Methodenartikel

Imaging van de humane immunologische SYNAPS

DOI:

10.3791/60312

⸱

26 december 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-Universidad Autónoma de Madrid, 2Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols CSIC-UAM, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, 3Unidad de Audiovisuales, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beelden zowel de immunologische Synapse vorming en de daaropvolgende gepolariseerde secretoire verkeer naar de immunologische Synapse. Celconjugaten werden gevormd tussen een superantigen-gepulseerde Raji-cel (optredend als een antigeen-presentercel) en een Jurkat-kloon (optredend als effector helper T lymfocyten).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van de methode is om een immunologische Synapse (IS) te genereren, een voorbeeld van cel-naar-celconjugatie gevormd door een antigeen-presentatie cel (APC) en een Effector helper T lymfocyten (th) cel, en om de beelden te registreren die overeenkomen met de eerste stadia van de IS formatie en de daaropvolgende handel gebeurtenissen (zowel in de APC als in de th-cel). Deze gebeurtenissen zal uiteindelijk leiden tot gepolariseerde secretie op de IS. In dit protocol, Jurkat cellen uitgedaagd met Staphylococcus enterotoxine E (zie)-gepulseerde Raji cellen als een cel Synapse model werd gebruikt, vanwege de nabijheid van dit experimentele systeem om de biologische realiteit (th Cell-APC synaptische conjugaten). De hier gepresenteerde aanpak omvat cel-naar-cel conjugatie, timelapse-acquisitie, breedveld fluorescentiemicroscopie (WFFM) gevolgd door beeldverwerking (deconvolutie na overname). Dit verbetert de signaal-ruis verhouding (SRV) van de beelden, verbetert de temporele resolutie, maakt de gesynchroniseerde overname van verschillende fluorochromes in opkomende synaptische conjugaten mogelijk en verlaagt fluorescentie bleaching. Daarnaast is het protocol goed afgestemd op de fixatie protocollen voor het eindpunt (Paraformaldehyde, aceton of methanol), die verdere immunofluorescentie kleuring en-analyses mogelijk maken. Dit protocol is ook compatibel met laser scanning confocale microscopie (LSCM) en andere State-of-the-art microscopie technieken. Als een belangrijke waarschuwing, alleen die T-cel-APC grenzen (genoemd IS interfaces) die op de juiste 90 ° hoek naar het scherpstel vlak langs de Z-as zou kunnen worden goed afgebeeld en geanalyseerd. Andere experimentele modellen bestaan die het vereenvoudigen van beeldvorming in de Z-dimensie en de volgende beeldanalyse, maar deze benaderingen niet emuleren het complexe, onregelmatige oppervlak van een APC, en niet-fysiologische interacties in de IS kunnen bevorderen. De experimentele benadering die hier wordt gebruikt, is dus geschikt om te reproduceren en om een aantal biologische complexiteiten te confronteren die zich op het moment voordoen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het belangrijkste doel van de methode is het genereren van immunologische Synapse (IS) cel-naar-cel conjugaten gevormd door een antigeen-presentatie cel (APC) gepulseerd met Zie superantigenen en een Effector th Cell, en om de beelden te registreren die corresponderen met de eerste stadia van immunologische SYNAPS vorming en de daaropvolgende handel gebeurtenissen (die zich zowel in de APC als in de th-cel voordoen), die uiteindelijk zal leiden tot gepolariseerde secretie aan de IS. De oprichting van de is door T lymfocyten bij binding van hun cel receptor (TCR) aan antigenen gebonden aan mhc-II op de APC organiseert een uiterst dynamische, buigbare en kritische instantie die betrokken zijn bij antigeen-specifieke, humorale en cellulaire immuunresponsen1,2. De IS wordt gedefinieerd door de vorming van een speciale supramoleculaire activerings complex (SMAC) patroon gekenmerkt door een actine reorganisatieproces3. Bij IS de bouw door T-lymfocyten met een APC, de polarisatie van de secretoire blaasjes naar de IS lijkt te worden betrokken bij gepolariseerde secretie op de synaptische kloof. Deze gerichte machine lijkt te leveren het immuunsysteem met een prachtig gereguleerde Stratagem om de werkzaamheid van kritische secretoire Effector rollen van T-lymfocyten te verbeteren, terwijl het verminderen van niet-specifieke, cytokine-arbitrated stimulatie van omstanders cellen, het doden van irrelevante doelcellen en apoptotic zelfmoord via activering-geïnduceerde celdood (AICD)4.

Het gevolg van de IS varieert naargelang de aard van zowel de T-lymfocyten als de APC. De synaptische contact van de cellen (meestal CD4 + cellen) met de APC weergegeven antigeen-geassocieerd met MHC-II produceert de activering van de T-cel (cytokine secretie, proliferatie, enz.) en, in sommige gevallen, apoptosis via AICD4. Voor cytotoxische T-lymfocyten (Ctl's) (hoofdzakelijk CD8 + cellen) die interageren met APC die antigeen in verband met MHC-I presenteert, verschilt de uitkomst van de pre-stimulatie of niet van de Ctl's met antigeen. Dus naïeve Ctl's die antigeen-MHC-I-complexen op de APC identificeren, zijn "gegrond" om doelcellen te vernietigen en te verdelen. Primed ctl's ook het opzetten van synapsen met doelcellen (dat wil zeggen, cellen geïnfecteerd door virussen of tumorcellen) produceren antigeen-specifieke celuitroeiing5,6.

De gepolariseerde secretie van exosomen bij de immunologische SYNAPS is een ontwikkelings-en uitdagend gebied van onderzoek dat betrokken is bij relevante immuunresponsen7. Het is aangetoond dat multivesiculaire lichamen (MVB) die intraluminale blaasjes (ilv's) vervoeren ervaring gepolariseerd transport naar de is8,9 (Video 1) op TCR stimulatie met antigeen. De fusie van deze MVB op het synaptische membraan induceert hun degranulatie en de afgifte van de ilv's als exosomen aan de synaptische spleet8,10. Dit gebeurt in wordt gevormd door het th-type jurkat cellen die werden uitgedaagd met Zie superantigen-gecoate Raji cellen die fungeren als APC11, TCR-gestimuleerd CD4+ lymfoblasten, en klaar ctl's. Dus, synapsen gemaakt door Jurkat cellen vormen een waardevol model om gepolariseerd secretoire verkeer van exosomen te bestuderen. Daarnaast hebben enkele decennia van onderzoek aangetoond dat veel fundamentele inzichten in de TCR-signalering afkomstig zijn van studies met getransformeerde T-cellijnen, en inderdaad is de bekendste van deze modelsystemen de Jurkat leukemische T-Cell lijn12.

