Methodenartikel

Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan

8.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60314

⸱

8 februari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Uitgezaaid helder celnieraal celcarcinomis is een ziekte zonder een uitgebreid diermodel voor grondig preklinisch onderzoek. Dit protocol illustreert twee nieuwe diermodellen voor de ziekte: het orthotopicalisch geïmplanteerde muismodel en het kipchorioallantoïsche membraanmodel, die beide longmetastasen aantonen die lijken op klinische gevallen.

Samenvatting

Uitgezaaide heldere cel niercel carcinoma (ccRCC) is de meest voorkomende subtype van nierkanker. Gelokaliseerde ccRCC heeft een gunstige chirurgische uitkomst. Echter, een derde van ccRCC patiënten zal ontwikkelen metastasen naar de long, die gerelateerd is aan een zeer slechte uitkomst voor patiënten. Helaas is er geen therapie beschikbaar voor deze dodelijke fase, omdat het moleculaire mechanisme van metastase onbekend blijft. Het is al 25 jaar bekend dat het verlies van functie van de von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gen pathognomonic van ccRCC is. Er is echter geen klinisch relevant transgene muismodel van ccRCC gegenereerd. Het doel van dit protocol is het introduceren en vergelijken van twee nieuw opgerichte diermodellen voor gemetastaseerde ccRCC. De eerste is nierimplantatie in het muismodel. In ons laboratorium werd het CRISPR-genbewerkingssysteem gebruikt om het VHL-gen in verschillende RCC-cellijnen uit te schakelen. Orthotopische implantatie van heterogene ccRCC populaties naar de niercapsule creëerde nieuwe ccRCC-modellen die robuuste longmetastasen ontwikkelen bij immunocompetente muizen. Het tweede model is het kipchorioallantoïsche membraan (CAM) systeem. In vergelijking met het muismodel is dit model meer tijd, arbeid en kostenefficiënt. Dit model ondersteunde ook robuuste tumorvorming en intravasatie. Vanwege de korte periode van 10 dagen van tumorgroei in CAM, werd geen openlijke metastase waargenomen door immunohistochemie (IHC) in de verzamelde embryoweefsels. Echter, toen de tumorgroei werd uitgebreid met twee weken in de uitgebroede kip, werden microgemetastase ccRCC laesies waargenomen door IHC in de longen. Deze twee nieuwe preklinische modellen zullen nuttig zijn om het moleculaire mechanisme achter metastase verder te bestuderen en om nieuwe, door patiënten afgeleide xenografts (PDX's) vast te stellen voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor gemetastaseerde ccRCC.

Inleiding

Niercelcarcinoma (RCC) is de7e meest voorkomende kanker in de Verenigde Staten. Jaarlijks, 74.000 Amerikanen worden geschat op nieuw gediagnosticeerd, goed voor meer dan 14.000 sterfgevallen (Clear-cell histologische subtype, of ccRCC, is de meest voorkomende subtype, goed voor ongeveer 80% van de RCC gevallen. Patiënten met gelokaliseerde maligniteit worden behandeld met nefrectomie en hebben een gunstige 5-jaars overlevingskans van 73%1. Echter, 25%-30% van de patiënten ontwikkelen verre metastasen naar vitale organen zoals de longen, wat resulteert in een slechte gemiddelde overleving van 13 maanden en 5-jaars overlevingskans van slechts 11%1,2,3. Verder begrip van het uitgezaaide mechanisme is nodig om de dodelijke uitkomst voor gemetastaseerde ccRCC te verbeteren.

