Fibroblast-afgeleid 3D-matrix systeem dat van toepassing is op endotheliale buis vorming assay

Samenvatting

Het doel van deze methode is om fibroblast-afgeleide 3D-matrices te verkrijgen als een natuurlijke steiger voor volgende cellulaire assays. Fibroblasten worden in een voorbehandelde kweek plaat geseeid en gestimuleerd met ascorbinezuur voor matrix generatie. Matrices zijn decellularized en geblokkeerd voor de kweek van relevante cellen (bijv. endotheel cellen).

Samenvatting

De extracellulaire matrix (ECM) is een driedimensionale steiger die fungeert als de belangrijkste ondersteuning voor cellen in weefsels. Naast zijn structurele functie neemt de ECM ook deel aan Celmigratie, proliferatie en differentiatie. Fibroblasten zijn het belangrijkste type cellen die de ECM-vezel regeling en-productie wijzigen. Bij kanker, CAFs (kanker geassocieerde fibroblasten) zijn in permanente activeringsstatus, deelnemen aan ECM-remodeling, faciliteren van tumor Celmigratie, en het stimuleren van tumor-geassocieerde angiogenese, onder andere Pro-tumorigenic rollen. Het doel van deze methode is het creëren van een driedimensionale matrix met een vezelsamenstelling die vergelijkbaar is met in vivo matrices, met behulp van vereeuwigd fibroblasten of menselijke primaire CAFs. Fibroblasten worden gekweekt in voorbehandelde celkweek platen en geteeld onder ascorbinezuur stimulatie. Vervolgens worden fibroblasten verwijderd en worden matrices geblokkeerd voor verdere celseeding. In dit ECM-model kunnen fibroblasten worden geactiveerd of aangepast om verschillende soorten matrix te genereren, waarvan de effecten in de celkweek kunnen worden bestudeerd. 3D-matrices worden ook gevormd door celsignalen, zoals degradatie of kruislings verbindende enzymen die de vezel verdeling kunnen wijzigen. In deze context, angiogenese kan worden bestudeerd, samen met andere celtypen zoals epitheliale tumorcellen.

Inleiding

De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamische structuur die aanwezig is in alle soorten weefsels. Het bestaat uit eiwitten en polysacchariden die een netto van vezels van cruciaal belang voor celadhesie, migratie en communicatie¹creëren. De samenstelling van ECM varieert afhankelijk van het weefsel. Hoewel type-I collageen het meest voorkomende structurele eiwit is, kunnen collageen typen II, III, V en XI ook worden gevonden in verschillende weefsels². Fibronectine gegenereerd door fibroblasten is nodig voor celadhesie². Bovendien zijn er andere structurele moleculen zoals elastine, laminine en oppervlakte receptoren genaamd integrinen die vezel assemblage bemiddel en specifiek zijn voor de verschillende ECM-weefsels². De ECM speelt een belangrijke rol als een celsteiger en kan ook betrokken zijn bij zowel fysiologische als pathologische processen¹. Afwijkingen in de ECM worden waargenomen bij pathologieën zoals kanker, wat de ECM-samenstelling en/of de organisatie verandert. In tumoren vertegenwoordigt de ECM de niet-cellulaire component van de tumor micro Environment (TME), een complex milieu van celcomponenten zoals fibroblasten, immuuncellen, endotheel cellen, pericytes en een verscheidenheid aan oplosbare factoren. Het is bekend dat de TME bevordert kanker progressie en metastase; kanker-geassocieerde fibroblasten, als een overheersende celtype in de tumor stroma, neem deel aan dit proces³. In tegenstelling tot normale fibroblasten, zijn CAFs in permanente activering, met een verhoogde secretie van ECM-eiwitten en groeifactoren (bijv. transformerende groei factor-β, TGF-β), evenals een hogere uitdrukking van sommige markers, zoals α-gladde spier actine (α-SMA) en fibroblast activerings proteïne (FAP)⁴. CAFs zijn echter een heterogene celpopulatie, die verschillende niveaus van activering of marker expressie⁵weergeeft. Er kan worden aangenomen dat de samenstelling en structuur van fibroblast-afgeleide matrices afhankelijk zijn van fibroblast-status en kenmerken.