De vorming van een volledig ontwikkelde is produceert verschillende cruciale biologische resultaten, met inbegrip van de activering van th cellen, activering van naïeve ctl's of doelcel doden door klaar CTLS, behalve anergy of AICD5. Daarom, er zijn twee belangrijke vormen van secretoire is vastgesteld door T lymfocyten die resulteren in zeer divers, maar ook kritisch, immuun Effector functies1,6,13. Aan de ene kant induceert de is van klaar cytotoxische T-lymfocyten (ctl's) snelle polarisatie (variërend van seconden tot enkele minuten) van lytische korrels (genaamd "secretoire lysosomes") naar de is. De degranulatie van de lytische korrels induceert de secretie Perforine en granzymes aan de synaptische gespleten14, die Pro-apoptotische moleculen zijn. De uitgescheiden Perforine en granzymes induceren vervolgens het doden van de doelcellen15,16. Ctl's ontwikkelen tijdelijke synapsen, die slechts enkele minuten duren, omdat de doelcellen3,17worden vermoord. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de omstandigheid dat de optimale CTL taak vereist een snel en tijdelijk contact om zo veel dodelijke stakingen mogelijk te verdelen over tal van doelcellen3,17. In tegenstelling, de th lymfocyten zoals jurkat cellen genereren stabiele, lang staand is (van 10-30 minuten tot uren), omdat dit noodzakelijk lijkt te zijn voor zowel directionele en onophoudelijke secretie van stimulerende cytokines3,17. De cytokinen zijn ook ingesloten in secretoire blaasjes en sommige van hen (dat wil zeggen, IL-2, IFN-γ) ervaring gepolariseerd transport naar de IS17 en secretie. Een essentieel kenmerk van het is is de vorming van verkennende, zwakke en voorbijgaande contacten tussen de T-cel en de APC (Video 1) die een sterkere interactie kunnen opleveren en de vorming van een volwassen is, mits de TCR de verwant antigeen-MHC-complexen identificeert en dat passende co-stimulatoire verbindingen worden vastgesteld5. Zowel het begin van de eerste contacten en de oprichting van een volwassen, volledig productief is, zijn inherent Stochastic, snelle en asynchrone processen5,18. Bovendien is er een schaarse frequentie in het creëren van cel-naar-cel conjugaten19, wat een uitdaging kan vormen voor beeldvormingstechnieken (Zie de resultaten en discussie secties).

Een andere belangrijke uitdaging bij het onderzoeken van polarisatie van het microtubulus-organiserend centrum (MTOC) en secretoire korrels in T-lymfocyten is dat het hele proces snel is (seconden tot enkele minuten), met name in Ctl's. gezien deze feiten, zijn de meeste vroege benaderingen geconfronteerd met een eindpunt strategie waarbij APC/doelcellen en T-lymfocyten gezamenlijk worden gemengd en geconvergeerd door centrifugeren met lage snelheid, om de creatie van cel-naar-cel-conjugaat te voorkomen, gedurende enkele minuten geïnineerd, en vervolgens geëvalueerd voor de verplaatsing van MTOC en/of secretoire blaasjes naar de IS20. Deze aanpak heeft twee belangrijke beperkingen: er zijn geen levendige gegevens over de mensenhandel bereikt en er zijn hoge niveaus van MTOC/secretoire granules van de achtergrond gepolarisatie verkregen, waarschijnlijk als gevolg van het stochastische karakter van IS vestiging18. Bovendien is elke correlatie tussen TCR-gestimuleerd, initiële signalering van gebeurtenissen (d.w.z. intracellulaire calcium stijgingen, actine reorganisatie) en secretoire blaasje polarisatie problematisch om te onderzoeken. Zo zijn dwingende bepalingen voor een adequate beeldvorming van het IS in levende cellen combineren om de cel-naar-cel geconjugeerde materialisatie te verbeteren, om de generatie van de IS te synchroniseren en, indien mogelijk, om de oprichting van cellulaire conjugaten op gedefinieerde Microscoop XY-velden en Z-posities te garanderen. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om al deze problemen te voorkomen. Het is buiten de reikwijdte van dit document om deze methoden, hun voordelen en zwakke punten uit te leggen. Raadpleeg de eerder gepubliceerde beoordelingen met betrekking tot deze belangrijke punten1,4,5,21.

Het feit dat IS gemaakt door de lymfocyten zijn lang geleefd, en de omstandigheid dat in de lymfocyten de MTOC, lymfokine-bevattende secretoire korrels en MVB nemen van enkele minuten tot uren te verplaatsen en te docken op de IS22 maakt de th-APC is een ideale kandidaat voorbeeld vorming met behulp van het protocol beschreven hier.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding van Dia's te hechten Raji cellen

  1. Voeg 150 μL fibronectine (100 μg/mL) per put toe aan een 8 micro well kamer glijbaan (plastic-onderste kamer glijbaan) en inincubatie gedurende 30 minuten tot 1 uur bij 37 °C. Deze hechting substraat zal toelaten de binding van Raji cellen aan de put bodem (stap 2), de vorming van levende conjugaten met Jurkat cellen (stap 4) cellen, en time-lapse microscopie Capture (stap 6), en is ook compatibel achteraf met optionele Paraformaldehyde (PFA) fixatie (stap 7).
    Opmerking: Gebruik voor aceton fixatie glazen onderste kamer dia's en poly-L-lysine (20 μg/mL) in plaats van fibronectin, omdat aceton plastic oplost. De 8 micro well kamer glijbaan (1 cm2 well, 300 μL maximum volume) of gelijkwaardig is een flexibel en geschikt formaat.
  2. Aspirate fibronectin met behulp van een 200 μL automatische pipet en was elk goed met 200 μL PBS gedurende 2 minuten met zacht schudden. Herhaal deze wasbeurt nog een keer. De kamer glijbaan kan in dit stadium met PBS worden opgeslagen voor 1-2 weken bij 4 °C.

2. hechting van Raji-cellen aan de kamer glaasjes en 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC)-labeling

