neuropsychologische evaluatie en een klinisch algemeen onderzoek. Het vergelijken van dergelijke longitudinale gegevens met postmortem neuropathologische gegevens zou cruciaal zijn voor onderzoek. Daarom heeft ons team en in het bijzonder Dr. Michela Mangieri de hierboven genoemde neuropathologische benadering bedacht. Sinds 2014 en tijdens de tweede follow-up werden de InveCe.Ab deelnemers gevraagd om hun hersenen te doneren, en zo de geboorte van de Abbiategrasso Brain Bank (ABB)tot stand te brengen. De belangrijkste donoren van ABB zijn de InveCe.Ab deelnemers, maar ABB staat nu open voor andere vrijwillige donateurs. Het zijn patiënten van ASP Golgi-Redaelli, de thuisbasis van verschillende patiënten die getroffen zijn door verschillende neurologische aandoeningen of volwassen vrijwilligers die meer te weten komen over het ABB-project en tot hetzelfde geografische gebied behoren (Abbiategrasso en omgeving). Alle donoren ondergaan hetzelfde evaluatieprotocol.

De auteurs stellen een methode voor om individuele trajecten van normale veroudering en de mogelijke progressie naar NCD's te volgen en om hersenen die van dergelijke donoren zijn verkregen, in de lengterichting nauwkeurig te beheren, te verwerken en te karakteriseren. Bovendien is het ons doel om individuen te ontmoeten en te betrekken bij periodieke neurologische beoordelingen, seminars en educatieve activiteiten met betrekking tot het welzijn van de hersenen en om hun bewustzijn van hersendonatie voor onderzoeksdoeleinden te vergroten.

Protocol

In overeenstemming met de Human Research Ethics Committee van onze instelling en de BNE Gedragscode voert de ABB haar activiteiten uit volgens ethische normen^39,40. De hersenoogstprocedure werd voorgelegd aan en goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Universiteit van Pavia in het kader van de InveCe.Ab studie³⁶. De studieprocedures waren in overeenstemming met de beginselen die in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de volgende amendementen zijn uiteengezet. Het toestemmingsformulier is volledig en gemakkelijk te begrijpen. Deelnemen aan het donatieprogramma is een persoonlijke beslissing en volledige bewustwording is nodig. Indien een persoon niet bevoegd wordt geacht om het toestemmingsformulier te ondertekenen, is toestemming van wettelijke voogd of nabestaanden (NOK) gerechtvaardigd. Tabel 2 meldt inclusie- en uitsluitingscriteria voor hersendonatie. Het onderzoek werd uitgevoerd onder toezicht van de Federazione Alzheimer Italia.

1. Werving voor de hersenen donatie programma

1. Bijeenroepen van de onderwerpen die interesse hadden getoond in hersendonatie en hun NOK en / of wettelijke voogd om het project te presenteren (de reikwijdte van het donatieprogramma; het proces van verwijdering van de hersenen, behoud, gebruik en distributie), het recht om zich terug te trekken uit het programma op een bepaald moment, de bescherming van anonimiteit, en de follow-up strategieën. Bespreek de mogelijkheid van aanvullende biomarker onderzoeken en genetische tests. Let op de wensen van de potentiële donor of zijn NOK om geïnformeerd te worden over de resultaten.
2. Leg alle economische aspecten uit, waaronder het gebrek aan financieel gewin voor zowel de Stichting als de donor (hersenen worden altruïstisch gedoneerd en verspreid). Laat hen weten dat ABB de kosten van het vervoer van het lichaam dekt, terwijl de familie die van de begrafenis, begrafenis of crematie dekt.
3. In geval van aanvaarding, verkrijgen van de handtekening van de toestemming om deel te nemen aan het donatieprogramma. Geef de donor een individuele numerieke code om anonimiteit te garanderen. Noteer het identificatienummer van de deelnemers aan de longitudinale studie en geef een andere code voor de hersenbank om de twee subgroepen van donoren gemakkelijk te scheiden (deelnemers of niet-deelnemers aan de longitudinale studie; zie tabel 3).
4. Geef de donor een identiteitskaart die zijn status als donor verklaart en het telefoonnummer (24/7 beschikbaar) toont om de Hersenbank op de hoogte te stellen van zijn overlijden.

2. Evaluatie van donoren en seriële follow-ups

LET OP: Het is mogelijk om alleen toestemming te geven voor sommige, en niet alle, van de onderstaande onderzoeken. Alle klinische beoordelingen worden uitgevoerd door hetzelfde team, waaronder een neuroloog, een geriater met expertise in neurologie en 3 psychologen. Als zich nieuwe symptomen ontwikkelen of de cognitieve achteruitgang vordert, kan het tijdsinterval tussen follow-ups worden verkort.

1. Net als in het geval van de InveCe.Ab studie, het verkrijgen van een lifestyle-sociale vragenlijst, met inbegrip van mate van autonomie (ADL, IADL), persoonlijke gewoonten, sociale en levensstijl factoren die van invloed kunnen zijn op mentale functies. Verzamel familie-, medische en neurologische geschiedenis met informatie over genetische, besmettelijke, toxische, metabolische, auto-immuun- en cardiovasculaire, traumatische, degeneratieve, neoplastische en neurologische ziekten. Verzamel eerdere klinische examens en lijst farmacologische behandelingen.
2. Voer een uitgebreide neuromotorische evaluatie uit, waaronder testen op craniale zenuwenfunctie, fundus oculi, gezichtsveld, spierkracht en toon, gevoeligheden, peesreflexen, exteroceptieve en primitieve reflexen, meningeale tekenen, houding, gang, bewegingen, coördinatie, sluitspierische functies en elke aanwezigheid van focale of Babinski-tekens. Evalueer taal, mentale status en elke gedragsverandering.
3. Voer een uitgebreide neurocognike cognitieve evaluatie uit, waaronder wereldwijde cognitie en een volledige neuropsychologische beoordeling van specifieke cognitieve domeinen: verbaal en visueel geheugen, aandacht, psychomotorische snelheid, taal, semantisch geheugen, uitvoerende functies en visuospatiale vaardigheden(tabel 4 voor details). Denk aan de aanwezigheid van depressie (CES-D schaal).
4. Verkrijg bloedmonster dat wordt gebruikt voor zowel bloedchemie analyse(Tabel 5) en isolatie en opslag van DNA, plasma en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Bepaal APOE genotypering (rs429358 en rs7412) (een uitgebreidere genetische profilering is vastgesteld in InveCe.Ab deelnemers; zie Tabel 6). Registreer een ECG (cardiale veranderingen, atriumfibrillatie) en een rusttoestand Elektro-encefalogram voor kwantitatieve analyse (QEEG).
5. Overweeg optionele biomarkertests, waaronder cerebrospinale vloeistof (CSF) TAU, fosfo-TAU en β-amyloïde, en hersenbeeldvorming (MRI om in vivo degeneratie, ischemie of ontsteking te detecteren; FDG-PET om metabolisch falen op te sporen; PIB-PET om hersennyloïdose te detecteren in verband met de pathofysiologie van Alzheimer).
6. Plan het volgende controleprogramma van de hersendonor. Stel de tijdsintervallen in op basis van verschillende leeftijdsgroepen (tot 64 jaar: elke 10 jaar, 65-74 jaar: elke 3 jaar, vanaf 75 jaar: elke 2 jaar).
7. Wijs een klinische diagnose en/of een neurocognitieve diagnose toe volgens DSM-V. Classificeer klinische dementie enscenering met Clinical Dementia Rating (CDR) score. Update CDR in de laatste periode voor de dood.
8. Een database grafisch voorbereiden die vergelijkbaar is met de papieren database. Voeg alle verzamelde gegevens in de Brain Bank database. Plan een revisie door een andere klerk om te controleren op eventuele fouten.

3. Tijdstip van overlijden en verwijdering van de hersenen

OPMERKING: De Italiaanse wet bepaalt dat asystole langer dan 20 minuten moet duren om de dood te bevestigen. De registratie van een vlak elektrocardiogram (ECG) voor ten minste 20 min (thanatografie genoemd) maakt het mogelijk om binnen 24 uur na overlijden een autopsie uit te voeren (DPR 285/90 art. 8 en Wet nr. 578 dec 29, 1993). Een postmortem tijd van <24 h is een goed doel om de algehele weefselkwaliteit te behouden. In het geval van een postmortemtijd >30 uur wordt de autopsie geannuleerd (zie tabel 2). Het autopsieteam bestaat uit een patholoog, een neuroloog en/of een neurobioloog, een verpleegkundige, een anatomische kamertechnicus en eventuele studenten in opleiding; de eerste twee teamleden voeren ook de neuropathologische diagnose uit. Tijdens het hanteren en ontlede van kadavers is het gebruik van geschikte kleding (jas, handschoenen, brillen en haarnetje) verplicht. In deze sectie beschrijven we de belangrijkste gereedschappen en apparatuur die normaal in ons laboratorium worden gebruikt. Lezers kunnen de instrumenten kiezen die naar eigen inzicht moeten worden gebruikt. Voor een gedetailleerde beschrijving van de gebruikte materialen, zie Tabel van materialen.