Het verlies van het VHL tumorsuppressorgen is een kenmerk genetische laesie waargenomen in een meerderheid van de menselijke ccRCC gevallen4,5,6,7. Het precieze oncogene mechanisme van VHL-verlies in ccRCC is echter onbekend. Ook is de VHL-expressiestatus niet voorspellend voor de uitkomst in ccRCC8. Met name, ondanks talrijke pogingen tot nier-epitheliale gerichte VHL knock-out, wetenschappers hebben nagelaten om nierafwijkingen te genereren dan de preneoplastische cystische laesies waargenomen in muizen9, zelfs in combinatie met het verwijderen van andere tumorsuppressors zoals PTEN en p5310. Deze bevindingen ondersteunen het idee dat VHL verlies alleen onvoldoende is voor tumorigenese of de daaropvolgende spontane metastase.

Onlangs heeft ons laboratorium een nieuwe VHL knock-out (VHL-KO) cellijn met behulp van CRISPR / Cas9 gemedeerde schrapping van het VHL-gen in de murine VHL + ccRCC cellijn (RENCA, of VHL-WT)11,12. We toonden aan dat VHL-KO niet alleen mesenchymale is, maar ook epitheel bevordert tot mesenchymale overgang (EMT) van VHL-WT cellen12. Het is bekend dat EMT een belangrijke rol speelt in het uitgezaaide proces13. Ons werk toonde verder aan dat verre longmetastase alleen optreedt met co-implantatie van VHL-KO- en VHL-WT-cellen in de nier, ter ondersteuning van een coöperatief mechanisme van metastase. Belangrijk is dat ons orthotopically geïmplanteerde VHL-KO- en VHL-WT-model leidt tot robuuste longmetastasen, die de klinische ccRCC-gevallen samenvatten. Dit spontane gemetastaseerde ccRCC-model compenseert het ontbreken van een transgeen gemetastaseerd muismodel, vooral bij de ontwikkeling van nieuwe antimetastasegeneesmiddelen. Dit protocol toont de niercapsule implantatie van de heterogene celpopulaties van genetisch gemanipuleerde RENCA-cellen.

Chicken CAM modellen hebben een lange geschiedenis in onderzoek naar angiogenese en tumorbiologie als gevolg van hun talrijke voordelen, zoals samengevat in tabel 114,15,16,17,18. Kortom, het tijdvenster voor CAM tumor groei is kort, waardoor een maximum van 11 dagen totdat de CAM wordt vernietigd bij het uitkomen van de kip16. Ondanks de korte groeitijd maken de rijke voeding en de immunodeficiëntie van het kippenembryo een zeer efficiënte tumorengraftment16,19,20,21mogelijk . Ten slotte, de kosten van elke bevruchte eicel is ~ $ 1, vergeleken met meer dan $ 100 voor een SCID muis. Samen kan het CAM-model dienen als een waardevol alternatief diermodel bij het opzetten van nieuwe PDX's tegen een grote besparing in tijd en kosten in vergelijking met de muis. In dit protocol hebben we beoordeeld of het model in staat was om de biologie van gemetastaseerde ccRCC in het orthotopopisch model van de muis samen te vatten.

(SCID) MuisCamOpmerking
Kosten>$100 per stuk~$1 per stukLevensvatbaarheid variërend van 50-75%
Behoefte aan barrièrehuisvestingJa№Verder vermindert de kosten en vereenvoudigt de seriële monitoring van de tumoren
Tumor direct zichtbaar№JaFiguur 3A
Tijd tot eerste engraftment (RENCA)2 weken2-4 dagenref 14, 15
Eindpunt van de groei (RENCA)3-6 weken10 dagenref 14, 15
Metastase (RENCA) waargenomenJaJa bij kuikensFiguur 3D
Seriële passagesJaJaref 16-18
Passage naar muizen (RENCA)JaJaHu, J., et al. onder de loep (2019)
Behoud tumorheterogeniteitJaJaHu, J., et al. onder de loep (2019)