  1. Breng 10 mL van een confluente (1-2 x 106 cellen/ml) pre-cultuur van Raji cellen naar een 15 ml, V-bottom Tube. Meng goed en gebruik 10 μL om de cellen op de kamer van Neubauer of gelijkwaardig te tellen.
  2. Centrifugeer de resterende cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren en gooi het supernatant.
  3. Breng de celpellet voorzichtig door in een warm, compleet kweekmedium (RPMI 1640 aangevuld met 10% FCS, 2 mM glutamine, 10 mM HEPES, 100 U/mL penicilinine en 100 μg/mL streptomycine) bij een concentratie van 106 cellen/ml. Gebruik de onderstaande vergelijking:
    ([]initiële x vinitiële = []finale x vFinal), waarbij []initiële cel concentratie, vinitiële = initiële volume van de celsuspensie, []Final = uiteindelijke celconcentratie, VFinal = eindvolume van de celsuspensie.
    Opmerking: Afhankelijk van de celconcentratie van de start cultuur is het mogelijk om meer cellen te verzamelen dan nodig is, maar het is belangrijk om de overgebleven cellen in cultuur (37 °C) te behouden tot het einde van het experiment om mogelijke problemen te voorkomen (zie stap 2,6).
  4. Label Raji-cellen om hun identificatie mogelijk te maken tijdens de synaptische geconjugeerde formatie. In dit experiment wordt 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) labeling uitgevoerd in stap 2.4.2.
    1. Breng het vereiste aantal Raji-cellen in het kweekmedium over in een buis van 2 mL. Voor de 8 micro well kamer glijbaan is een totaal van 1,6 mL celsuspensie nodig (200 μL per put).
    2. Voeg CMAC toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 μM. Houd de cellen in het donker door de buis met aluminiumfolie te bedekken, omdat CMAC lichtgevoelig is. 200 μL met 2 x 105 Raji-cellen is nodig per 1 cm2 goed. Dus, als 8 putten moeten worden voorbereid, zijn 1,6 x 106 Raji-cellen vereist.
      Opmerking: Het labelen van Raji-cellen met Cell tracker Blue (CMAC, UV-excitatie en blauwe emissie) onderscheidt ze van de cellen wanneer de synaptische conjugaten worden gevormd. Deze kleurstof is compatibel met PFA en aceton fixeermiddelen en maakt verdere immunofluorescentie procedures mogelijk. Probeer te voorkomen dat licht expositie. Het labelen van Raji-cellen in een pool met CMAC gevolgd door resuspensie vóór de hechting van de Raji-cellen aan de fibronectin-gecoate kamer dia's zorgt voor de homogene labeling van Raji-cellen met CMAC tussen verschillende putjes.
  5. Resuspend CMAC-gekleurd cellen en, na aspiratie van de PBS in de kamer Slide uit stap 1,2., Breng 200 μL van de celsuspensie over naar elk goed van de in stap 1.1-1.2 bereide kamer glaasjes met fibronectine-coating. Inincubatie van de kamer glijbaan bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 min-1 uur.
    Opmerking: De hechting en CMAC labeling zal gelijktijdig optreden bij deze stap en dit bespaart tijd. Houd er rekening mee dat de Raji-cellen snel zullen sediment en voorzichtigheid moet worden betracht om een homogene concentratie in de celsuspensie vóór het zaaien te handhaven. Het is niet nodig om CMAC te wassen in dit stadium door centrifugeren, omdat CMAC wassen gemakkelijker zal worden gedaan bij stap 2,7 (wanneer de gelabelde Raji-cellen al zijn gehecht aan de kamer glaasjes). Aangezien CMAC aanwezig is in de celsuspensie in grote overmaat, is de blauwe fluorescentie achtergrond te hoog om de blauw gekleurde cellen te onderscheiden. Controleer Cell CMAC fluorescentie in stap 2,7 na het wassen van CMAC.
  6. Zorg ervoor dat de Raji-cellen aan de bodem van de putjes worden vastgehouden door zachtjes schudden van de kamer glaasjes op de Microscoop. Zorg ervoor dat de cellen openingen tussen elkaar weergeven en niet Confluent Health zijn (Figuur 1, middelste paneel). 50-60% van de samenvloeiing van cellen is geschikt.
    1. Als het merendeel van de cellen zich efficiënt aan de Schuif van de kamer houdt en er geen celgaten worden waargenomen, moet u elk goed met een warm volledig medium wassen en het medium hervatten met een automatische Pipet van 200 μL om de celovermaat los te maken. Controleer samenvloeiing na elke stap resuspensie.
    2. Als de cellen zich niet hechten, herhaalt u de adhesie stap opnieuw en verhoogt u de wrijvings tijd en/of het celnummer.
      Opmerking: Het is mogelijk om hier te stoppen, incuberen de kamer glijbaan bij 37 ° c, 5% CO2 's nachts (O/N), en ga verder met het protocol de volgende dag. Bevestig de volgende dag dat de Raji-cellen blijven worden vastgehouden en CMAC-gelabeld met behulp van fluorescentiemicroscopie.
  7. Was elk goed weer voorzichtig met een warm aangevuld RPMI om overtollige CMAC te elimineren en te controleren op blauwe emissie met de fluorescentiemicroscoop (Figuur 1).
    Opmerking: Om het gebruik van Dompel olie (kleverige en viskeuze) en hoge numerieke diafragma olie doelstellingen te vermijden, kunnen extra lange afstanden (d.w.z. 20x of 40x) worden gebruikt om snel CMAC-labeling te controleren met behulp van de fluorescentiemicroscoop.

3. puls van CMAC — gelabelde Raji-cellen met stafylokokken enterotoxine E

  1. Voeg stafylokokken enterotoxine E (zie 1 μg/mL) toe aan elk goed. Zie kan gemakkelijk worden verdund in celkweekmedium (werkoplossing op 100 μg/mL) van de Zie bevroren voorraden (1 mg/mL in PBS). Gebruik 2 μL van de 100x werkoplossing per 200 μL micro well.
    Let op: Gebruik handschoenen voor deze stap en gooi de gebruikte Tip weg in de Biohazard box.
  2. Inincubatie van de kamer glijbaan bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ten minste 30 min. Het effect SEE duurt minimaal 3-4 uur.
    Opmerking: Zie kan worden toegevoegd aan de putten op verschillende tijdstippen indien nodig, als er duidelijke time-lapse opstellingen zijn gepland (stap 5) en/of afhankelijk van de starttijd punt voor het einde punt experimenten (stap 6).

4. voorbereiding van Jurkat cellen

  1. Gebruik een eerder groeiende cultuur van Jurkat cellen (1-2 x 106 cellen/ml) voor dit experiment. Gebruik cellen uit een standaard kweek kolf of uit een eerdere trans fectie na standaard elektroporation protocollen, zoals eerder beschreven23. De transfectie van Jurkat cellen zal timelapse visualisatie van het verkeer van secretoire granulaat in levende cellen. Wanneer bijvoorbeeld GFP-CD63 (een marker van MVB) wordt uitgedrukt, kan de beweging van GFP-CD63-versierde blaasjes worden opgenomen (Video 1).
  2. Observeer de cellen onder een fasecontrastmicroscoop. Als een overmaat aan dode cellen (> 20-30%) worden waargenomen, voer Ficoll-dichtheidsgradiënt centrifugeren uit met behulp van standaardprotocollen24, om het teveel aan dode cellen te elimineren (dode cellen vertonen een hogere dichtheid dan levende cellen) voorafgaand aan gebruik (zie discussie).
  3. Breng de cellen over in een buis van 15 mL, V-onderbuis en gebruik 10 μL voor het tellen met behulp van hemocytometer.
  4. Centrifugeer de resterende cellen zoals beschreven in stap 2,2. Gooi het supernatant weg en regeer de cellen in dezelfde concentratie als Raji-cellen (1 x 106/ml) met behulp van een vers, warm kweekmedium. Volg de stappen 2.2-2.3.
  5. Onderhouden van de Jurkat cellen in cultuur (37 °C, 5% CO2) tijdens het wachten op de stap 4.
    Opmerking: Bij de tweede optie (transfectie) zal het aantal levende cellen veel lager zijn dan in de eerste. Overweeg dus om een hoger begincelcultuurvolume te gebruiken om voldoende cellen voor het experiment te hebben. Van 10 x 106 jurkat cellen per electroporatie kuvette en transfectie, alleen 2-4 x 106 jurkat cellen zal overleven na 48 h van transfectie en sommige van deze cellen zullen verloren gaan tijdens de Ficoll stap. Zo is één elektroporation kuvette over het algemeen voldoende om de vastgehouden, op de huid gepulseerde Raji-cellen uit te dagen van 8 micro putten (1,6 x 106 getransventeerde jurkat-cellen nodig).