In deze context is het doel van deze methodologie om een geschikt in vitro model te creëren voor de opwekking van ECM door fibroblasten, equivalent met de in vivo ECM-instelling. Wij stellen deze aanpak voor als een in vitro translationele methodologie voor verdere studies van tumor celfuncties, zoals chemoresistance of migratie, gemedieerd door ECM. Zoals onze groep elders heeft gepubliceerd, kunnen CAFs worden verkregen uit verse weefselmonsters, maar er moet worden opgemerkt dat het voortbestaan van de CAFs in cultuur beperkt is en dat het nummer van de celpassage wordt verlaagd⁶. Bovendien, CAF primaire culturen die zijn vastgesteld uit de monsters van patiënten kunnen worden gebruikt voor matrix generatie. Manipulatie van genexpressie in fibroblasten is ook een interessante manier om gevarieerde in vitro matrices te produceren om de mogelijke effecten op de matrix samenstelling, Fiber oriëntatie, etc. te beoordelen. Langs deze lijnen heeft onze groep onlangs de rol van de slak-uitdrukken fibroblasten in de samenstelling en Fiber oriëntatie van verschillende afgeleide matrices⁷gerapporteerd.

Bovendien zijn CAFs en ECM betrokken bij het vasculaire systeem, zowel bij het genereren van schepen als als onderdeel van de buitenste laag van de vaas⁸. ECM-remodellering induceert angiogenese; matrix matrixmetalloproteïnases (mmps) lijken het belangrijkste enzym type te zijn dat bijdraagt aan dit proces^9,10. De weefsel vascularisatie van primaire cellen die de ECMs genereren, ECM-macromoleculen, residuele groeifactoren opgenomen in de ECM, matrix elasticiteit en matrix dikte worden beschreven als factoren die betrokken zijn bij de activering van endotheliale cellen¹¹. In tumoren, hypoxie verhoogt ECM stijfheid en endotheliale Sprout generatie¹². Bovendien, CAFs afscheiden vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF) die angiogenese in tumor stroma¹³stimuleren. Op dit gebied, in vitro matrix generatie kan worden gebruikt voor het bestuderen van angiogenese processen of MMP actie onder verschillende experimentele omstandigheden. Zo kan de in vitro reproductie van de meest analoge in vivo matrix een waardevol instrument zijn om de rol van ECM bij de interacties van angiogenese of micro-omgevings cellen te onderzoeken.

Het stimuleren van gekweekte fibroblasten met ascorbinezuur om de matrix depositie te verbeteren en een ECM te genereren, is een geaccepteerde manier om analoge in vivo matrices te produceren. Vereeuwigd fibroblast cellijnen zijn gemakkelijk gekweekt en worden geactiveerd door verschillende groeifactoren, zoals PDGF-BB, tumor necrose factor-α (TNF-α) of TGF-β¹⁴. Binnen de TME, CAFs synthetiseren type-I collageen en fibronectin als de belangrijkste componenten van ECM⁴. Evenzo worden deze componenten gevonden als belangrijke componenten van in vitro gegenereerde, met fibroblast afgeleide matrices (Figuur 1).

Er zijn verschillende in vitro methodieken om in vivo ECM te simuleren. Het gebruik van gecoate kweek gerechten met mengsels van ECM-vezels werd in de afgelopen jaren verlengd, maar deze 2D-aanpak had een verbetering nodig van 3D-structuren, zoals cross-linked gels (bijv. Matrigel)¹. De Matrigel-achtige Setup is uitgegroeid tot de standaardmethode voor het simuleren van een 3D-matrix. Fibrin is ook een alternatief bij het genereren van matrices, maar faalt in termen van sterkte en duurzaamheid van de ECM¹. Collageen dat in combinatie met andere ECM-componenten wordt gebruikt, wijzigt enkele van de bovengenoemde problemen. Deze collageen gels vormen echter een sterk netwerk met vezels die kunnen worden georiënteerd, maar zijn zeer heterogeen, wat een probleem kan zijn in experiment herhalingen¹. Niettemin moet ervan worden uitgegaan dat, afhankelijk van het doel van de experimenten, het gebruik van Matrigel of andere hydrogels geschikter is (bijvoorbeeld in matrix contractie studies waarbij de samentrekking van de gel gemakkelijk kan worden opgespoord).

De potentiële immunogeniciteit van de gegenereerde matrices kan een probleem zijn in experimenten met sommige celtypen. Daarom, om de mogelijkheid van immuunresponsen als gevolg van ECM-genererende cellen bij het gebruik van onze methode te verminderen, zijn matrices decellularized en gewassen, hoewel het verwijderen van celfragment niet in totaal¹⁵kon zijn. De ideale ECM moet compatibel zijn met de celcultuur en kan communiceren en reageren op celsignalen. Onze procedure maakt het mogelijk om zonder problemen veranderingen aan te brengen tijdens de productie van ECM (bijv. het toevoegen van fibroblast-stimulerende groeifactoren).

Protocol

Menselijke weefselmonsters werden verkregen met de goedkeuring van de Raad voor onderzoek ethiek van het ziekenhuis Ramón y Cajal, Madrid.