Tabel 1: Voordelen en beperkingen van de muis- en CAM-modellen. Deze tabel vergelijkt de twee modellen voor hun voordelen en beperkingen in termen van vereiste tijd, kosten, arbeid, evenals de biologie. Het CAM-model heeft voordelen in efficiëntie, maar heeft ook zijn eigen unieke beperkingen vanwege de verschillende morfologie tussen vogels en zoogdieren. Daarom is het belangrijk om te bevestigen dat het model de biologie van de xenografts kan behouden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC), aangewezen als UCLA Chancellor's Animal Research Committee (ARC) (ARC 2002-049-53 en ARC 2017-102-01A). Het protocol 2002-049-53 is geoptimaliseerd voor de implantatie van ccRCC tumorcellen in de niercapsule van Naakt- of BALB/c-muizen. Tumor implantatie experimenten in bevruchte kippeneieren voorafgaand aan het uitkomen vereist geen IACUC goedkeuring. Om de tijd voor de oprichting van longmetastase te verlengen, mogen de embryo's met CAM-tumor uitkomen en uitgroeien tot kippen. Het protocol 2017-102-01A heeft betrekking op deze dierproeven.

1. Orthotopische tumorstudies bij muizen

OPMERKING: De tijdlijn voor dit experiment wordt weergegeven in figuur 1A. Deze procedures werden aangepast aan de voorgaande publicaties11,12.

  1. Voorbereiden van eencellige suspensie voor enting
    1. Maak de RENCA VHL-WT- en VHL-KO cellen los van de kweekgerechten met trypsin/EDTA.
    2. Tel de cellen met een hemocytometer en breg in een voorgekoeld 1:1 mengsel van PBS en extracellulaire matrixoplossing bij een concentratie van 1 x 105 cellen/μL.
      OPMERKING: Gebruik een 1:4 verhouding van VHL-WT:VHL-KO cellen voor heterogene implantaten en VHL-WT alleen voor homogene implantaten.
    3. Breng de opnieuw opgelopen cellen over in een microcentrifugebuis van 1,5 mL en blijf op ijs tot de implantatie.
  2. Implantatie naar niercapsule
    1. Anesthesie: Verwarm een warm kussen voor op 37 °C en bedek het met een stuk dik steriel laken. Verdoven de muis door een van beide isoflurane inhalatie via een inductiekamer of intraperitoneale (IP) injectie van 1% pentobarbital natrium bij de dosering van 10 mL/kg.
    2. Scheer het haar van de chirurgische plaats. Deze stap kan worden overgeslagen voor naakte muizen.
    3. Desinfectie en chirurgische draperen: Desinfecteer de achterkant van de muis volledig met povidone-jodium 3x gevolgd door 70% ethanol 1x en veeg het droog met steriele wattenstaafjes. Breng vervolgens drie steriele medische verbanden achtereenvolgens aan, die de hele rug bedekken om een chirurgisch veld te creëren en om de muis te immobiliseren.
    4. Incisie en nierexteriorisatie: Voor de operatie desinfecteer je de vingers van de operator met povidone-jodium of gebruik je een paar steriele handschoenen. Plaats de muis in de gevoelige positie en gebruik de vingers om de linker nier rechts onder de linkerflank te lokaliseren. Gebruik een paar stompe tangen en scharen om de huid open te snijden en de spierlaag onder de opgegeven locatie. Gebruik steriele wattenstaafjes en tangen om de linkernier gedeeltelijk uit de buik te buiten te stellen.
    5. Tumorcelimplantatie: Laad de celvering bereid in stap 1.1 in insulinespuiten of aangepaste Hamilton-spuiten (zie Tabel met materialen voor specificaties). Injecteer 20 μL opnieuw gesuspendeerde cellen onder de niercapsule.
      OPMERKING: Succesvolle injectie wordt bepaald door de vorming van een doorschijnende uitstulping op het oppervlak van de nier. Accidentele injectie in de nierparenchyma resulteert in bloedingen en een postoperatief sterftecijfer tot 90% als gevolg van fatale bloedingen op de injectieplaats.
    6. Trek langzaam de naald eruit om de extracellulaire matrixoplossing te laten stollen en bloedingof tumorcellekkage te voorkomen. Dan, met behulp van een steriele wattenstaafje, duw de nier terug in de buik.
    7. Wondstiksels: Gebruik een 5-0 gecoate VICTRYL hechting om de spierlaag te naaien. Desinfecteer de huid met povidone-jodium een keer en sluit de huid met wond autoclips.
    8. Herstel: Plaats de muis op de warme pad totdat deze wakker wordt. Als de muis werd verdoofd door inademing, trek de isoflurane en houd de muis op de warme pad totdat het wakker is.
  3. Bioluminescentie beeldvorming (BLI) en weefselverzameling
    1. Neem zes weken na de tumorimplantatie de op vuurvlieg gebaseerde BLI-beelden. Dan euthanaseren muizen met isoflurane inademing gevolgd door cervicale dislocatie.
    2. Verzamel bloed voor circulerende tumorcel (CTC) detectie door stroom cytometrie.
    3. Oogst tumor en organen van belang (nieren, longen, lever, darmen en milt) met behulp van een steriele weefseloogsttechniek22. Fix ze in 4% paraformaldehyde 's nachts voor paraffine-wax inbedding.