1. Zorg ervoor dat het door de familie gekozen uitvaartbedrijf het lichaam naar de ABB-faciliteiten brengt. Voer de thanatografie uit waarin de hartactiviteit afwezig moet zijn. Als dat zo is, teken dan een overlijdensakte en begin met de autopsieprocedures.
2. Breng het kadaver naar de autopsiekamer. Meet de omtrek van de schedel op het niveau van het breedste deel van het hoofd. Meet van de nasion aan de inion om de anteroposteriordiameter (APD) te verkrijgen, terwijl de afstand van het ene oor naar het andere de dwarsdiameter (TD) oplevert. Bereken de cephalic index (CI) met de formule: CI = TD/APD x 100.
3. Met behulp van een scherpe scalpel, maak een hoofdhuid incisie op het coronale vlak, van het puntje van het mastoïde proces aan de ene kant naar de andere, het passeren van de hoekpunt. Snijd door haar, huid en onderhuids weefsel en scheid de twee plooien van de hoofdhuid zorgvuldig van de onderschedel. Voer de incisie uit totdat het gele supraorbitale vet zichtbaar wordt en de hoofdhuid anteriorisch reflecteert. Trek het andere deel achterste.
4. Met behulp van scalpel en tangen, neem een klein monster van de temporele spier aan elke kant, zet een in 4% formaldehyde en bevriezen de andere (zie sectie 7).
5. Snijd de schedel met behulp van een elektrische zaag na een V-cut aan de frontale kant. Verwijder de schedelkap en snijd de hersenvliezen. De stukken dura zijn beide vastgesteld in 4% formaldehyde en bevroren (zie punt 7).
6. Verkrijg ongeveer 10 mL CSF door een 20 G 3,5 in te voegen door het corpus callosum om de derde ventrikel te bereiken. Beoordeel het uiterlijk, de kleur en de troebelheid van CSF en meet de pH. Maak vervolgens 10 aliquots van ongeveer 1 mL per stuk en bewaar ze op -80 °C.
7. Til de hersenen delicaat trekken op zowel frontale kwabben en snijd zowel optische zenuwen infundibulum, de interne halsslagaders (ICA) en de derde, vierde, vijfde en zesde craniale zenuwen. Snijd het tentorium om de achterste fossa te bereiken en snijd wervelslagaders en onderste schedelzenuwen. Steek de scalpel zo diep mogelijk door de foramen magnum, om het meest caudale gedeelte van de medulla te snijden. Op dit punt, verwijder de hele hersenen zachtjes.
8. Met de scalpel, doorboor het bot over meckel's grot en het verkrijgen van de Gasserian ganglion van beide kanten. Fix een ganglion in 4% formaldehyde en bevriezen de andere (zie sectie 7). Fractuur de benige sella turcica met behulp van een chirurgische hamer en beitel om de hypofyse te verwijderen en dan vast te stellen in 4% formaldehyde.
9. Inspecteer de schedel en de hele hersenen op macroscopische veranderingen en vasculaire veranderingen. Meet met een meetlint de hersenen die de dwarse en anteroposteriordiameters verkrijgen. Haal met zorg de cirkel van Willis op en beoordeel deze macroscopisch (figuur 2E) op de aanwezigheid van anatomische varianten, laesies of vaatstenose.
10. Neem 1-2 stuks leptomeninges van 2-4 cm² van de convexity en bewaar ze in volledige hoge glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle media (DMEM) kweekmedium bij 4 °C met 20% foetaal runderserum (FBS), 1% pen/strep, 1% glutamine en 1% niet-essentiële aminozuren (zoals eerder gepubliceerd, met enkele wijzigingen)¹.
    1. Om fibroblasten culturen te verkrijgen, plaats de leptomeninges op een petrischaal van 10 cm en was twee maal met fosfaatbuffer zout (PBS), telkens weggooien van de vloeistof.
    2. Met behulp van een scalpel en een pipetpunt, snijd de leptomeninges in kleine stukjes van ongeveer 2 of 3 mm, zaad 3-4 stukken in elke put van een 6-put plaat eerder bedekt met gelatine op 0,5% en vul elke put met 2 mL van volledige medium aangevuld met 1% van amphotericine B (voer de verwerking in een bioveiligheid kast om de steriliteit van de cultuur te garanderen).
    3. Plaats de plaat in een 37 °C, 5% CO₂ incubator gedurende ten minste een week en verandering besteed medium om de 3-4 dagen. Trypsinize cellen met steriele 1x trypsine wanneer de put is op ongeveer 70% van de samenvloeiing. Doe leptomeningeal fibroblasten in een T75 kolf en vul deze met 12 mL compleet medium. Na 5 dagen proberen en bewaren in 900 μL FBS en 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO).
11. Scheid en inspecteer cerebrum, cerebellum en hersenstam en gewicht ze individueel. Neem de pijnappelklier af en repareer het in 4% formaldehyde. Verwijder reuklampen en optische zenuwen, en fix of vries een van elk paar, onafhankelijk van de zijkant. Houd de cerebrum, cerebellum en hersenstam in ijs op 4 °C gedurende ten minste 2-4 uur tot klaar voor dissectie om weefselverstoring te minimaliseren en de zachtheid van weefsel te verminderen.
12. Let na het oogsten op het kadaver. Opnieuw het bot met behulp van een super lijm lijm, en steek terug de hoofdhuid met behulp van een chirurgische naald en niet-absorbeerbare hechtingen.
13. Toon respect en dankbaarheid aan de overledene door de behandeling van het kadaver zachtjes. Reinig en scheer het gezicht, en was en droog het haar, omdat het kadaver zal worden gebracht in een open kist zichtbaar voor dierbaren.
    OPMERKING: De hercompositie van het kadaver wordt gedaan door een technicus. Het protocol kan hier worden onderbroken.

4. ABB-ontledingsprotocol

OPMERKING: Dezelfde patholoog en/of neuroloog snijden de hersenstam, cerebellum en cerebrum onder een rookkap. Een neurobioloog schikt de plakjes na het snijden. Een cursist die geen hersensecties behandelt, documenteert de hele procedure met foto's die naar de database moeten worden geüpload om als leidraad te dienen tijdens de daaropvolgende weefselverwerkingsfasen.

1. Met behulp van een ontleden mes, snijd de hersenstam axiaal en maak de eerste snede op het niveau van rostral midbrain, door middel van de superieure colliculus, om twee plakjes bloot de substantia nigra (SN) te verkrijgen.
2. Maak de rest van de bezuinigingen tot 8 mm hersenstam plakjes te verwerven tot ongeveer 10 secties te verkrijgen. Wees voorzichtig met bezuinigingen die door de rostral pons in de buurt van de superieure marges van de vierde ventrikel om de locus coeruleus (LC) en door de medulla oblongata inferieur aan de akoestische striae net boven de inferieure top van de vierde ventrikel te observeren om plakjes met inbegrip van de dorsale motor kern van de vagus (DMNV).
3. Noem alle segmenten in een rostrocaudal zin als BS (hersenstam) gevolgd door Arabische getallen om de secties te identificeren. Gebruik na de laatste hersenstamsectie de aanduiding SC (ruggenmerg), gevolgd door getallen 1-n. Ongeveer 2-4 SC plakjes worden verkregen, afhankelijk van het aantal spinale metameres verwijderd(Figuur 2H-I).
4. Label alle te repareren of te bevriezen secties en maak een foto voor het fotoarchief(figuur 2). Los vervolgens alle segmenten op en bevries ze zoals hieronder beschreven (stappen 4.7 en 4.8).
5. Snijd het cerebellum op het sagittale vlak om de twee cerebellar hemisferen te scheiden op het niveau van de vermis. Voer sagittale secties uit om 5 plakjes van elk halfrond te verkrijgen(figuur 2F-G).
6. Noem alle segmenten van vermis als CBR of CBL (respectievelijk voor rechts en links) en gebruik Arabische nummers om de secties te identificeren. Label alle te vast te stellen of bevroren secties afwisselend en maak een foto voor het archief (Figuur 2). Vervolgens, fix en bevriezen alle segmenten zoals hieronder beschreven.
7. Scheid de twee hersenhelften van de cerebrum door het corpus callosum(figuur 2A-B)en snijd ze enkelvoud op het coronale vlak. Maak de eerste snede in een vlak dat tussen de optische chiasm en de mammillaire lichamen, door middel van frontale kwab, tijdelijke pool, voorste cingulate, voorste commissure, kern van Meynert en basale ganglia.
8. Voer de tweede snede ongeveer 1 cm achterlijk door de mammillaire lichamen en bloot de basale ganglia, voorste thalamus, subthalamus en amygdala. Blijf snijden om de voorste en achterste regio's te ontleden om 1 cm plakjes te verwerven om 15 tot 20 secties voor elk halfrond te verkrijgen.
9. Zet de plakjes op een vlakke ondergrond. Leg ze na hun oorspronkelijke positie in de anteroposterior richting, van de frontale naar de occipital pool, met het gedeelte continu met de vorige plak naar boven gericht.
10. Door de secties van beide hemisferen te vergelijken, selecteert u alternatieve secties van elke hemisfeer die als vast of bevroren materiaal moeten worden bewaard. Herken de belangrijkste secties worden vastgesteld en verwerkt voor histopathologie met inbegrip van frontale en temporale kwabben, cingulate, basale ganglia, nucleus basalis van Meynert, amygdala, thalamus, hippocampus en entorhinale cortex, occipito-temporale gyrus, pariëtale en occipital kwabben.
11. Noem alle segmenten in anteroposterior-zin als L (links) of R (rechts), gevolgd door Arabische getallen en plaats een etiket dat aangeeft of het segment moet worden bevestigd of bevroren(figuur 2A-D). Als u de secties wilt identificeren, maakt u een foto voor het fotoarchief. Los vervolgens alle segmenten op en bevries ze zoals beschreven in de secties 7 en 8.

5. Inspectie van hersenen en bloedvaten en macroscopische pathologische beoordeling (met het blote oog)

1. Uitvoeren van een algemeen macroscopisch onderzoek waarbij meningeale veranderingen, diffuse of gelokaliseerde corticale atrofie, hippocampal atrofie, ventriculaire uitbreiding, cerebellar atrofie, hersenstam atrofie, substantia nigra pallor, witte stof veranderingen (specificeren type en locatie).
2. Bestudeer de cirkel van Willis overweegt atherosclerose en occlusie. Geef score = 1 toe in aanwezigheid van atheroma zonder stenose van meer dan 50%, score = 2 als ten minste één slagader 50% of meer is afgesloten, score = 3 als twee of meer slagaders 50% of meer afgesloten⁴²zijn . Evalueer de aanwezigheid of afwezigheid van pathologie in andere intracraniale bloedvaten.
3. Om parenchymale vasculaire laesies te detecteren, onderzoeken hersenhelften, cerebellum en hersenstam. Denk aan lacunaire laesies (diameter < 10 mm), ischemische of hemorragische infarcten en bloedingen (diameter > 10 mm). Als deze aanwezig is, geeft u de grootte op in millimeter, aantal en locatie. Overweeg ook de aanwezigheid of afwezigheid van subarachnoïdale bloeding.

6. Kwaliteitscontrole van weefsel

OPMERKING: Agonal factor score (AFS) varieert tussen 0 en 2 en is belangrijk bij de evaluatie van de weefselkwaliteit. Om AFS te bepalen, overwegen klinische aandoeningen die zich voordoen rond het tijdstip van overlijden (met name voorwaarden die hersenzurose bepalen) en de duur van de agonale toestand (plotselinge dood of langdurige pijn). Als AFS > 1, het hersenweefsel misschien niet van optimale kwaliteit⁴³. Denk ook aan hersenen en CSF pH; als pH < 6, het hersenweefsel misschien niet van optimale kwaliteit^43,44.

1. Controleer of de dood is veroorzaakt door aandoeningen die hersenweefsel kunnen beschadigen, waaronder hypoxie, langdurige acidose, mechanische ventilatie, multi-orgaanfalen, hoge koorts, ernstig schedeltrauma, inname van neurotoxische stoffen, ernstige uitdroging, ernstige hypoglykemie, epileptische toestand en langdurige coma. Als een van deze voorwaarden aanwezig is, wijst u 1 punt toe.
2. Controleer de duur van de agonaltoestand(snel als de dood optreedt binnen 1 uur, intermediair als de dood optreedt tussen 1 en 24 uur, langzaam als de agonale toestand langer dan 1 dag duurt). Als een tussenliggende of een langzame dood gebeurt, wijs 1 punt toe.
3. Bereken afs score, en meet CSF pH door een elektrode pH naald en weefsel pH door een oppervlakte pH meter op een hersenen slice van elke kwab en op een cerebellar sectie.