1. voorbereiding van de oplossingen

1. Bereid 0,2% gelatine oplossing: Voeg 1 g gelatine toe aan 500 mL PBS. Autoclaaf de oplossing en houd deze bij 4 °C. Filter met een 0,22 μm filter voor gebruik.
2. Bereid 1% Glutaaraldehyde: Voeg 1 mL 25% Glutaaraldehyde stamoplossing toe aan 24 mL PBS. Filter met een 0,22 μm filter voor gebruik.
3. Bereid 1 M ethanolamine: bereid ethanolamine oplossing met steriel H₂O. filter met een 0,22 μm filter voor gebruik.
   Opmerking: als ethanolamine is voorzien van een beschermkap, zal een naald en spuit nodig zijn.
4. Bereid ascorbinezuur: Voeg 0,1 mL 50 mg/mL stamoplossing ascorbinezuur (lichtgevoelig) toe aan 100 mL medium.
5. Bereid lysisbuffer: bereid PBS 0,5% Triton 100X met 20 nM van NH₄Oh. Voeg NH₄Oh direct voor gebruik toe.
6. Bereid PBS pen/STREP: Verdun pen/STREP stockoplossing naar 100 U/mL pen en 100 μg/mL STREP.
7. Bereid DMEM met 10% FBS: Voeg 10% FBS toe aan 500 mL DMEM. Supplement met 100 U/mL penicillaire, 100 μg/mL streptomycine, 0,1 mg/mL Normocine en 0,25 μg/mL amfotericine B.
8. Bereid 2% BSA-warmte gedenatureerd: Voeg 2 g BSA toe aan 100 mL steriel water. Warm in kokend water gedurende 7 minuten.
9. Bereid FBS met antibiotica: supplement FBS met 200 U/mL penicillaire, 200 μg/mL streptomycine, 100 μg/mL gentamicine en 2,5 g/mL amfotericine B.

2. voorbereiding van de celcultuur

1. Vereeuwigd fibroblasten cellijn
   1. Cultuur recombinant telomerase gegeneerd vereeuwigd menselijke voor huid fibroblasten (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) in DMEM met 10% FBS en onderhouden bij 37 °C en 5% CO₂.
2. Endotheel cellen
   1. Cultuur humane navelstreng ader endotheliale cellen (huvecs, ATCC PCs-100-013) in EBM-2 medium bevattende 2% FBS en onderhouden bij 37 °c en 5% Co₂.
3. Fibroblast primaire cultuur
   Opmerking: voor CAF oprichting en cultuur, het protocol eerder gepubliceerd door onze groep werd gevolgd⁶.
   1. Kort, snijd weefselmonsters in kleine stukjes van ongeveer 2-3 mm³ en zaad in FBS met een hoge concentratie van antibiotica.
   2. Wanneer de eerste fibroblasten verschenen, vervang medium met FBM medium voor het onderhoud van de cel.
      Opmerking: afhankelijk van de weefsel oorsprong kunnen celculturen gemakkelijk worden verontreinigd. Was monsters in PBS, aangevuld met antibiotica, met sterk verontreinigd weefsel (bijv. Colon⁶) en schud gedurende 30-45 min.

3. fibroblast-afgeleide 3D-matrices (aangepast van Castelló-Cros en Cukierman¹⁶)