5. co-seeding van Raji en Jurkat cellen

  1. Neem de kamer glaasjes met de CMAC-gelabelde, zie-gepulseerde, vastgehouden Raji-cellen uit de incubator uit stap 3,2. Het is niet nodig om de CMAC in dit stadium te wassen, omdat dit eerder in stap 2,7 werd gedaan.
  2. Aspirate het kweekmedium van elke put, één voor één, van de ene hoek van de put zorgvuldig met een automatische Pipet van 200 μL. Laat het medium in de put niet volledig uitdrogen.
  3. Vervang het medium onmiddellijk door 200 μL geresuspendeerde Jurkat cellen in celkweekmedium (1 x 106/ml) bereid in stap 4,5. Als timelapse-beeldvorming wordt uitgevoerd, gaat u onmiddellijk na deze stap naar stap 6, omdat de cellen van Jurkat de neiging hebben te bezinksel en synaptische conjugaten zeer snel vormen. Voor het gemak moeten de micro putten die zien-gepulseerde, vastgehouden Raji-cellen die in dit stadium geen zaaien met jurkat-cellen ontvangen, met celcultuurmedium worden gehandhaafd tot de volgende uitdaging met jurkat-cellen. Dit zal de volgende uitdaging flexibel maken met Jurkat-cellen voor extra time-lapse of omgekeerde kinetische, eindpunt experimentele benaderingen.
  4. Als een time-lapse wordt uitgevoerd, gaat u snel door naar stap 6. Dit betreft de co-cultuur voor 1-2 h op de Microscoop-incubator of gelijkwaardig bij 37 °C, 5% CO2 om de synaptische conjugaat vorming en gelijktijdige beeld verwerving mogelijk te maken. Indien eindpunt analyse, maar geen timelapse, is voorzien check conjugaat vorming na de co-cultuur periode met behulp van de Microscoop (zoals in Figuur 1) vóór de vaststelling van de cellen (stap 7).

6. timelapse-beeldvorming van opkomende synaptische conjugaten

  1. Bereid de Microscoop en incubatie kamer vóór de beeldvorming. Voor het voorbeeld in video 1 worden de gedetailleerde microscopie instellingen weergegeven in afbeelding 2.
    Opmerking: Als een time-lapse-experiment is gepland, moeten alle Microscoop-instellingen en aanvullingen (Ambient Cell Culture Chamber, enz.) worden voorbereid voordat de schorsing van de Jurkat aan de kamer glijbaan met vastgehouden Raji-cellen wordt toegevoegd. De volgende stappen worden beschreven voor een commerciële Microscoop (tabel met materialen). Echter, elke omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een celkweek incubator kan worden gebruikt.
    1. Gebruik een microscoop met een 60 x olie-onderdompeling, hoge numerieke diafragma bij het beeldvormende gepolariseerd verkeer.
    2. Zorg ervoor dat het automatische scherpstel systeem is ingeschakeld en pas de offset aan om de Raji-cellen die aan het bodemoppervlak zijn gebonden, scherp te stellen. Zie afbeelding 1, Video 1 en video 2.
  2. Nadat jurkat naast elke put met de vastgehouden Raji-cellen in stap 5,3, snel de titer kamer glijbaan op de voorverwarmde (1-2 h) Microscoop-incubator (d.w.z. okolab) en selecteer een aantal XY-posities met de Microscoop, velden waarin het waarschijnlijk opnemen van een opkomende IS de vorming van, bijvoorbeeld, een Jurkat-getransfunde cel die in de Microscoop focus valt.
  3. Gebruik een voorverwarmde Microscoop-incubator omdat werd waargenomen dat een temperatuurgestabiliseerde fase stabiele X-, Y-, Z-posities handhaaft. Criteria voor een handig XY-veld zijn: goed gerichte en niet-confluente Raji-cellen (d.w.z. het weergeven van gaten tussen cellen) en de aanwezigheid van gegetransfunteerde Jurkat-cellen (dit kan worden gecontroleerd door doorlatendheid en UV-of GFP-kanalen te combineren). Jurkat cellen zal zeer snel sediment (paar minuten) op de kamer Slide, en de kans op het beeld opkomende synapsen zal afnemen met de tijd (Figuur 1). Het is mogelijk om het experiment af te ronden na de gedefinieerde timelapse of door te gaan naar stap 7 en de conjugaten te fixeren voor daaropvolgende immunofluorescentie en analyses.
    Opmerking: Het is mogelijk om tot 16 verschillende Microscoop velden te selecteren van maximaal 4 verschillende micro Wells voor gelijktijdige, multi-well time-lapse acquisitie met de juiste temporele resolutie (1-2 min per frame). De beperking is afhankelijk van zowel het aantal als de intensiteit (met betrekking tot de camera expositie) van de diverse fluor chromen om te worden afgebeeld (afhankelijk van het aantal uitgedrukt fluorescerende eiwitten, afgezien van CMAC). Een manier om de framesnelheid te verhogen is opnemen voor het CMAC-kanaal in slechts één van elke "n"-tijdframes voor GFP (d.w.z. n = 8, zoals weergegeven in Figuur 2), omdat Raji-cellen worden vastgehouden aan de goed bodem en niet gemakkelijk als jurkat-cellen bewegen. Bovendien profiteert dit de levensvatbaarheid van de cel, omdat frequente blootstelling aan UV-licht de cellen kan beschadigen. Probeer de tijdsframe snelheid aan te passen naar 1 frame elke 1 minuut of minder (d.w.z. 20 s per frame in Video 1, Figuur 2), omdat de polarisatie van MVB een paar minuten tot uren in beslag neemt. Een microscoop met een gemotoriseerde epi-fluorescentie toren en geschikte band-pass fluorescentie filters of equivalenten zijn nodig om deze multichannel Capture uit te voeren.

7. eindpunt vorming van synaptische conjugaten en fixatie

  1. Als er slechts een eindpunt experiment is gepland (1-2 uur incubatie om synaptische conjugaat vorming mogelijk te maken), inincubatie van de kamer glijbaan bij 37 °C, 5% CO2 voor 1-2 h. Controleer de conjugaat vorming na de cultuur periode (zoals in Figuur 1) en bevestig vervolgens de conjugaten met aceton of PFA (fixatie zal afhangen van de antigenen en antilichamen die moeten worden gebruikt bij de daaropvolgende immunofluorescentie). In dit geval is voor de incubatie geen incubator voor Microscoop stadia nodig. Raadpleeg Video 3 voor een voorbeeld.
  2. Om de cellen te fixeren, was de put door voorzichtig schudden met warme RPMI (37 ° c) medium zonder FCS (albumine uit serum kan neerslaan met aceton fixatie). Aspirate en voeg 200 μL PFA of voorgekoeld aceton toe aan elk goed. Inincubatie van de kamer glijbaan bij kamertemperatuur (RT) of op ijs, respectievelijk, gedurende 20 min.
    Opmerking: Voor de aceton fixatie, pre-Chill de aceton bij-20 °C en pre-Chill de kamer glijbaan bij 4 °C. Verwijder plastic deksels wanneer aceton wordt gebruikt om de cellen te fixeren in de 8 goed glazen bodem kamer dia's.
  3. Was elk goed tweemaal met PBS en voeg 200 μL afschrikkings oplossing toe (PBS, 50 mM NH4cl). Inincubatie van de kamer glijbaan bij 4 °C.
    Opmerking: In dit stadium kan de kamer glijbaan gedurende ten minste één maand bij 4 °C blijven voordat het immunofluorescentie protocol wordt uitgevoerd, zoals beschreven8. Het deksel voorkomt verdamping.