7. Invriezen van weefsel

1. Houd alle te bevriezen weefsels in ijs op 4 °C. Bevries ze dan snel. Leg ze op een voorgevooie aluminium lade. Dek af met een in elkaar grijpende aluminium plaat om ze plat te houden. Doe ze 3 min in vloeibare stikstof bij -120 °C.
2. Plaats de plakjes in een plastic zak gelabeld met de bijbehorende identificatiecode en slice nummer. Verdeel de plastic zakken in drie cryogene dozen (voor rechterhersenhelft, linkerhersenhelft en hersenstam) en bewaar op -80 °C.

8. Weefselfixatie

1. Wikkel de plakjes in gaas een voor een, en zet de plakjes in 10% fosfaat gebufferde formaline oplossing. Na 1 dag, vervang de formalin oplossing met een nieuwe oplossing. Laat ze ongeveer 5 dagen in een koude kamer op 4 °C.
2. Houd alle plakjes als geheel en split alleen de plakjes met hippocampus en amygdala in twee delen(figuur 3). Het bovenste deel van beide segmenten bevat de frontale kwab (R10a–L9a in figuur 3); de onderste delen bevatten respectievelijk: (1) amygdala, temporale kwab en basale ganglia (L9b in figuur 3B),en (2) hippocampus en een deel van de temporale kwab (R10b in figuur 3A). Dit wordt gedaan om de relatie tussen de verschillende structuren te behouden.
3. Plaats alle secties in fosfaatbuffer voor ten minste 2 dagen uit te wassen en te verwijderen cross linking producten.
   LETOP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

9. Uitdroging, clearing, paraffine inbedding en diavoorbereiding

1. Bereid verhoogde concentraties ethylalcohol voor van 70% tot 100%, xyleen en twee sets gesmolten paraffinewas. Plaats de hersensecties in de automatische processor voor uitdroging, clearing procedure en paraffine infiltratie (gebruik twee verschillende weefselverwerkingsprotocollen voor macro (cerebrum en cerebellum plakjes) en micromonsters (hersenstam plakjes en de andere kleine monsters); Tabel 7). Veranker het weefsel in paraffine was op een metalen of plastic mal.
2. Selecteer de secties die u wilt snijden voor de evaluatie van alle interessegebieden die de index van Montine toepassen voor neuropathologische karakterisering⁴⁵ (tabel 8). Snijd vervolgens de geselecteerde secties.
3. Gebruik een sleemicrotome voor macrosecties en een roterende microtome voor kleine secties. Snijd 5 μm plakjes voor Haematoxylin en Eosine (H&E) kleuring en 8 μm plakjes voor de andere kleuringen en immunohistochemie. Leg de plakjes op drie verschillende histologische glijbanen: 8,5 cm x 11 cm voor de grootste plakjes, 5 cm x 7,5 cm voor middelgrote plakjes en de klassieke 2,5 cm x 7,5 cm voor de kleinste.
   LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

10. Deparaffinisatie, histologische kleuring en immunohistochemie (IHC)

1. Voer deparaffinisatie uit om reactie met waterige kleurstofoplossingen mogelijk te maken. Voer het uit met xyleen en afnemende alcoholconcentratie (5 min voor elke stap). Hydrateer gedurende 5 minuten met gedestilleerd water.
2. Gebruik de volgende histologische vlekken om architecturale en structurele weefselafwijkingen te evalueren, en cellulaire morfologie: H&E (voor vasculaire microscopische laesies en ontsteking), Cresyl Violet (NISSL; voor neuronale verlies), Luxol Fast Blue (LFB; voor demyelinatie), Gallyas (voor neuritische plaques en neuropildraden).
3. Gebruik immunohistochemie (IHC) om de aanwezigheid van specifieke doelstructuren te benadrukken. Anti-NeuN en anti-GFAP worden gebruikt om neuronale en gliacompartimenten te identificeren; 4G8, AT8, α-SYN en TDP-43 worden gebruikt om eiwitten te identificeren die aggregaat in neurodegeneratieve ziekten(Table of Materials).
   1. Voortreat ontwaxte secties met 3% H₂O₂ gedurende 10 minuten spoel vervolgens in PBS. Voer een ophaalbehandeling uit met citratebuffer 0,01 M pH 6 (serieel in microgolf voor 2, 1 en 2 min) voor 4G8, α-SYN, TDP-43 en NeuN-antigenen; gebruik 70% mierenzuur voor 4G8 en α-SYN. Preincubate gedurende 30 minuten in 5% normaal geitenserum.
   2. Incubeer 's nachts bij 4 °C met het primaire antilichaam. Spoel de secties in PBS op de dag erna voor incubatie met het secundaire antilichaam (Envision+ System-HRP-label Polymer) bij een verdunning van 1:2 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   3. Was meerdere malen in PBS en incubeer in chromogene systeem met diaminobenzidine (Liquid DAB+Substrate Chromogen System) kijken naar reactieontwikkeling onder de microscoop (vergroting 4-10x). Tot slot was de secties in PBS. Tegenstrepen de secties in hematoxylin, dehydraat en coverslip met DPX montage.
      OPMERKING: Tabel 8 geeft een overzicht van het standaardprotocol. Voer H&E-kleuring uit op alle secties, terwijl speciale/specifieke vlekken en reacties worden gebruikt op geselecteerde secties. Geselecteerde gevallen vereisen extra gebieden of reacties. Tabel van materialen toont de details van antilichamen die worden gebruikt voor IHC.

11. Fundamentele neuropathologische karakterisering

OPMERKING: Niet-specifieke veranderingen in het hersenweefsel, vasculaire pathologie, alzheimer (AD) pathologie, niet-AD TAUopathieën, synucleinopathieën, TAR DNA-bindend Eiwit (TDP-43) pathologie en hippocampal laesies worden bestudeerd. Een optische microscoop aangesloten op een camera wordt gebruikt om parenchymale microscopische laesies te detecteren. De histologische beoordeling wordt uitgevoerd door hetzelfde team van opgeleid personeel in neuropathologie, waaronder een hoogleraar neurologie, een neuroloog en een patholoog. Het is gebaseerd op een gewijzigde Montine's benadering⁴⁵ (Tabel 8) ook met inbegrip van: (1) Heterogene niet-AD TAUopathieën die het pathologische kenmerk van de Fronto-Temporal Lobe Degeneration (FTLD) in verband met TAU-afzettingen vormen: de ziekte van Pick, niet-vloeiende Primaire Progressieve Afasie (TAU-nfPPA), Progressieve Supranucleaire Palsy (PSP)^46,47 en Cortico-Basal Degeneratie (CBD)⁴⁸. Bovendien omvatten niet-AD TAUopathieën aandoeningen die verband houden met veroudering en zonder duidelijke klinische betekenis, zoals primaire leeftijdsgebonden TAUopathie (PART)⁴⁹, Leeftijdsgebonden TAU Astro-Gliopathie (ARTAG)⁵⁰, argyrofiele graanziekte⁴⁸. (2) Lewy Type Synucleinopathy (LTS) dat gerelateerd is aan de ziekte van Parkinson (PD) en Lewy Bodies Dementia (LBD). Om te zoeken naar LTS, de volgende hiërarchische stappen toe te passen: in eerste instantie, olfactorische bol, hersenstam, amygdala / temporale cortex; als de vorige gebieden positief zijn, voeg limbische structuren (hippocampal vorming, entorhinale cortex, voorste cingulate), middelste frontale gyrus, inferieure pariëtale lobule en occipitale cortex⁴⁵. Als klinische kenmerken van corticale LBD aanwezig zijn (d.w.z. schommelingen en/of hallucinaties), overweeg dan limbische structuren en isocortex voor de eerste stap. (3) TDP-43-deposito's, het pathologische kenmerk van FTLD in verband met TDP-43-deposito's: gedragsvariant van Fronto-Temporal Dementia (bvFTD), Semantische Dementie (SD of svFTD), TDP-nfPPA en FTD-Motor Neuron Disease (FTD-MND). Het IHC voor TDP-43 wordt uitgevoerd op de volgende secties: amygdala, hippocampus, entorhinale cortex en middelste frontale gyrus; in gevallen met vermoedelijke klinische FTLD, overwegen om andere secties te onderzoeken⁵¹.