1. Voeg 2 mL 0,2% gelatine oplossing toe aan elk goed van een 6-put plaat en inincuberen gedurende 1 uur bij 37 °C of 's nachts bij 4 °C.
2. Aspirate gelatine en was het in 2 mL PBS.
3. Voeg 2 mL 1% Glutaaraldehyde toe en inincuberen gedurende 30 min bij RT. Glutaaraldehyde zal de gelatine kruislings koppelen.
4. Aspirate Glutaaraldehyde en Wash Wells in 2 mL PBS gedurende 5 min. Herhaal 3 keer.
5. Voeg 2 mL ethanolamine van 1 M toe en inincuberen gedurende 30 minuten bij RT. ethanolamine zal handelen om de overgebleven glutaraldehyde te blokkeren.
6. Aspirate ethanolamine en Wash Wells in 2 mL PBS gedurende 5 min. Herhaal 3 keer.
7. Voeg 1 mL DMEM toe met 10% FBS. Als het medium onmiddellijk roze, verwijder het medium, was in 2 mL PBS en voeg opnieuw 1 mL van de DMEM met 10% FBS.
8. Zaai 1 mL fibroblast suspensie, met 5 x 10⁵ cellen in elke put. Het totale volume in elke put is 2 mL.
9. Cultuur cellen tot 100% samenvloeiing is bereikt. Verwijder vervolgens het medium en vervang met DMEM met 10% FBS met 50 μg/mL ascorbinezuur en extra behandeling indien gebruikt.
10. Vervang medium met verse DMEM met 10% FBS en 50 μg/mL ascorbinezuur elke 2 dagen gedurende 6 dagen.
    Opmerking: als er extra behandeling wordt gebruikt (BIJV. PDGF-BB, TGF-β en/of andere kweek factoren), voeg deze dan toe op dezelfde dagen als de behandeling met ascorbinezuur wordt toegevoegd.
11. Twee dagen na de laatste behandeling met ascorbinezuur, verwijder het medium en was in 2 mL PBS.
12. Voeg langzaam 1 mL lysisbuffer toe, voorverwarmd bij 37 °C, aan elk goed. Inbroed voor 5-10 min bij RT tot fibroblasten gelyseerd (waarneembaar onder de Microscoop).
13. Voeg voorzichtig en zonder lysis-buffer te verwijderen 2 mL PBS toe. Zuig vervolgens ongeveer 2,5 mL PBS op. Herhaal dit twee keer voor een totaal van drie washes.
14. Verwijder uiteindelijk 2,5 mL PBS en voeg 2 mL PBS toe met pen/STREP (respectievelijk 100 U/mL en 100 μg/mL). Seal met film en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
    Opmerking: afhankelijk van het experiment kan de lange termijn opslag van de gegenereerde matrices de resultaten beïnvloeden. We raden aan om matrices zo snel mogelijk te gebruiken, en nog meer als het experiment het zaaien van cellen impliceert, als gevolg van mogelijke eiwit degradatie. Als matrices worden gebruikt voor structurele assays, zoals collageen observatie, matrices kunnen worden vastgesteld en opgeslagen voor langere perioden. Dit protocol is geïndiceerd voor een 6-well kweek plaat. Andere platen kunnen worden gebruikt, maar reactieve volumes en celsuspensie concentratie moeten worden herberekend volgens goed gebied.

4. bepaling van de buis vorming

1. Groeien HUVEC cellen in EBM-2 2% FBS tot maximale samenvloeiing.
2. Vervang medium met EBM-2 zonder FBS voor 8 uur.
3. Bereid de matrices voor de zaaien van cellen.
   1. Verwijder matrices uit de koelkast en plaats voor 1 uur bij RT.
   2. Blokkeer matrices door 2 mL warmte-denatured 2% BSA toe te voegen. Incuberen 1 uur bij 37 °C.
   3. Zuig BSA op en was in 2 mL PBS.
4. Zaad 2 x 10⁵ huvec cellen in FBS-uitgeput medium op elke put van een 6-well plaat eerder bekleed met 3D fibroblast-afgeleide matrices.
5. Inincuberen endotheliale cellen bij 37 °C gedurende 16 uur.
6. Onderzoek buis-achtige structuur vorming onder een standaard heldere veld Microscoop bij een vergroting van 20-40x.

Resultaten

PDGF-BB stimuleerde fibroblasten en creëert een dikkere ECM. Herrera et al. toonde aan hoe de door PDGF gestimuleerde fibroblasten een dikkere matrix en een hogere vezel oriëntatie⁷genereerden. BJ-hTERT fibroblasten werden geïnventariseerd met of zonder PDGF en representatieve gebieden toonden een meer uitgelijnde celverdeling in matrices geproduceerd door PDGF-gestimuleerde fibroblast (Figuur 1a). Collageen I en fibro...

Discussie

Matrices kunnen worden gegenereerd met vereeuwigd fibroblasten of primaire fibroblast-culturen. Fibroblasten zijn gemakkelijk te onderhouden in in vitro cultuur met een hoge groeisnelheid en stressbestendigheid. Ze kunnen zelfs worden geïsoleerd van postmortemweefsel³, hoewel verontreiniging een beperking kan zijn, afhankelijk van de weefsel oorsprong.

Het 3D-matrixmodel biedt hier een nieuw en effectief systeem om de ECM-compositie en vezel oriëntatie succesvol te best...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Roth	A990.1
Amphotericin-B	Corning	30-003-CF
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-50G
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning	10-014-CVR
Endothelial Basal Medium (EBM)	Lonza	CC-3121	voeg supplementen toe voor gebruik
Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2)	Lonza	CC-4176
Ethanolamine	Sigma	411000-100ML
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S181B-500	voor gebruik verhit ingeactiveerd
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM)	Lonza	CC-3131	voeg supplementen toe voor gebruik
Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2)	Lonza	CC-4126
Gelatine van runderhuid	Sigma	G9391-100G
Glutaraldehyde	Sigma	g5882
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-100G	lichtgevoelig
L-Glutamine	Lonza	BE17-605E
Normocin	Invivogen	3ANT-NR-2
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CVR
Triton X100	Roth	3051
Recombinant telomerase getransfecteerde geïmmortaliseerde menselijke voorhuidschilfers (BJ-hTERT)	ATCC	ATCC CRL-4001
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	ATCC	PCS-100-013