8. beeldverwerking

  1. Voer post-Acquisition image deconvolutie uit (d.w.z. Huygens deconvolutie of gelijkwaardig, tafel van materialen) van time-lapse Series en/of stilstaande foto's van vaste cellen. Deconvolute door gebruik te maken van een geschikte software (d.w.z. met behulp van de optische optie "breed veld" in Huygens) en de juiste optische parameters. Deconvolutie vereist voor de beeldverwerking van de gemeten puntspreidingsfunctie (PSF) van de Microscoop4.
  2. U ook de software gebruiken om de geïdealiseerde PSF te berekenen door het automatisch laden van de optische parameters opgenomen onder de metadata van de Microscoop bestanden. Deze optische parameters bestaan uit fluorochrome golflengte, brekingsindex, numerieke diafragma van de doelstelling, en de beeldvormings techniek (confocale, breed-veld, enz.) 4.
  3. Vervolgens maakt de beeldvormings software gebruik van de PSF en diverse deconvolutie-algoritmen (d.w.z. qmle en cmle in Huygens-software) in een stap-voor-stap cumulatief, berekeningsproces, waarvan de resultaten dan continu kunnen worden gevisualiseerd en gestopt (of hervat) wanneer dit door de gebruiker is vereist. In dit stadium kan de gebruiker het aantal convoluties en/of de signaal-ruis verhouding wijzigen en deconvolutie hervatten. De deconvolutie-software werkt goed met timelapse-reeksen (x, Y, T) (video 2) en Z-Stacks (x, Y, z) (Video 3). De gedeconvoluteerde kanalen werden vervolgens samengevoegd met de CMAC, Raw Channel, omdat cytosolische, diffuse fluorochromes niet verbeteren door deconvolutie4,9.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben het beschreven protocol gevolgd om Jurkat-Raji immuun Synapse conjugaten te genereren en om het juiste beeld te krijgen van de vroege stadia van de formatie. Ons doel was om de vroege benaderingen te verbeteren20 eerder volgde om de polarisatie van de mtoc en de secretoire machine te bestuderen naar de is. Deze benaderingen waren gebaseerd op een eindpunt strategie die niet mogelijk Imaging van de IS vorming of de vroege synaptische gebeurtenissen, aangezien in deze strategieën de IS vorming verplicht gebeurde in de pellet van gemengde, gecentrifugeerde cellen, maar niet op een microscoop. Ons protocol is ontworpen om dit hoofd nadeel te voorkomen, aangezien de aanpak was gebaseerd op het gebruik van een geschikte celconcentratie (stappen 2 en 3), om de vorming van de cel-naar-cel te bevoordeling, IS conjugaten op de eigen Microscoop kamer dia's (8 micro well Chamber Slide), gemonteerd op de voorverwarmde Microscoop fase incubator (in stap 4). Deze strategie induceert de IS formatie, gelijktijdig met de time-lapse Imaging Capture (Video 1).

Figuur 1 staat voor synaptische jurkat-Raji-conjugaten die werden verkregen na het Protocol (stap 5,2). De afbeelding vertegenwoordigt het eerste frame van een representatieve, time-lapse-experiment. 2 x 105 Raji cellen en 2 x 105 jurkat cellen werden toegevoegd aan een 1 cm2 goed. Het bovenste paneel toont doorlatendheid kanaal, het middelste paneel bestaat uit CMAC (blauw) kanaal (Raji cellen), en het onderste paneel toont zowel doorlatendheid plus CMAC samengevoegde kanalen. Gele pijlen label sommige synaptische conjugaten, als een verwijzing, terwijl groene pijlen duiden synaptische conjugaten gemaakt door een Jurkat cel en verschillende Raji cellen (complexe conjugaten). Afnemende celconcentraties (105 of minder cellen in de 1 cm2 put) zal de vorming van complexe cellulaire conjugaten omzeilen, maar er zijn misschien niet genoeg celconjugaten voor de daaropvolgende analyse van gepolariseerd verkeer (zie hieronder), die op zijn beurt ook de kansen om te vinden en te beeld opkomende synaptische conjugaten zal afnemen.

Figuur 2 staat voor screenshots die overeenkomen met de beeldvormings parameters die worden gebruikt voor de gelijktijdige opname van de twee verschillende fluorochromes (CMAC en GFP-CD63) door gebruik te maken van geschikte software (d.w.z. Nikon NIS_AR) in een representatief time-lapse experiment dat overeenkomt met Video 1.

Video 1 (immunologische synapsen, RAW) vertegenwoordigt een Jurkat T lymfocyten uitdrukken van GFP-CD63 (een marker van multivesiculaire lichamen-MVB, groene blaasjes) en de vorming van een dubbele SYNAPS tussen 1 jurkat cel en 2 Raji cellen gelabeld met CMAC, in blauw (een van hen ondergaat engulfment). De gelijktijdige verplaatsing van MVB binnen de Jurkat-cel naar Synapse gebieden werd geregistreerd (frame rate vastleggen = 1 frame elke 20 seconden voor GFP-CD63; video reproductiesnelheid = 2 frames per s). De synaptische conjugaten werden verkregen en gefotografeerd volgens het hierboven beschreven Protocol (stap 6,2), waardoor beeldvorming van opkomende synapsen mogelijk werd (Video 1). De gelijktijdige opname van zowel GFP-CD63-als CMAC-fluorescentie kanalen werd uitgevoerd met behulp van een geschikte software (d.w.z. NIS-AR, tabel van materialen). De video vertegenwoordigt de onbewerkte gegevens van een representatieve, time-lapse-experiment. Het automatische scherpstel systeem werd gedefinieerd met een gepaste offset ten opzichte van de Raji-cellen gebonden aan de glazen bodem, om een stabiele focus tijdens het experiment te verzekeren.

Video 2 (immunologische synapsen, na deconvolutie) komt overeen met Video 1, maar de deconvolutie van de GFP-CD63 fluorescentie kanaal beelden werd uitgevoerd door gebruik te maken van een passende deconvolutie software (dat wil zeggen, Huygens), met behulp van de "Wide veld" optische optie en de juiste optische parameters (stap 8). Dit deconvoluted kanaal werd vervolgens samengevoegd met de CMAC, Raw Channel. De verbetering van de signaal-ruis verhouding en de scherpte van het beeld is evident. De deconvolutie werd na de overname uitgevoerd, zoals hierboven beschreven. Voor specifieke details over de deconvolutie software verwijzen wij u naar4.

Video 3 (immunologische SYNAPS, na vaststelling en immunofluorescentie kleuring) vertegenwoordigt een z-stack (z-stapgrootte = 0,8 μm, 5 frames) van een vaste is geconjugeerde na de stap 6 van het Protocol (aceton fixatie). Na fixatie werd immunofluorescentie uitgevoerd volgens standaardprotocollen25 door gebruik te maken van Phalloidine om de F-actin (groen), anti-CD63 te visualiseren om MVB (magenta), anti-γ-tubuline te Visualiseer om mtoc (rood) te visualiseren. CMAC (blauw) Etiquette de Raji-cel. Vervolgens werd het geconjugeerde door epifluorescentie en verschillende kanalen gedeconvoluteerd met behulp van de optische optie "breed veld" en de juiste optische parameters (stap 7). De deconvoluted kanalen werden vervolgens samengevoegd met de CMAC, Raw Channel, zoals aangegeven in de verschillende panelen (CMAC plus doorlatendheid-TRANS, CMAC plus Phallodin, CMAC plus anti-CD63 en CMAC plus anti-γ-tubulin, respectievelijk). Witte pijl labels de Synapse, terwijl de groene pijl de MVB labels en de gele pijl de MTOC labels. De gedetailleerde kwantificering van MVB en MTOC-polarisatie is elders25toegelicht.