1. Evalueer niet-specifieke veranderingen in hersenweefsel in geselecteerde secties met behulp van H&E, NISSL, LFB en IHC voor GFAP en NeuN. Denk aan neuronale rarefactie, ballonneuronen, spongiose, gliosis, myelineverlies, de aanwezigheid of afwezigheid van ontstekings- of tumoralinfiles. Geef de heersende locatie van deze wijzigingen op.
2. Om microscopische vasculaire laesieste detecteren, onderzoeken H&E en LFB dia's met inbegrip van ten minste twee hemisferische macro-secties (de eerste die door de mammillaire lichamen (Charcot gesneden) met frontale en temporele kwabben, basale ganglia, voorste thalamus, amygdala, en de tweede die door de occipitale kwab), de "geniculate" sectie van de hippocampal formatie, een cerebellar sectie, en alle drie de belangrijkste delen van de hersenstam (via substantia nigra, locus coeruleus en DMNV).
   1. Detecteer kleine vatziekte, waaronder arteriolosclerose, lipohyalinose, perivasculaire ruimteverwijding, verlies van witte stof, leptomeningeal en/of parenchymale en/of capillaire cerebrale amyloïde angiopathie. Geef sortering (0–3) en overwegend locatie^42,52op . Denk aan de aanwezigheid of afwezigheid van hemosiderinlekkage, microbleeds en microinfarcten.
   2. Evalueer de bijdrage van vasculaire schade aan cognitieve stoornissen met behulp van hiërarchische Deramecourt's regeling (vaatwand veranderingen-kleine vat ziekte-macroscopische infarcten). Voor deze evaluatie overwegen een frontale en temporele kwab sectie, basale ganglia en hippocampus (score 0-20)³⁰. Ook, schat de waarschijnlijkheid dat cerebrale vasculaire ziekte bijgedragen aan de cognitieve stoornissen met behulp van VCING score (low-intermediate-high), verkregen door het overwegen van hemisferische macroscopische infarcten en kleine vat ziekte van de occipital kwab met inbegrip van matige tot ernstige arterioloverfose en amyloïde angiopathie⁵³.
3. Evalueer AD-pathologie met IHC (4G8) voor amyloïde spread. Definieer thal's stadia (1–5)⁵⁴, geaggregeerde Amyloïde score (0-3)⁴⁵, en morfologie per site (diffuus, focal, gecored).
   1. Evalueer de AD Tau-pathologie met behulp van IHC (AT8) en beschrijf de heersende morfologie per locatie (neurofibrillaire klitten, neuropildraden, neuritische plaques). Definieer braak's stadium (I-VI +; positief teken geeft de aanwezigheid aan van extra gebieden van hyperfosfosfoed Tau pathologie niet volgens de hiërarchie van de Braak)⁵⁵ en geaggregeerde score (0-3)⁴⁵.
   2. Evalueer neuritische plaques met gallyas kleuring en CERAD score (0-3)⁵⁶. Definieer vervolgens de waarschijnlijkheid van de neuropathologische kenmerken die overeenkomen met een AD-klinisch syndroom met behulp van de Amyloid-Braak-CERAD-score (ABC-score 0-3): none-low-intermediate-high⁴⁵. score
4. Gebruik AT8 IHC om de aanwezigheid of afwezigheid van niet-AD TAU-pathologie te zien met een heersende locatie en eigenaardige morfologische foto. Overweeg neuronale insluitsels zoals vlamvormige of globose klitten, bolvormige insluitsels (d.w.z. Pick's bodies)⁵⁷, neuropil draden, dystrofische neurites, argyrophilic korrels; en glia-insluitsels zoals getufte astrocyten, doornige astrocyten, astrocytische plaques, opgerolde lichamen, bolvormige insluitsels^58,59.
5. Gebruik α-syn IHC om LTS (Lewy lichamen, bleke lichamen en Lewy neurites) te detecteren op de gebieden in de bovenstaande noot. In geval van positiviteit, pas McKeith's beoordeling (0-4) toe om de ernst van de laesies⁶⁰te evalueren; gebruik dan de stadia van het strand (I-IV) voor topografische distributie (olfactorische bol, hersenstam overheersend, limbisch overheersend, neocortisch)⁶¹. Vergelijk de podia van Beach en Braak om de relatie tussen LBD en AD pathologie^60,61,62te definiëren .
6. Denk aan de aanwezigheid of afwezigheid van gliacytoplastische insluitsels (GCI; niet Lewy-type glia synucleinopathie) die het pathologische kenmerk van Multiple System Atrophy (MSA) zijn en geef hun heersende locatie⁶³op.
7. Gebruik TDP-43 IHC om TDP-43-stortingen op de gebieden in de bovenstaande nota te detecteren. Identificeer de heersende morfologie per locatie: Neuronale Cytoplasmische Insluitsels (NJI's), Distrofische Neurites inclusions (DN's), Nucleaire Insluitsels (NII's). Definieer het patroon: A (overheersende NCA's en DN's: bvFTD en nfPPA); B (overheersende NCA's: FTD-MND); C (overheersende lange DN's: svPPA en bvFTD)^51,64. Gebruik het schema van Nelson om de aanwezigheid van TDP-43 in AD-gevallen^65,66te definiëren .
8. Evalueer de hippocampus vanaf subiculum en Sommer sector (CA1). Gebruik de score van de Rauramaa (0-4): 1-2 voor microinfarcten en macro-infarcten, respectievelijk; 3–4 die overeenkomt met respectievelijk matig en ernstig neuronaal verlies en hippocampale atrofie (hippocampale sclerose: GS). Wijs op de aanwezigheid of afwezigheid van pathologische eiwitafzettingen (in afnemende volgorde van frequentie: pTAU, TDP-43, α-syn)⁶⁷.
9. Definieer de neuropathologische diagnose en voer alle pathologische gegevens in de database in.
   LET OP: De ruimten waarin het biologische materiaal en de verstandige gegevens van de donoren worden opgeslagen zijn altijd vergrendeld en alleen het geautoriseerde personeel mag binnenkomen om zowel de veiligheid als de privacy te garanderen. Het bevroren biologische materiaal wordt opgeslagen in afgesloten vriezers bij -80 °C, terwijl formeel vaste paraffine-ingebedde weefsels worden opgeslagen in afgesloten kasten bij kamertemperatuur. Er worden dubbele motorvriezers gebruikt en er is ook een back-up vriezer aanwezig. Bovendien, om ervoor te zorgen dat de vriezers altijd werken, zijn ze voorzien van een 24/7 monitoring systeem dat een alarm veroorzaakt. Een noodgenerator is ook aanwezig, in geval van stroomuitval. De deelnemers worden geanonimiseerd met een numerieke code om hun privacy te waarborgen; het is niet mogelijk voor niet-geautoriseerd personeel om terug te gaan naar de identiteit van de donoren en hun verstandige gegevens. Alle informatie wordt verzameld in een met een wachtwoord beveiligde database; Ook wordt een papieren kopie van deze gegevens bewaard in vergrendelde archieven.

Results

Hersenen donoren en hersenen oogsten gegevens
In 2014 begon de werving van donoren tijdens de tweede InveCe.Ab-follow-up, waarbij 1010 van de 1061 in aanmerking komende proefpersonen betrokken waren (responspercentage: 93%; Figuur 1). Met betrekking tot de InveCe.Ab longitudinale studie, 290 van de 1010 deelnemers (28,7%) overeengekomen zich te registreren als donor (160 reeds ingeschreven en 130 die hun voornemen om zich te registreren uitgesproken). Het opleidingsniveau is hoger bij donoren dan bij niet-donoren (66% van onze donoren heeft een middelhoog opleidingsniveau: 8 of meer jaar school), wat het belang van cultuur en onderwijs aangeeft. Veel "gezonde" individuen toonden ook interesse in de hersenen donatie programma. De meeste van onze "controles" bekennen dat ze kunnen sympathiseren met de zieke en hun familieleden, en willen een of andere manier bijdragen aan onderzoek leidt tot een beter begrip van neurologische ziekten. Onbaatzuchtige mensen die regelmatig zich bezighouden met bloed of merg donatie programma's tijdens het leven zijn meer open voor het idee van hersendonatie, net als mensen die al hebben ingestemd met organen te doneren na de dood. Ze zijn zich bewust van het feit dat, ook al zou er geen levende ontvanger, hun donatie zou van groot belang zijn voor onderzoek. Een andere factor die bijdraagt aan hersendonatie is de voorkeur om gecremeerd te worden. Momenteel omvat de ABB donorpopulatie in totaal 427 personen (290 InveCe.Ab deelnemers + 137 vrijwilligers of patiënten van het ASP Golgi-Redaelli Geriatrie Ziekenhuis), waarvan 75% 70 jaar of ouder. Er is een duidelijk overwicht van vrouwen (64%) en mentaal intacte ouderen (ongeveer 85%). Tot nu toe zijn 27 hersenen geoogst van de 40 overleden donoren (67% autopsiepercentage); 13 proefpersonen zijn niet onderzocht om verschillende redenen, waaronder het niet melden van de dood aan ABB, ernstige verwondingen die leiden tot vernietiging van de hersenen, gevaarlijke infectieuze ziekten en 1 CJD geval; 4 proefpersonen hebben hun toestemming ingetrokken. Tot nu toe kregen 24 van de 27 geoogste hersenen een volledige neuropathologische karakterisering met een duidelijke clinico-pathologische diagnose, terwijl de overige 3 hersenen nog onderzocht worden(tabel 3). Aanvullende gegevens over het oogsten van hersenen van ABB zijn: gemiddelde leeftijd bij overlijden (81 jaar); gemiddelde postmortem interval (10.37 uur); gemiddelde CSF-pH (6,64); gemiddelde pH van weefsel (6.07); gemiddeld hersengewicht (1012,86 gr); AFS was 1 op de 90% van de overleden proefpersonen.

Neurofysiologische biomarkers (QEEG)
QEEG maakt deel uit van de multidimensionale aanpak. Het is een eenvoudige, niet-invasieve en goedkope methode, met een waarschijnlijk potentieel om conversie van milde Neuro-Cognitieve Stoornis (mild-NCD of MCI) te detecteren naar grote Neuro-Cognitieve Stoornis (major-NCD of dementie). Door onze multidimensionale aanpak wordt een eenvoudig QEEG-onderzoek uitgevoerd en wordt de mogelijke rol als biomarker voor dementie getest. Onze gegevens over een voorlopige reeks van 36 hersendonoren (18 normale ouderen (NOLD), 11 mild-NCD en 7 major-NCD; 9 waarvan met een duidelijke neuropathologische diagnose) geven aan dat het gemiddelde alfaritmepercentage aanzienlijk lager was bij major-NCD in vergelijking met mild-NCD (p: 0,002) en NOLD (p: 0,033). Daarentegen waren de tragere EEG-frequenties (theta/delta) in de major-NCD aanzienlijk hoger dan in NOLD/mild-NCD (zie de voorbeeldgevallen in figuur 4). In onze serie kan EEG-ritmeverdeling NOLD/mild-NCD-proefpersonen onderscheiden van major-NDC-patiënten, ongeacht de etiologische diagnose, wat suggereert dat hersenritmes worden beïnvloed door de last van degeneratieve laesies, ongeacht het laesietype. Inderdaad, 7 van de 9 onderzochte hersenen vertonen dementie als gevolg van gemengde pathologieën. De specificiteit met betrekking tot de aard van de pathologie lijkt laag te zijn en de elektrische ritmes van de hersenen lijken meer te worden beïnvloed door de last en topografie van de laesies dan door hun moleculaire aard (Poloni, et al. procedures van AD/PD 2019, Lissabon, niet gepubliceerde gegevens).

Emblematische gevallen
Het ABB-protocol kan in sommige gevallen en voorwaarden nuttig en noodzakelijk zijn. Een voorbeeld is de aanwezigheid van een asymmetrische pathologie(figuur 5). Ons protocol is zeer geschikt voor de identificatie en juiste karakterisering van dit type pathologie. Tot nu toe hebben we 4 hersenen onderzocht met asymmetrische betrokkenheid, waarvan sommige zijn weergegeven in figuur 5. Macroscopisch, rechts atrofie (Figuur 5A) is aanwezig in een geval met ernstige ventriculaire dilatatie in de rechter coronale sectie ( Figuur5C) in vergelijking met de linkerkant ( Figuur5B). Een ander geval toont infarct van de rechterhersenhelft(Figuur 5D) en een ander toont een duidelijke atrofie van de juiste mammillaire lichaam (Figuur 5E). Op microscopisch niveau vertoont een geval van FTLD een asymmetrische TDP-43-positiviteit die in de rechterfrontzijde intenser is in vergelijking met links(figuur 5F,G).

Macrosecties (figuur 6A,C) worden gebruikt om een algemeen beeld te krijgen. LFB-kleuring helpt bij het identificeren van myelineverlies(figuur 6D)en IHC voor zowel 4G8 als AT8 (figuur 6B) maakt het mogelijk om de verdeling van de immunoreactiviteit in de hemisferen met het blote oog te evalueren. In de ABB-serie, hersenen van verwante individuen zijn beschikbaar om te worden vergeleken.

In figuur 7worden microscopische afbeeldingen van secties uit de hersenen van homozygootlijke tweelingen naast elkaar geplaatst voor een gemakkelijkere vergelijking (tweeling 1 (BB137): figuur 7A,C,E,G,I,K versus tweeling 2 (BB138: figuur 7B,D,F,H,J,L). Zoals in een soortgelijke eerdere studie⁶⁸, beide tweelingen werden vergeleken door klinische en neuropathologische beoordelingen. De tweeling rapporteerde de zelfde diagnose van belangrijke-NCD toe te schrijven aan veelvoudige etiologieën, maar zij stierven twee jaar apart, op leeftijd 83 (zwakzinnigheid-begin bij 72 jaar) en 85 (zwakzinnigheid-begin bij 76 jaar), respectievelijk. Hun hersenen hebben een zeer vergelijkbaar neuropathologisch beeld, met een hoge AD-pathologie geassocieerd met amyloïde angiopathie. 4G8 immunoreactiviteit wordt verspreid over de cortex(figuur 7A,B) en basale ganglia (Figuur 7C,D) met diffuse, dichte en gecoredeerde plaques. Het wordt ook duidelijk gedetecteerd in zowel parenchymale en leptomeningeale vaten van de cortex en het cerebellum (Figuur 7A, B, G-J). Bij een hogere vergroting is capCAA duidelijk zichtbaar(figuur 7G,H). AT8 immunopositieve plaques, klitten en draden zijn diffuus in de pariëtale cortices van beide hersenen(figuur 7E,F,L). Wat de amyloïde- en NFT-pathologielast betreft, wordt tweeling 1 beschouwd als een Thal fase 3 (montine A2) en een Braak fase 5 (montine B3), terwijl tweeling 2 wordt beschouwd als een Thal fase 5 (montine A3) en een Braak fase 6 (montine B3). Ze hadden dezelfde jaren van onderwijs en een soortgelijke levensstijl; echter, een (BB137) was getrouwd en werd weduwe kort na, terwijl de andere was single (BB138). Ze toonden verschillende gradaties van clinico-pathologische variabiliteit met hetzelfde begin en hetzelfde verloop van de ziekte, maar in verschillende tijdskaders. Dit bevestigt het feit dat, hoewel de genetische component een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van de ziekte, de epigenetische en milieucomponent van fundamenteel belang zijn bij het bepalen van iets verschillende manifestaties.

In sommige gevallen komt het klinische beeld niet overeen met de neuropathologische kenmerken. In figuur 8werden twee verschillende gevallen klinisch gedefinieerd als AD-gevallen; neuropathologische analyses tonen, naast een tussenliggende AD-pathologie, een diffuse positiviteit voor α-syn. In het eerste geval toont een ernstige LTS (Beach IV) foto Lewy lichamen homogeen gevonden in de gyrus cingoli (Figuur 8A) en in SN als cytoplasma insluitsels omgeven door neuromelanine ( Figuur8B, C). In het tweede geval worden Lewy-lichamen geassocieerd met Lewy-neurites diffuus verspreid in de amygdala(figuur 8D,E)en in de kern van Meynert(figuur 8F,G) die een limbische LTS-diagnose suggereert. Inderdaad, de topografie van laesies in plaats van hun moleculaire aard produceert de klinische manifestaties.

Figuur 1: Stroomschema van de Inve.Ce.Ab studie. Bij aanvang was de totale prevalentie van dementie 3%. In de loop van de follow-ups waren de prevalentiepercentages: 4,4% (1⁾⁶⁹, 7,1% (2e ), 10,9% (3^nde). De incidentie van acht jaar bedroeg 15 p/1000/jaar (95% BI: 13-18 p/1000/jaar). De werving van donoren is in 2014 gestart (tijdens de tweede follow-up). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Dissectieprotocol van cerebrum (A), cerebellum (F) en hersenstam (H). Cirkel van Willis en enkele hemisferen zijn te zien in (E) en (B). Coronale delen van rechts (C) en linkerkant(D) zijn genummerd en als alternatief vast ("F") en bevroren ("C"). Sagittale cerebellum secties(G) en hersenstam axiale secties (I) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Coronale plakjes vast rechts (A) en links (B) fronto-temporele kwab worden weergegeven.
Hippocampus en temporale kwab (A, R10b) worden gesplitst van de frontale kwab (A, R10a) op de rechter schijf. Op het tegenovergestelde segment zijn de amygdala en basale ganglia (B, L9b) gescheiden van de frontale kwab (B, L9a). Schaalbalk: 1,7 cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Relatieve spectrale stroomverdeling in NOLD en major-NCD-proefpersonen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Representatieve beelden van asymmetrische pathologieën. (A) Eerste geval: hersenen met rechteratrofie. Coronale plakjes (B) en (C) tonen rechtse ventriculaire dilatatie met name duidelijk in de secties 10-12 (C, pijlen). In de secties B en (C) staat "F" voor vast en "C" voor bevroren (in het Italiaans: congelato). (D) Tweede geval: ernstig infarct van de rechterhersenhelft. (E) Derde geval: atrofie van het rechter mammillaire lichaam (pijl). (F, G) Vierde geval: microscopische beelden tonen een intensere TDP-43 immunoreactiviteit in de frontale rechterschors (G) in vergelijking met de linker (F) in een geval van frontotemporale dementie. Schaalbalken: 183 μm (F, G). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Macrosecties. (A, C) Coronale plakjes vaste fronto-temporele kwab (A) en verse pariëtale kwab (C). (B) Histologische fronto-temporele sectie immunolabeled met AT8-antilichaam. Immunoreactiviteit is duidelijk verspreid over de cortex, maar intenser in de temporale kwab. (D) Histologische pariëtale sectie bevlekt met LFB. De pijl geeft een gebied van demyelinatie van de witte stof aan. Weegschaal: 1,55 cm (B, D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Tweelingen. Vergelijking tussen hersenen van twee homozygoot tweelingen: BB137 (A, C, E, G, I, K) en BB138 (B, D, F, H, J, L). De neuropathologische foto's lijken erg op elkaar. (A) en (B) vertonen diffuse 4G8-positiviteit in de occipitale kwab met amyloïde plaque, leptomeningeal (pijlen) en parenchymale (pijlpunten) vaten. Capillaire amyloïde angiopathie (sterretjes) wordt goed erkend bij hogere vergrotingen(G)en (H). 4G8 wordt diffuus verspreid over de basale ganglia(C, D)en rond leptomeningeal schepen van cerebellum (I, J: pijlen). AT8 immunoreactiviteit identificeren klitten, draden en plaques (pijlen) in de pariëtale cortex(E, F). Gallyas kleuring(K)onthult neuritische plaques als AT8 antilichaam (L) doet. Schaalbalken: 470 μm (A–F; I-J); 90 μm (G–H; K-L). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: Klinische versus neuropathologische diagnose. In dit cijfer worden twee verschillende gevallen gemeld waarbij de neuropathologische diagnose verschilt van de klinische diagnose. Immunoreactiviteit voor α-syn is een onverwacht resultaat. (A–C) Eerste geval: Gyrus cingoli (A) toont homogene verdeling van Lewy lichamen in SN (B-pijlen). In een neuron van SN wordt een dubbel Lewy lichaam, omringd door neuromelanine, getoond (C). (D–G) Tweede geval: Een diffuse positiviteit voor α-syn is detecteerbaar in de amygdala (D, E) en Meynert kern (F, G). Cellulaire lichamen en Lewy neurites (sterretje) zijn goed gemarkeerd. Schaalbalken: 154 μm (A, D, F); 37 μm (B, E, G); 20 μm (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 9: Sjabloon overdrachtsovereenkomst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

		N	%
Geslacht	Mannen	607	45.9
	Vrouwen	714	54.1
Geboortecohort	1935	236	17.8
	1936	219	16.6
	1937	264	20.0
	1938	305	23.1
	1939	297	22.5
Burgerlijke staat	Getrouwd	872	66.1
	Samenwonende	13	1.0
	Gescheiden/gescheiden	29	2.2
	Weduwe	325	24.6
	Één	80	6.1
Primair levensberoep	Arbeiders	666	50.6
	Bedienden	459	34.9
	Huisvrouw	191	14.5
Jaren van onderwijs	≤5 jaar	754	57.2
	>5 jaar	565	42.8

Tabel 1: Sociaal-demografische kenmerken van de deelnemers aan de InveCe.Ab-studie.

INCLUSIECRITERIA	UITSLUITINGSCRITERIA
Alle personen van 18 jaar en ouder	Mensen die schaamteloos donatie weigeren
Mensen die op het grondgebied van Abbiategrasso wonen	Mensen die buiten de regio Lombardije wonen
Vrijwilligers die zelf toestemming geven	Discrepanties tussen de potentiële donor en NOKs wensen met betrekking tot hersendonatie
Proefpersonen kunnen niet beslissen met toestemming van NOK	Situaties die de consistentie van de hersenen sterk vernietigen
Dood door een natuurlijke oorzaak	Klinische kuur van <2 jaar tenzij de mogelijkheid van een prionziekte is uitgesloten
	Dood veroorzaakt door moord of zelfmoord, met de noodzaak van een lijkschouwer rapport
	Post mortem interval >30 uur

Tabel 2: Criteria voor hersendonatie.