De hier gepresenteerde benadering omvat de vorming van cel-naar-celconjugaten en tegelijkertijd de time-lapse-overname door breedveld fluorescentiemicroscopie (WFFM) gevolgd door beeldverwerking (deconvolutie na overname). Deze tactiek verbeterde de signaal-ruis verhouding (SRV) van de beelden, verbeterde de temporele resolutie, en liet de gesynchroniseerde overname van verschillende fluorochromes in opkomende synaptische conjugaten4. Bovendien is het protocol goed afgestemd op de daaropvolgende fixatie methoden voor eindpunten (Paraformaldehyde, aceton of methanol), die verdere immunofluorescentie kleuring en analyses mogelijk maken25 (Video 3). Dit protocol is ook compatibel met laser scanning confocale microscopie en andere State-of-the-art microscopie technieken.

figure-results-1
Figuur 1: representatief dubbel-size microscopie veld van synaptische conjugaten. De afbeelding vertegenwoordigt het eerste frame van een representatieve, time-lapse-experiment na het protocol. Het bovenste paneel toont het doorlatendheid kanaal, het middelste paneel CMAC kanaal (Raji cellen) en het onderste paneel beide samengevoegde kanalen. Gele pijlen label sommige synaptische conjugaten, als referentie. Groene pijlen geven complexe synaptische conjugaten aan (d.w.z. één Jurkat-cel die synapsen met meer dan één Raji-cel tot stand brengen). Vastgelegd met een doelstelling van 40x EWD (0,6 NA). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: timelapse-Microscoop-instellingen. De afbeelding komt overeen met verschillende schermafbeeldingen die overeenkomen met de beeldvormings parameters die worden gebruikt voor de gelijktijdige opname van de twee verschillende fluorochromes (CMAC en GFP-CD63) met behulp van geschikte software (d.w.z. NIKON NIS_AR) in een representatief time-lapse-experiment dat overeenkomt met Video 1. Elk frame voor GFP-CD63 kanaal werd elke 20 s gevangen genomen. Slechts één frame voor een UV-kanaal uit acht frames voor GFP-kanaal werd gevangen om de levensvatbaarheid van de cellen langs het experiment te behouden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Video 1: immunologische synapsen gemaakt door een Jurkat-cel die GFP-CD63, RAW-gegevens uitdrukt. Raji B cellen gelabeld met cel tracker blauw (CMAC, blauw) werden gepulseerd met Zie voor 30 min en synapsen met Jurkat cellen uitdrukken GFP-CD638 werden gevormd. Tijd-lapses overeenkomend met GFP-CD63 en CMAC kanalen werden gevangen (20 s per frame; video reproductiesnelheid = 2 frames per s) en een representatief voorbeeld wordt weergegeven. Vastgelegd met een 60x PLAN APO (1,4 NA) doelstelling. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

figure-results-4
Video 2: immunologische synapsen gemaakt door een Jurkat-cel die GFP-CD63 uitdrukt, na deconvolutie. Zelfde als Video 1, maar beelden werden gedeconvoluteerd met behulp van een deconvolutie software. De verbeterde signaal-ruis verhouding en de verbeterde scherpte, als gevolg van de eliminatie van verontreinigingen uit de focus fluorescentie, is evident. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

figure-results-5
Video 3: vaste en immuunbevlekte immunologische synaps. De afbeelding toont een representatieve vaste synaptische conjugaat na stap 7 van het protocol en daaropvolgende immunofluorescentie. CMAC (blauw) labels Raji cellen, doorlatendheid (TRANS) om de synaptische geconjugeerde (witte pijl), Phalloidin labels F-actin (groen), anti-CD63 labels MVB (magenta, groene pijl) en anti-γ-tubuline etiketten MTOC (rood, gele pijl), respectievelijk. Deze kanalen werden afgebeeld door epifluorescentie, deconvoluted en samengevoegd zoals aangegeven. De video bevat een Z-stack (z-stapgrootte = 0,8 μm, 5 frames). Witte pijl labels het synaptische contactgebied, terwijl de groene pijl de MVB labels en de gele pijl labels de MTOC. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een beperking van dit protocol is dat niet alle synapsen zijn ideaal georiënteerd loodrecht op de optische as. Met deze techniek is er geen manier om de ideale oriëntatie voor immuun Synapse Imaging te voorspellen en/of beïnvloeden. Om dit probleem op te lossen, we uitsluiten van de daaropvolgende analyses alle willekeurig vastgelegde synapsen die uiteindelijk niet voldoen aan de ideale criteria. Deze synapsen, had genoeg, zijn niet erg frequent. Het is echter mogelijk om deze beperking te omzeilen met behulp van verschillende experimentele benaderingen4.

De gepolariseerde CD63-release (degranulatie) kan worden gekwantificeerd door andere complementaire technieken zoals celoppervlak kleuring van CD63 (CD63 verplaatsing naar het celoppervlak) in levende cellen (niet vast en niet permeabilized), na stap 6, en daaropvolgende wassen en fixatie, zoals eerder8getoond. Daarnaast kan CD63 afgifte op exosomen8,9 en exosome kwantificering door nanodeeltjes tracerings analyses9,25 worden uitgevoerd. Deze benaderingen zijn zeker compatibel met ons protocol, mits fixatie wordt uitgevoerd na het celoppervlak immunofluorescentie van levende cellen.

We hebben het ideale aantal cellen gevonden (voor een 1 cm2 goed in de 8-well kamer glijbaan) is 4 x 105 cellen (2 x 105 Raji cellen en 2 x 105 jurkat cellen) omdat ze efficiënt aan de onderkant van de put hechten. Bindende efficiëntie aan kunststof (met behulp van fibronectin), of glazen bodem (met behulp van poly-L-lysine) micro dia's is meestal niet een probleem. Hogere celaantallen kunnen geen gaten tussen de vastgehouden cellen en, vervolgens, complexe synaptische conjugaten (Figuur 1) opleveren; beide situaties zijn niet wenselijk wanneer eencellige conjugaten moeten worden afgebeeld, bijvoorbeeld mtoc of secretoire submodule-polarisatie experimenten. Een lager aantal cellen kan de kans op het vinden van conjugaten verminderen, vooral wanneer Jurkat-cellen worden uitgedaagd met APC om synapsen te genereren. Houd er rekening mee dat we hebben geconstateerd dat een met temperatuur gestabiliseerde fase incubator op de Microscoop X/Y-fase vóór het begin van het Protocol (d.w.z. 1-2 h van tevoren om de fase/Microscoop-installatie te stabiliseren) stabiele x-, y-, Z-parameters handhaaft, wat cruciaal is voor een goede beeldvorming. Het automatische scherpstel systeem zal uiteindelijk kleine Z-variaties compenseren.