Nr.	Sex	CODE BB	CODE InveCe	Leeftijd	edu (jr)	Klinische diagnose			Cdr	Afs	PM (uur)	pH-weefsel	pH-drank	neuropathologische diagnose
1	F	BB 37.		87	5	Major-NCD als gevolg van AD (BPSD)			5	2	29	Nd	Nd	Hoge AD pathologie, matige SVD, TDP43+, ctx LTS, HS
2	F	BB 105.		94	5	Major-NCD te wijten aan AD			5	1	5	5.72	6.78	Hoge AD pathologie, milde SVD, HS
3	F	BB 137		83	3	Major-NCD als gevolg van meerdere etiologieën (AD-VaD)			5	1	16	Nd	Nd	Hoge AD pathologie, matige SVD, occipitaal infarct, CAA-capCAA
4	M	BB 181		71	13	Major-NCD als gevolg van AD (BPSD)			5	2	3	Nd	Nd	Ernstige LTS (Strand IV), intermediaire AD pathologie, mildSVD, mCAA
5	M	BB 115	I 636	78	18	Major-NCD te wijten aan AD			5	1	6	Nd	Nd	Intermediate AD, matige SVD, Ontsteking, ILBD (Beach IIa), HS
6	F	BB 23.	I 65	79	3	Major-NCD als gevolg van vasculaire aandoeningen			5	1	14	Nd	Nd	Ernstige en wijdverspreide CAA, tussenliggende AD-pathologie
7	M	BB 102	I 412	79	8	Major-NCD als gevolg van vasculaire aandoeningen			3	1	8	Nd	Nd	Vasculaire Dementie, ILBD
8	M	BB 224	I 16	80	3	Major-NCD door meerdere etiologieën			5	1	11	Nd	5.99	Matige SVD, Lage AD pathologie, ILBD (Beach IIa), HS
9	F	BB 47		78	5	Major-NCD naar multiple etiologieën (LBD-VaD BPSD)			5	0	8	Nd	Nd	Hoge AD pathologie, BG TAU pathologie, ARTAG, milde SVD, HS
10	F	BB 153	I 965	79	5	Mild-NCD (dood als gevolg van darmkanker met wijdverspreide metastase)			0.5	1	8	Nd	6.73	Lage AD pathologie, matige BG-SVD
11	M	BB 118	I 1211	79	13	NOLD (overlijden als gevolg van leverkanker)			0	2	3	Nd	6.51	Matige SVD
12	M	BB 236	I 521	80	3	Major-NCD als gevolg van AD (BPSD)			4	1	15	Nd	6.15	Hoge AD pathologie, Severe BG-SVD (verschillende microbleeds), HS
13	F	BB 138		85	3	Major-NCD als gevolg van meerdere etiologieën (AD-VaD BPSD)			4	0	15	Nd	6.75	Hoge AD pathologie, matige SVD, CAA, limbische TDP43
14	M	BB 109.	I 876	79	8	NOLD (overlijden door hersentumor - GBL)			0	1	16	Nd	6.4	Lage AD pathologie, ILBD (Beach IIa), milde SVD
15	F	BB 271		84	8	Major-NCD als gevolg van AD (BPSD)			4	1	2	Nd	6.7	Intermediair AD, limbische LTS, matige BG-SVD, mCAA, TDP
16	F	BB 71.	I 1080	79	8	NOLD (overlijden als gevolg van hartfalen)			0	0	6	Nd	6.26	Matige BG-SVD, ILBD, amy TDP, lage AD
17	F	BB 189	I 858	80	5	Major-NCD als gevolg van AD (BPSD)			3	0	20	Nd	6.42	Intermediair AD, CAA-capCAA, TDP43, matige BG-SVD, HS
18	F	BB 278	I 924	80	5	Major-NCD als gevolg van LBD (BPSD)			3	1	5	6.02	7.05	Intermediate AD, limbische LTS (Strand IV), limbisch TDP, HS
19	F	BB 247		104	8	Major-NCD als gevolg van meerdere etiologieën (waarschijnlijk gemengde pathologie)			3	0	6	6.48	7.22	TAU pathologie (PART-ARTAG), GS
20	M	BB 85	I 19	83	10	Major-NCD als gevolg van LBD (BPSD)			3	1	9	6.26	7.3	Ernstige limbische LTS, intermediair AD, Matige SVD, ernstige CAA-capCAA, HS
21	F	BB 14.	I 222	82	8	Major-NCD als gevolg van meerdere etiologieën (AD-VaD)			2	1	11	5.59	6.4	Intermediaire AD pathologie, Matige SVD
22	F	BB 282		76	8	Major Frontotemporale NCD (nfPPA BPSD)			3	1	10	6.07	6.39	TDP (type A), ILBD, matige SVD, lage AD, HS
23	F	BB 154	I 1079	80	5	NOLD (overlijden als gevolg van kanker met wijdverspreide metastase)			0	1	5	6.49	6.9	matige SVD, CAA, lage AD, limbische encefalitis
24	F	BB 290		65	13	major Frontotemporal NCD (bvFTD BPSD)			5	1	12	5.73	6.42	TDP (type A)
25	F	BB 210		89	8	Major-NCD als gevolg van AD (BPSD)			5	1	15	5.94	6.4	in uitvoering
26	M	BB 293		75	18	Major Frontotemporal NCD (bvFTD BPSD)			5	1	8	6.14	6.83	in uitvoering
27	F	BB 99	I 1370	79	9	NOLD (dood als gevolg van septische schok)			0	2	14	6.3	7.12	in uitvoering
	M/V			Bedoel	Bedoel				Bedoel	Bedoel	Bedoel	Bedoel	Bedoel
	0.5			81	7.7				3.2	1.0	10.4	6.1	6.6

Tabel 3: Klinische/neuropathologische diagnose van ABB-serie. BB: Brain Bank; edu (jr): onderwijsjaren; CDR: Clinical Dementia Rating (0 = geen dementie; 0,5 = milde cognitieve stoornissen; 1 = milde dementie; 2 = matige dementie; 3 = ernstige dementie; 4 = zeer ernstige dementie; 5 = terminale dementie); AFS: Agonal Factor Score; PM (uur): Post Mortem uur; nd: niet gedaan; M/V: Mannetjes/Vrouwtjes; BPSD: Gedrags- en psychische symptomen van dementie; Vad: Vasculaire dementie; NOLD: Normale ouderen; GBL: Glioblastoom; nfPPA: niet vloeiend Primair Progressief Afasie; bvFTD: gedragsvariant van Frontotemporale Dementie; SVD: Kleine vatziekte; LTS: Lewy Type Synucleinopathie; Gs: Hippocampal Sclerose; CAA: Cerebrale Amyloïde Angiopathie; capCAA: capillaire CAA; mCAA: meningeale CAA; ILBD: Incidentele Lewy Body Disease; BG: Basale Ganglia; ARTAG: Leeftijdsgebonden TAU Astro-Gliopathie; DEEL: Primaire leeftijdsgebonden TAUopathie; amy: amigdala.

Domein	Testnaam
Depressie	Centrum voor Epidemiologische Studies Depressie Schaal (CES-D) [2]
Wereldwijde cognitie	Mini-mental State Examination (MMSE) [1]
Verbaal en visueel geheugen	Gratis en Cued selectieve herinneringstest [3]
	Corsi-test [4]
	Rey-Osterrieth Complex Figure (ROCF) Recall [5]
Aandacht/ psychomotorische snelheid	Trail making A [6]
	Attentional Matrices [4]
Taalsemantisch geheugen	Semantische verbale vloeiendheid (kleuren, dieren, vruchten, steden) [4]
Uitvoerende functies	Trail making B [6]
	Raven's Gekleurde Matrices [7]
Visuospatial vaardigheden	Kloktekentest (CDT) [8]
	Rey-Osterrieth Complex Figure (ROCF) Kopie [5]

Tabel 4: Neuropsychologische beoordeling voor hersendonoren.

Metabolieten

Volledige bloedtelling

Cholesterol HDL en LDL

Triglyceriden

Glucose

Glycated hememoglobine (HbA1c)

Homocysteïne

Cobalamine (vitamine B12)

Foliumzuur

Albumine

Ureum

Creatinine

Transaminases (ALT en AST)

Gamma Glutamyl transferase

Schildklier-stimulerend hormoon (TSH)

Vitamine D (25-hydroxy-vitamine D)

C-reactief eiwit (CRP)

Elektrolyten

Tabel 5: Metabolisch paneel voor hersendonoren.

GENNAAM	dbSNP
Apolipoprotein E (APOE)	rs429358
	rs7412
Catalase (CAT)	rs1001179
Superoxide dismutase 2 (SOD2)	rs4880
Angiotensinogen (AGT)	rs699
Sirtuin 2 (SIRT2)	rs10410544
Translocase van buitenste mitochondriale membraan 40 (TOMM40)	rs2075650
Overbruggingsintegrator 1 (BIN1)	rs7561528
Catechol-O-methyltransferase (COMT)	rs4680
Methyletetrahydrofolaat reductase (MTHFR)	rs1801133
	rs1801131
Hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF)	rs6265
oplosdrager familie 6, lid 4 (SLC6A4 of 5HTT)	Hydroxytryptamine transporter gen-gebonden polymorfe regio (5-HTTLPR)
	rs25531

Tabel 6: SNPs geanalyseerd voor InveCe.Ab hersendonoren.

Proces	Oplossing	Duur
		MACRO-VOORBEELDEN	MICROMONSTERS
Fixatie	10% GEBUFFERD FORMALINE	8 dagen bij 4 °C	8 dagen bij 4 °C
Wassen	FOSFAATBUFFER	2-15 dagen bij kamertemperatuur	2-15 dagen bij kamertemperatuur
Wassen	H2O WASSEN	2-3 uur, kraanwater	2-3 uur, kraanwater
Uitdroging	ETHYLALCOHOL 70%	24 uur	8 uur
Uitdroging	ETHYLALCOHOL 80%	24 uur	4 uur
Uitdroging	ETHYLALCOHOL 90%	60 uur (meestal in het weekend)	4 uur
Uitdroging	ETHYLALCOHOL 95%	12 uur	4 uur
Uitdroging	ETHYLALCOHOL 95%	12 uur	4 uur
Uitdroging	ETHYLALCOHOL 100%	6 uur	4 uur
Uitdroging	ETHYLALCOHOL 100%	6 uur	4 uur
Clearing	XYLENE I	12 uur	10 uur
Clearing	XYLEEN II	12 uur	10 uur
Infiltratie	PARAFFINE I	12 uur	11 uur
Infiltratie	PARAFFINE II	12 uur	11 uur
Insluiten	PARAFFINE WAS

Tabel 7: ABB-protocol voor weefselverwerking.

Regio	H&E	CRESIL VIOLET	LFB	GALLYAS GALLYAS	4G8	AT8	α-SYN	TDP-43	Neun Neun	GFAP (GFAP)
Brainstem
Medulla- Dorsale Motor Nucleus van Vagus	X					X	X
Pons - Locus Coeruleus	X					X	X
Midbrain - Substantia Nigra	X				X	X	X
Cerebellum
Cerebellar cortex en Dentate kern	X	X	X		X
Cerebrum
Middelste frontale gyrus	X	X	X		X	X	X	X
Basale Ganglia + kern van Meynert	X	X	X		X				X	X
Cingulate, voorste	X	X	X		X		X		X	X
Amygdala	X					X	X	X	X	X
Thalamus en Subthalamische kern	X					X
Superieure en midden temporale gyri	X	X	X	X	X	X	X		X	X
Hippocampus en Entorhinale cortex	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Inferieure pariëtale lobule	X	X	X	X	X	X	X
Occipitale cortex	X		X		X	X	X
Reukbol	X						X

Tabel 8: Beoordeelde gebieden, kleuring en immunohistochemie.

Discussion

Kritieke stappen in het protocol
Ons doel is om weefsels van goede kwaliteit te verkrijgen, te karakteriseren en op te slaan afkomstig van proefpersonen met een gedetailleerde geschiedenis die is afgeleid van longitudinale observatie. Om dit doel te bereiken, is het nodig om de volgende belangrijke aspecten te behandelen. Zoals hierboven beschreven, begint het protocol met de aanwerving van donoren, wat de eerste cruciale stap is. Vervolgens is het noodzakelijk dat de donoren het follow-upprogramma voortzetten en de hechting aan het project na verloop van tijd behouden tot de werkelijke donatie van de hersenen. Op het moment van overlijden is het noodzakelijk dat het ABB-personeel onmiddellijk op de hoogte wordt gebracht om het autopsieteam binnen 24 uur bijeen te roepen, wat belangrijk is voor een adequate weefselkwaliteit. Vers snijden van de hersenhelften vereist een vaste hand en een specifieke training. Om te voorkomen dat cellulaire schade veroorzaakt door langzame bevriezing en het verkrijgen van een goede kwaliteit plakjes voor de cryostat en Omics, is het belangrijk dat ze snel worden bevroren. Gezien de snelheid van penetratie van formaline oplossing (1 mm /uur), om weefsel antigeniciteit te behouden de weken tijd van de enkele plak wordt gehouden op zijn minimum.

Probleemoplossing van de methode
Om de hierboven genoemde kritische stappen aan te pakken bieden wij de volgende aanpak. Donor werving en naleving van follow-ups: Er zijn verschillende factoren die hersendonatie belemmeren, waaronder angst voor het beschadigen van het lichaam figuur, zuiverheid en integriteit, of van de mogelijkheid van het voelen van pijn na de dood. Sommigen maken zich zelfs zorgen dat de autopsie kan worden uitgevoerd terwijl ze nog in leven zijn^70,71. Bezorgdheid over verstoring van de uitvaartregelingen en de financiële lasten zijn ook aanwezig⁷². Bovendien kan het gebrek aan kennis van een medisch personeel over postmortemprocedures en het onvermogen om de zorgen van potentiële donoren of hun NOK aan te pakken, de registratie ontmoedigen. Al deze factoren kunnen leiden tot een laag niveau van bewustzijn met een laag aantal ingeschreven deelnemers en een hoge kans op donorverlies na verloop van tijd. Het wervingsprogramma voor donoren moet immers efficiënt zijn in het verspreiden van bewustzijn, het wekken van vertrouwen en het overtuigen van mensen om zich te registreren en hoge percentages follow-up participatie te handhaven. In onze ervaring wordt dit gedaan door zorgvuldige selectie van potentiële donoren en een grondige uitleg van de doelstellingen van de BB. Wij bieden educatieve activiteiten en een empathische aanpak gericht op de angsten en behoeften van zowel gezonde mensen als mensen die getroffen zijn met neurodegeneratieve ziekten en hun families. We merken dat potentiële donoren meer kans hebben om hun toestemming te geven wanneer ze persoonlijk worden benaderd. Een face-to-face benadering creëert een relatie gebaseerd op wederzijds vertrouwen en respect die van fundamenteel belang is voor het bereiken van een hoog percentage van de registratie van hersendonatie en follow-up beoordelingen. Een hoog opgeleid personeel met een sterk gevoel voor ethiek benadert eerst de potentiële donor, bespreekt de mogelijkheid om de hersenen te doneren na de dood, verklaart de waarde van menselijk hersenweefsel aan neurowetenschappelijk onderzoek en verduidelijkt elke twijfel met betrekking tot postmortemprocedures. Gunstige mond-tot-mondreclame is even belangrijk. Na het oogsten van de hersenen wordt de nodige aandacht en zorg gegeven om het kadaver opnieuw samen te stellen. Het is belangrijk om respect en dankbaarheid te tonen aan de overledene door de behandeling van het kadaver zachtjes. Een paar maanden later is een vergadering gepland om de resultaten van de neuropathologische analyse te communiceren wanneer gevraagd door familieleden.

Het tijdstip van overlijden en hersenoogst: Wanneer de persoon accepteert, worden ze donor en krijgen ze een identiteitskaart met een nummer om 24 uur per dag, 7 dagen/week contact op te nemen (het ontvangstnummer van het ASP Golgi-Redaelli Geriatrie Ziekenhuis dat met ons verbonden is). Bovendien wordt een kleeflabel gegeven aan de familieleden die in geval van ziekenhuisopname moeten worden gebruikt. De uitvaartorganisaties van het gebied werden eerder geïnformeerd om het lichaam naar de ABB-faciliteiten te brengen, waar het autopsieteam wordt opgeroepen. Het autopsieteam bestaat uit een patholoog, een neuroloog en/of een neurobioloog en een anatomisch ruimtetechnicus, die dagelijks van 6.00 tot 23.00 uur op afroep zijn; sommige studenten in opleiding zijn ook vaak aanwezig om te helpen en foto's te maken.

De precisie en consistentie van de verse snijprocedures worden gewaarborgd door de betrokkenheid van dezelfde twee operatoren (een neuroloog en een patholoog) die de methode hebben ontwikkeld en meerdere jaren ervaring hebben in neuropathologie. Bij het bevriezen van de plakjes, worden ze op een voorgevooi aluminium lade en bedekt met een in elkaar grijpende aluminium plaat om ze goed plat te houden. Onmiddellijk daarna worden ze gedurende 3 minuten in vloeibare stikstof gestopt, voordat ze op -80 °C worden opgeslagen. De vast te stellen plakjes worden individueel verpakt in gaas en gedrenkt in een 10% fosfaatgebufferde formalineoplossing, die na één dag wordt vervangen. Vervolgens worden ze in formalin niet meer dan 5 extra dagen bewaard; gezien het feit dat de formaline oplossing doordringt op 1 mm/dag, willen we de wekende tijd verder verkorten.

Beperkingen van de methode
De hier beschreven onderzoeksmethode bestrijkt slechts een beperkt geografisch gebied en de personen die betrokken zijn bij het donatieprogramma bezitten kenmerken die niet volledig de algemene bevolking vertegenwoordigen. Hoewel meer dan aanvaardbaar, een postmortem interval tot 24 uur kan veranderingen veroorzaken in sommige eiwitstructuren, enzymen en RNA van hersenweefsel. De bepaling van AFS en pH is mogelijk niet helemaal toereikend voor het bepalen van de weefselkwaliteit⁷³ en we ontwikkelen andere manieren om de weefselkwaliteit te verifiëren op basis van RNA-integriteit.

Wat de microtomesnijdensprocedure betreft, hoewel zeer nuttig voor het reconstrueren van anatomische relaties, moet worden opgemerkt dat het gebruik van macrosecties niet eenvoudig is en een aantal technische problemen met zich meebrengt. Onze methode is uitdagend en tijdrovend. De kosten zijn vrij hoog en de financiering is niet altijd gemakkelijk. De financiering komt voornamelijk uit het publiek (ASP Golgi-Redaelli Geriatrie Ziekenhuis) en particuliere middelen (Golgi-Cenci Foundation), particuliere donaties, non-profit organisaties (bijvoorbeeld "Federazione Alzheimer Italia") en subsidies participatie.

Het belang van de ABB-methode met betrekking tot bestaande/alternatieve methoden
In het begin richtte ons hersendonatieprogramma zich op personen die deelnamen aan de InveCe.Ab longitudinale studie. Als gevolg hiervan gaan de gedoneerde hersenen vergezeld van gedetailleerde klinische, biologische en sociale informatie die in de loop der jaren is verzameld. De kracht van ABB ontleent juist aan deze onderscheidende oorsprong. Het bestuderen van een groep sociaal en genetisch verwante mensen die biologische kenmerken en blootstellingen aan het milieu delen, bevordert de statistische analyse. Bovendien omvat de studie de volgende voordelen: 1) Het verzorgen en voorzien in de behoeften van de gemeenschap (de handeling van "geven voordat het vraagt"): mensen krijgen een gratis periodieke controle waarvan de huisarts op de hoogte wordt gesteld, een telefoonnummer van onze secretaresse wordt verstrekt voor consultaties en ernstig gehandicapten thuis worden bezocht; 2) Het betrekken van deelnemers, mensen met openbare rollen en huisartsen bij educatieve activiteiten door middel van de organisatie van periodieke seminars (gerelateerd aan de gezondheid van de hersenen, hersendonatie en algemene gezondheid), en de planning van thematische cursussen (bijvoorbeeld het gebruik van informatietechnologie-apparaten voor ouderen); 3) Mensen ontmoeten en een persoonlijke benadering aannemen. Al deze elementen vormen de kracht van het ABB-project. Bovendien verbetert het project de klinische capaciteiten van betrokken medisch personeel, omdat het ervaring opdoet in zowel antemortem-beoordelingen als postmortem neuropathologische evaluaties. In dit verband willen we de zeer eigenaardige ervaring van "De minderheid veroudering onderzoek studie noemen". Deze studie betrof een beperkt en geselecteerd aantal Afro-Amerikanen woonachtig in de omgeving van Chicago (784 van de 1.357 in aanmerking komende onderwerpen: respons van 57%). De deelnemers werden jaarlijks thuis bezocht en werden gevraagd om deel te nemen aan het hersendonatieprogramma. Deze studie is gebaseerd op een ongebruikelijke benadering met enkele gelijkenissen met de onze het verkrijgen van hoge percentages van positieve respons op de hersenen donatie programma (352 donoren van de 784 deelnemers waren ingeschreven: 44%), zij het autopsiepercentage was niet helemaal bevredigend (53%)⁷⁴. Net als in "The minority aging research study" bieden wij educatieve activiteiten en een empathische aanpak, die uitstekende resultaten opleveren. In het bijzonder, onze respons is 93%, het inschrijvingspercentage is 28,7%, en het autopsiepercentage op dit moment is 67%. Deze percentages tonen aan dat projecten die mensen rechtstreeks betrekken een aanzienlijker percentage van de donaties hebben. Andere hersenen donatie programma's, met minder aandacht voor het opbouwen van een relatie met potentiële donoren, hebben over het algemeen een laag inschrijvingspercentage, die ongeveer 10-15% of minder^73,75.

Er zijn weinig eerdere cohortstudies die eindigen met een neuropathologische analyse. Bovendien, de meerderheid van de hersenen banken en repositories zijn ziekte-gecentreerd en er is een schaarste van "controle" hersenen van gezonde donoren in vergelijking met het aantal "zieke" hersenen. Slechts een beperkt aantal BB's is gebaseerd op bevolkingsstudies waarbij zowel zieke als normale proefpersonen betrokken zijn om verouderingstrajecten^73,74,76,77,^78,,79,80te bestuderen . Sommige studies zoals "The minority aging research study" in de VS⁷⁴ en "The Vantaa 85 + studie" in Finland⁷⁶ zijn vergelijkbaar met de onze, maar ze hebben de neiging om op te raken met de beëindiging van het cohort. In plaats daarvan is het de bedoeling dat het donatieprogramma van ABB in de toekomst nog lang zal worden voortgezet, waarbij potentiële donoren worden ingeschakeld en follow-ups worden ingeperkt, zelfs na het einde van de longitudinale studie van InveCe.Ab. Deze aanpak maakt onze wervingsmethode vergelijkbaar met die van het "Sun Health Research Institute (SHRI) brain donation program" dat is gericht op een pensioen gemeenschap⁷³. Het SHRI-protocol voor hersendonatie is zeer efficiënt met het kortste gemiddelde postmortem-interval ter wereld (3,92 uur). Net als bij de grootste BB's ter wereld, de SHRI protocol gewoon gesneden de cerebrum, cerebellum en hersenstam in de middellijn (sagittale vlak), dan is de ene helft ontleed vers en bevroren voor biochemische studies, terwijl de andere is vastgesteld in formaline voor de histopathologische beoordeling. Echter, een van de sterke punten van de SHRI dissectie protocol is de fixatie van individuele plakjes in plaats van de hele hemisfeer. Inderdaad, het fixeren van een halfrond als geheel is niet optimaal, vanwege de verschillende fixatiegradiënten tussen het oppervlak en de kern. Bovendien kunnen de corticale eiwitten worden beïnvloed door langdurige blootstelling aan de formalineoplossing. Dus, de reden waarom we besloten om individuele plakjes vast te stellen.