Wanneer bepaalde gentransductie technieken zoals electroporatie worden gebruikt om fluorescerende chimerische eiwitten (d.w.z. GFP-CD63) in de jurkat-klonen (Video 1) te uiten, kan een aanzienlijke Fractie van cellen na elektroporation sterven. Dit kan een probleem zijn, omdat hoewel dode cellen geen synapsen vormen, wanneer ze in overmaat boven de levende, getransfungeerde cellen, ze kunnen interfereren met de vorming van conjugaten gemaakt door levende th cellen. We hebben geconstateerd dat een zorgvuldige eliminatie van dode cellen uit verdichte culturen door het gebruik van een dichtheidsgradiënt medium na de standaardprotocollen vóór de conjugaat formatie stap inderdaad de kans op goed beeld conjugaten kan vergroten. Bovendien hebben lage transfectie-efficiëntie (< 20%) kan een belangrijk voorbehoud omdat dit, in combinatie met een gematigde conjugaat vorming efficiëntie (rond 60%)25, zal de kans op het vinden van conjugaten gemaakt door getransfungeerde cellen verminderen. Dit is geen probleem wanneer niet-getransfungeerde cellen worden gebruikt om conjugaten te verkrijgen in eindpunt experimenten en daaropvolgende fixatie. De 8 micro well kamer glaasjes zijn compatibel met conventionele immunofluorescentie protocollen. Dit verhoogt de flexibiliteit van het bovenstaande protocol met verschillende doeleinden. Fixatie met aceton kan een probleem zijn om te overwegen bij het gebruik van kamer glaasjes met plastic bodemputten. Er zijn echter in de handel verkrijgbare 8 titer Microscoop kamer dia's met glazen bodems, die compatibel zijn met aceton fixatie. Verwijder plastic deksels wanneer aceton wordt gebruikt om de cellen te fixeren in 8 micro well glazen bodem kamer dia's.

Het wordt aanbevolen dat de Microscoop is uitgerust met een gemotoriseerde XY-fase, een gemotoriseerde epi-fluorescentie-revolver en een automatisch scherpstel systeem (bijvoorbeeld een perfect scherpstel systeem) of gelijkwaardige supplementen. Wanneer multi-well Acquisition vereist is25, het automatische focus systeem zorgt voor een stabiele focus alle langs het experiment. Eerdere ervaring geeft aan dat door het vaststellen van een passende focus offset op de Raji-cellen, zowel de verplaatsing van T-cellen (Video 1) als de Microscoop-fase/kamer Slide bewegingen in XY multi-point experimenten, kunnen worden gecompenseerd. Dit is inderdaad handig voor multi well time-lapse Capture.

Een zwart-wit, panchromatische en gekoelde opgeladen gekoppelde apparaat (CDD) camera werd gebruikt, maar een hogere gevoeligheid, fluorescentie Scientific complementaire metaaloxide Semiconductor (sCMOS) camera is wenselijk, omdat dit de belichtingstijden van de camera zal verminderen en zal de temporele resolutie te verbeteren. De korte belichtingstijden van de camera die we hebben gebruikt (rangschikking 100 MS tot 500 MS) in combinatie met de automatische fluorescentie sluiter maakt langdurige timelapse-opname (tot 24 uur) mogelijk met een adequate tijdresolutie (1 frame per minuut of minder, voor maximaal 16 XY-posities) zonder significante fluorescentie bleken en/of verlies in de levensvatbaarheid van de cel. Het gemotoriseerde podium maakt multi-point (XY) Capture mogelijk en vergroot de kans om de opkomende en ontwikkelende synapsen in de ideale oriëntatie te vinden en te maken, maar maakt het ook mogelijk om beeld verwerving in multi well kamer glaasjes te maken wanneer verschillende Jurkat-klonen gelijktijdig moeten worden geconjugeerd25. Hoog numeriek diafragma van het doel (d.w.z. 60x, 1,4) is nodig om de beste resultaten te verkrijgen bij het analyseren van het verkeer van secretoire korrels.

De RAJI-SEE-Jurkat vormt een gevestigde immunologische Synapse model dat is gebruikt door een groot aantal onderzoekers sinds het oorspronkelijk werd beschreven11. We hebben ons protocol aangepast aan dit model om de vroege stadia van de formatie goed te kunnen afbeelen. Ons doel was om de vroege benaderingen te verbeteren20 eerder volgde om de polarisatie van de mtoc en de secretoire machine te bestuderen naar de is. Het is opmerkelijk dat de conjugaten die met dit protocol zijn gemaakt de F-actin reorganisatie in de synaps produceren, een canonieke SMAC configureren, gelijktijdig met het MVB gepolariseerd verkeer25. Deze cruciale gebeurtenissen zijn ook geanalyseerd en gevalideerd door confocale microscopie25.

Kinetische verschillen in gepolariseerd verkeer bestaan onder verschillende soorten IS. Zo vindt het gepolariseerde transport van lytische korrels van Ctl's plaats in seconden of zeer enkele minuten, terwijl verschillende cytokine-bevattende blaasjes van de lymfocyten van enkele minuten tot enkele uren duren. Deze tijdelijke verschillen moeten van tevoren in aanmerking worden genomen om de beste strategie te ontwerpen en de meest geschikte experimentele en beeldvormings benadering te kiezen, aangezien voor sommige beeldvormings slimmigheidjes (d.w.z. laser scanning confocale microscopie (lscm)) de tijd een beperkende factor kan zijn, omdat de opnametijd veel hoger is dan de juiste tijdsresolutie (1 min of minder)4. Dit is geen beperking wanneer breedveld fluorescentiemicroscopie (WFFM) wordt gebruikt zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Aangezien in ctl's, de polarisatie van mtoc naar de synaps duurt slechts een paar minuten3,6,17, diverse specifieke State-of-the-art microscopie benaderingen verschillend van die hier beschreven (maar harkotteren hogere ruimtelijke en temporele resolutie) zijn nodig om deze synapsen goed beeld26,27, vooral wanneer verschillende Microscoop velden (multi-point Capture) worden afgebeeld. Deze hoge resolutie, nieuwe benaderingen kunnen ook worden gebruikt voor het beeldvorming van de synapsen gemaakt door th lymfocyten, hoewel economische en/of logistieke redenen (dat wil zeggen, de kern apparatuur die nodig is voor sommige van deze Imaging technieken kost 6-7 keer meer dan de hier beschreven) zou zeker een beperking voor deze state of the art Imaging methoden4. Het feit dat IS gemaakt door de lymfocyten zijn lange levensduur, en de omstandigheid dat in de lymfocyten de MTOC, de lymfokine-bevattende secretoire blaasjes en MVB nemen van enkele minuten tot uren te vervoeren en dok aan de IS22, maakt dit protocol een ideale, betaalbare benadering voorbeeld vorming de th-APC is.

WFFM in combinatie met post-acquisitie afbeelding deconvolutie vormt een interessante aanpak en niet alleen economische redenen ondersteunen deze strategie. De intrinsieke slechte resolutie in de Z-as (het belangrijkste voorbehoud van de techniek) kan worden verbeterd met behulp van post-acquisitie afbeelding deconvolutie4 (Vergelijk Video 1 met video 2). Deconvolution maakt gebruik van een op berekeningen gebaseerde, beeldverwerkings benadering die de signaal-ruis verhouding en de beeldresolutie en contrast27 tot 2 keer kan verbeteren, tot 150-100 nm in XY-as en 500 nm in de Z-as4.

Het gebruik van een hogere gevoeligheid, hoge uitlezen snelheid en breed dynamisch bereik, nieuwe fluorescentie sCMOS-camera's zullen de kwaliteit van de beelden verbeteren en fluorescentie bleaching verminderen. De flexibiliteit van het hier beschreven cel-naar-celconjugatie protocol maakt de combinatie van de beschreven cellulaire aanpak mogelijk met verschillende State-of-the-art microscopie technieken, zowel in levende cellen als in vaste cellen, en de verwachte uitkomst zal inderdaad onze kennis van de immunologische SYNAPS verbeteren.