De beslissing over welke kant is vastgesteld of bevroren, hangt af van de enkelvoud bank (altijd dezelfde, willekeurig toegewezen of toegewezen, afhankelijk van of de dag van dissectie is oneven of zelfs)^{31,32,33,34,35}. Biochemische en histopathologische analyse worden dus afzonderlijk uitgevoerd op elk halfrond. Omdat veel neurologische ziekten asymmetrisch zijn, biedt onze BB een uniek protocol voor het snijden van verse exemplaren: alternatieve secties uit de hersenstam en van elk halfrond van cerebellum en cerebrum worden bewaard als vast of bevroren materiaal; een vast plak op één hemisfeer beantwoordt aan bevroren op de andere hemisfeer. Onze methode geeft de mogelijkheid om een volledige histologische karakterisering van alle bevroren materiaal te verkrijgen en de resultaten van alle gebieden van beide zijden te vergelijken. Zoals gezegd in de inleiding, de beschreven methode stelt ons in staat om zoveel mogelijk informatie te verkrijgen uit het hersenweefsel. Bovendien levert de methode van ABB een fundamentele maar volledige neuropathologische karakterisering op, waaronder bijna alle bekende herseneiwitopathieën en vasculaire pathologie. Vanwege de controversiële rol van vasculaire verwondingen bij het bepalen van cognitieve stoornissen, hebben we besloten om een dubbele score te gebruiken voor de vasculaire last^30,53.

Zoals uitgelegd in het protocol, hanteren we een multidisciplinaire aanpak. Hoewel dit een tijdrovende en moeizame methode is, geloven we dat het verschillende voordelen biedt voor onderzoek. Bijvoorbeeld, in een eerder werk, hebben we aangetoond dat hoge tHcy per se, of MTHFR C677T TT in verband met de APOE-ε4 allel, kan worden gerelateerd aan uitvoerende disfuncties in plaats van geheugenverlies⁸¹. Daarom kan het interessant zijn om proefpersonen met dit specifieke genetische profiel op neuropathologisch niveau te evalueren. Dit is een voorbeeld van hoe een dergelijke diepgaande follow-up nuttig is bij het creëren van nieuwe onderzoekshypothesen verifieerbaar door onderzoek van biologisch materiaal verzameld in onze bank. Een andere demonstratie van het voordeel van onze aanpak is de opname van QEEG in de beoordelingen die we routinematig uitvoeren, voor de originaliteit en het relatieve gebruiksgemak. Inderdaad, EEG detecteert de synaptische activiteit van de hersenschors door het registreren van de elektrische mogelijkheden van dendrieten die behoren tot corticale piramidale neuronen⁸². QEEG kan worden beschouwd als een biomarker voor de schatting van corticale synaptische activiteit die gerelateerd is aan cognitie⁸³. In het bijzonder is een afname van alfaritmes in het achterste deel van de hersenen met een algemene toename van lagere frequenties (theta- en deltaritmes) gerelateerd aan corticale verbindingsverdeling. Er moet worden aangenomen dat de meeste diagnostische correlatiestudies zijn gebaseerd op een klinische diagnose die slechts een waarschijnlijke en niet-definitieve diagnose is^84,85,86,87. Slechts zeer weinig gerichte studies hebben QEEG-gegevens vergeleken met het neuropathologische beeld om de correlatie tussen QEEG- en LTS-varianten⁸⁸,^89,en het onderscheid tussen FTLD en AD⁸³te onderzoeken . Door onze studie te beëindigen met een definitie van de neuropathologische diagnose, is het dan mogelijk om de waarnemingen van de cerebrale elektrische activiteit correct te interpreteren. Bovendien kunnen we bij het uitvoeren van seriële QEEG in elk onderwerp intra-individuele EEG-golven traject en hun correlaties met het neuropathologische beeld volgen. Na individuele wijzigingen van corticale elektrische activiteit na verloop van tijd kan leiden tot een beter begrip van de betekenis ervan als een biomarker voor beginnende dementie.

Toekomstige toepassingen en richting van de methode
De uitvoering van de weefseldistributie is een van onze belangrijkste prospectieve doelen. Om dit te doen, hebben we net een wetenschappelijke commissie opgericht met inbegrip van de directeur van de GC Foundation (geriater), een academicus van neurologie van de Universiteit van Pavia, een neuroloog en een patholoog zowel van de GC Foundation & de Geriatrisch Ziekenhuis ASP Golgi-Redaelli. Bij de distributie van hersenweefsel, histologische dia's en andere biologische monsters, is het belangrijk om te onthouden dat donoren ingestemd met de donatie omwille van het onderzoek. De distributie van materiaal moet daarom voorzichtig plaatsvinden, zoals beschreven in de BNE-gedragscode⁴⁰. Elke partij die een aanvraag om materiaal indient, moet het type en de hoeveelheid van het benodigde monster vermelden, een beschrijving geven van het onderzoeksproject en hoe de monsters zullen worden gebruikt en waar mogelijk bewijs leveren van eerdere publicaties (voor de overdrachtsovereenkomst, zie figuur 9). De hersenbank werkt niet voor financieel gewin. De door onderzoekers betaalde vergoedingen mogen dus alleen de kosten dekken van de inkoop, verwerking, opslag en distributie van weefsels.

Plannen om te beginnen met het analyseren van gevallen met exome sequencing en Omics technieken, zoals proteomics en transcriptomics, zijn in beweging. Onze alternatieve bemonsteringsmethodologie zal het mogelijk maken omics studies uit te voeren op histologisch goed gedefinieerde weefsels van beide hemisferen. Door deze benadering zal het mogelijk zijn om het patroon van genactivering in verschillende hersengebieden van hetzelfde halfrond en in de overeenkomstige gebieden van het andere halfrond te vergelijken en genactivatie te correleren met histopathologie. Op dit gebied zouden deep learning-toepassingen van groot belang zijn, waaronder geautomatiseerde analyse van histologische dia's en een geavanceerde correlatie van klinische, histologische en omics gegevens. Andere correlaties tussen veel verschillende variabelen kunnen worden geïdentificeerd, evenals andere mogelijke technologische toepassingen. De beschikbaarheid van bevroren materiaal van beide hemisferen zal een nauwkeurige topografie van genactivering en eiwitdistributie mogelijk maken. Dit zal van bijzonder belang zijn, zelfs bij gezonde proefpersonen, gezien het feit dat zowel hersenfuncties als sommige ziekten asymmetrisch zijn.

Bovendien kunnen we celculturen verkrijgen van goed gekarakteriseerde hersendonoren. Celculturen uit de leptomeninges van geoogste hersenen leveren levende cellen die kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek van ziekten of verouderingsmechanismen, door middel van de geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) technologie die leptomeningeale fibroblasten herprogrammeert en ze in neurale cellen in geavanceerde modellen⁹⁰onderscheidt.

Naarmate de hersenen ouder worden, kunnen verschillende profielen van verandering optreden op moleculair, cellulair en weefselniveau. Elk brein is uniek. Elk heeft zijn eigen manier van reageren op interne en externe stressoren; sommige verzetten zich terwijl anderen bezwijken en vertonen verschillende pathologieën. Discrepanties tussen de klinische presentatie en het neuropathologische beeld bestaan vaak omdat de topografie van de laesies, in plaats van hun moleculaire aard, de klinische presentatie bepaalt. De juiste en definitieve diagnose kon alleen worden bereikt door het klinische syndroom te combineren met de neuropathologische bevindingen die vaak belangrijke etiologische aanwijzingen toevoegen die nodig zijn om de pathogenese van de ziekten te ontrafelen. In Europa wordt gewerkt aan een standaardbenadering van neuropathologische diagnose. Ons diagnostisch protocol volgt bijna volledig de onlangs gepubliceerde richtlijnen over neuropathologische diagnose voor hersenbankieren⁹¹. Dit zal ons toelaten om goed gedocumenteerd hersenweefsel te verzamelen en te delen, met het toekomstige doel om de eerste Italiaanse Hersenbank op te richten. Inderdaad, in Italië zijn er hersenen repositories, maar niet hersenen banken op basis van cohort studies. Ons doel is om een methode te ontwikkelen voor het oogsten van hersenweefsel die breed kan worden geïmplementeerd in heel Italië, om een netwerk op te zetten dat gebruik maakt van een gemeenschappelijk protocol en vergelijkbaar materiaal deelt. Om dit te doen, de betrokkenheid van andere onderzoekscentra en de oprichting van een specifieke website behoren tot de belangrijkste doelstellingen voor de toekomst.

Innovatieve technologieën worden voortdurend gebruikt voor de analyse van de moleculaire aard van neurodegeneratieve ziekten en voor biomarker identificatie. In deze context zal er een toenemende behoefte aan hersenen gepaard gaan met informatie over cognitieve en verouderingstrajecten verkregen door longitudinale studies, waarbij het belang van een neuropathologisch geverifieerde epidemiologische benadering⁹²wordt benadrukt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm	BD	405253
Anti-GFAP	Dako	Z0334	policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8)	ThermoScientific	MN1020	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8)	BioLegend	800703	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board	BD	352070
DMEM High Glucose	Carlo Erba	FA30WL0101500	medium
Electrical saw with 5d blade	CEA	06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm	CEA	70064.250 HHH
Electrode pH needle	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Dako	K4001	secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP	Dako	K4003	secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether	SMI	8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm	Fisher Scientific	11749798
Fetal Bovine Serum	Carlo Erba	FA30WS1810500	medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical	Uvex	500XG
Gloves	CEA	01.28.14
Glue	Arcobaleno	2624000800002
Head supporter	Lacor	60456
L-Glutamine (100X)	Carlo Erba	FA30WX0550100	medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape	CEABIS	CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide	UHU Bostik	8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140050	medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm	CEA	03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Surgical mallet and surgical cisel	CEA	79.68.88
Surgical scissor	CEA	27.08.45/79.68.64
	Feather	M130RC