Hoewel we het protocol hebben geïmplementeerd en gevalideerd door gebruik te maken van gemakkelijk te hanteren, goed gevestigde cellijnen, kan het potentieel van de aanpak visualisatie van meer fysiologische interacties mogelijk maken wanneer primaire T-cellen en verschillende soorten antigeen-presentatie cellen (zoals dendritische cellen van macrofagen) worden gebruikt5. In deze context is dit protocol ook uitgebreid en gevalideerd met behulp van Super antigeen (SEB)-gepulseerde muis EL-4 cellijn gebruikt als APC, om primaire muis T lymfoblasten9uit te dagen. Inderdaad primaire T-lymfocyten, Ctl's in het bijzonder, gerenderd meer kortstondige en dynamische synaptische contacten (Zie aanvullende video 8 in verwijzing9) naar die gezien met de see-Raji en jurkat model. De variabiliteit van synaptische contact modi kan het best worden gezien voor primaire T-cel interacties met dendritische cellen of B-cellen in tweedimensionale in vitro weefsel equivalenten die ook kunnen worden opgenomen en geanalyseerd met behulp van dit protocol. Bovendien, afgezien van Super antigenen, de techniek kan worden gebruikt om andere soorten synapsen beeld. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt in een TCR transgene, antigeen-specifiek T-celmodel, bijvoorbeeld met behulp van het ovalbumine-specifieke Murine OT1/OT2-systeem of door transfectie van T-cellen met antigeen-specifieke T-celreceptoren. Dit opent een groot aantal experimentele mogelijkheden voor de nabije toekomst.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen alle vroegere en huidige leden van het lab voor hun genereuze bijdrage. Dit werk werd gesteund door subsidies van het Spaanse Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), Plan Nacional de Rechercientífica (SAF2016-77561-R tot M.I., die deels werd verleend met FEDER-EG-financiering). We erkennen Facultad de Medicina (UAM) en Departamento de Audiovisuales van de Facultad de Medicina voor hun ondersteuning en de faciliteiten die worden geleverd om de video te produceren. Wij erkennen NIKON-Europe voor de voortdurende en uitmuntende technische en theoretische ondersteuning. Gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Nikon.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Camera Nikon DS-QI1MCNikonMQA11550Gekoelde Camera Head
CMACThermoFisher ScientificC2110Cell tracker blauw
JURKAT cellenATCCATCC TIB-152Effector T-lymfocyten
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glas-BottomIBIDICat.No: 80826, 80827Celcultuur en celbeeldvorming ondersteuning
Microscope NIKON Eclipse Ti-ENikonNIKON Eclipse Ti-EBreedveldfluorescentie, volledig gemotoriseerde microscoop uitgerust met Perfect Focus System (PFS) optie
Microscoop Stage Incubator met 3-kanaals handmatige gasmixer en gasbubbel/vochtigheidsmoduleOKOLABH201-NIKON-TI-S-ERCelcultuur atmosfeer
Raji CellenATCCATCC CCL-86APC
RPMI medium GIBCOThermoFisher Scientific21875034Kweekmedium
Streptococcus Enterotoxin E (SEE)Toxin Technology, IncEP404Bacterieel Toxine
Software Huygens EssentialSVIHuygens EssentialBeeld Deconvolutie software
Software ImageJNIHImage JBeeldsoftware
Software Nikon NIS-ARNikonNIS-Elements ARBeeldvastlegging en analyse software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fooksman, D. R., et al. Functional anatomy of T cell activation and synapse formation. Annual Review of Immunology. 28, 79-105 (2010).
  2. de la Roche, M., Asano, Y., Griffiths, G. M. Origins of the cytolytic synapse. Nature Reviews. Immunology. 16, 421-432 (2016).
  3. Griffiths, G. M., Tsun, A., Stinchcombe, J. C. The immunological synapse: a focal point for endocytosis and exocytosis. The Journal of Cell Biology. 189, 399-406 (2010).
  4. Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging Polarized Secretory Traffic at the Immune Synapse in Living T Lymphocytes. Frontiers in Immunology. 9, 684(2018).
  5. Friedl, P., den Boer, A. T., Gunzer, M. Tuning immune responses: diversity and adaptation of the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 5, 532-545 (2005).
  6. Xie, J., Tato, C. M., Davis, M. M. How the immune system talks to itself: the varied role of synapses. Immunological Reviews. 251, 65-79 (2013).
  7. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  8. Alonso, R., et al. Diacylglycerol kinase alpha regulates the formation and polarisation of mature multivesicular bodies involved in the secretion of Fas ligand-containing exosomes in T lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 18, 1161-1173 (2011).
  9. Mazzeo, C., Calvo, V., Alonso, R., Merida, I., Izquierdo, M. Protein kinase D1/2 is involved in the maturation of multivesicular bodies and secretion of exosomes in T and B lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 23, 99-109 (2016).
  10. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282(2011).
  11. Montoya, M. C., et al. Role of ICAM-3 in the initial interaction of T lymphocytes and APCs. Nature Immunology. 3, 159-168 (2002).
  12. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews. Immunology. 4, 301-308 (2004).
  13. Huse, M., Quann, E. J., Davis, M. M. Shouts, whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nature Immunology. 9, 1105-1111 (2008).
  14. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. The Journal of Experimental Medicine. 173, 1099-1109 (1991).
  15. Vignaux, F., et al. TCR/CD3 coupling to Fas-based cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 181, 781-786 (1995).
  16. de Saint Basile, G., Menasche, G., Fischer, A. Molecular mechanisms of biogenesis and exocytosis of cytotoxic granules. Nature Reviews. Immunology. 10, 568-579 (2010).
  17. Huse, M. Microtubule-organizing center polarity and the immunological synapse: protein kinase C and beyond. Frontiers in Immunology. 3, 235(2012).
  18. Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. The Journal of Cell Biology. 202, 779-792 (2013).
  19. Jang, J. H., et al. Imaging of Cell-Cell Communication in a Vertical Orientation Reveals High-Resolution Structure of Immunological Synapse and Novel PD-1 Dynamics. Journal of Immunology. 195, 1320-1330 (2015).
  20. Kupfer, A., Singer, S. J. Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions: immunofluorescence microscopic studies of single cells and cell couples. Annual Review of Immunology. 7, 309-337 (1989).
  21. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature Reviews. Immunology. 11, 672-684 (2011).
  22. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. Journal of Structural Biology. 168, 152-160 (2009).
  23. Jambrina, E., et al. Calcium influx through receptor-operated channel induces mitochondria-triggered paraptotic cell death. The Journal of Biological Chemistry. 278, 14134-14145 (2003).
  24. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7 1(2009).
  25. Herranz, G., et al. Protein Kinase C delta Regulates the Depletion of Actin at the Immunological Synapse Required for Polarized Exosome Secretion by T Cells. Frontiers in Immunology. 10, 851(2019).
  26. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42, 864-876 (2015).
  27. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence Microscopy: A Concise Guide to Current Imaging Methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunological SynapseAntigen Presenting CellT Helper LymphocyteCell To Cell ConjugationWide Field Fluorescence MicroscopyTime Lapse AcquisitionImage Processing DeconvolutionLaser Scanning Confocal MicroscopyEnd Point FixationFluorescence Bleaching Reduction

Gerelateerde artikelen