2. CAM tumor xenograft model

OPMERKING: Deze procedures zijn aangepast en aangepast aan de eerder gepubliceerde protocollen23,24. De tijdlijn voor deze procedure wordt weergegeven in figuur 1B. Dit artikel presenteert alleen het gestroomlijnde protocol. Voor gedetailleerde protocollen verwijzen wij u naar een ander JoVE-artikel gepubliceerd door onze groep25.

  1. Preincubatie: Incubeer vers gelegde, bevruchte kippeneieren in een roterende eierbroedmachine bij 37 °C en 55-65% vochtigheid gedurende 7 dagen.
  2. Laat de CAM en open venster (ontwikkelingsdag 7):
    1. Zoek en markeer de luchtzak en aders.
      LET OP: Meestal 10-15% van de eieren worden verwijderd omdat ze ofwel onbevrucht of sterven binnen 7 dagen na de bevruchting.
    2. Maak een nieuwe luchtzak bovenop een gemarkeerde ader.
    3. Lijn de nieuwe luchtzak af, breng verpakkingstape aan en breng de eieren terug naar de couveuse.
      LET OP: De procedure kan hier worden onderbroken. Het wordt aanbevolen om de procedures binnen dezelfde dag te hervatten omdat de luchtzak kan bewegen.
    4. Open een venster: Met behulp van een paar gebogen microdissecting schaar en een paar naald-neus tangen, snijd een 1,5 x 1,5 cm cirkelvormig venster in de schelp.
      OPMERKING: Verstoring van CAM wordt aangegeven door het bloed en een stuk CAM aanwezig op de gesneden shell stuk.
    5. Sluit het gat af met een transparante medische dressing en plaats de eieren in een stationaire couveuse op 37 °C en 55%-65% vochtigheid.
      LET OP: Gebruik dezelfde eierbroedmachine als in stap 2.1. Zet de rotator uit om hem stil te laten staan.
  3. Gezondheidscontrole (ontwikkelingsdag 9): Verwijder dode eieren en groepeer vervolgens willekeurig de rest van de eieren voor tumorcelimplantatie.
    OPMERKING: Idealiter is de overlevingskans op dit punt ongeveer 80% van ontwikkelingsdag 0.
  4. Het enten van de tumorcellen op de nieuw blootgestelde CAM (ontwikkelingsdag 10)
    1. Verdun de extracellulaire matrixoplossing in het dubbele van het volume van de voorgekoelde RPMI 1640 (met L-glutamine). Maak de RENCA-cellen los en breg deze opnieuw op in de bovenstaande oplossing om een concentratie van 2 x 104 cellen/μL te bereiken.
      OPMERKING: Gebruik een 1:1 verhouding van VHL-WT:VHL-KO cellen voor heterogene implantaten en VHL-WT alleen voor homogene implantatie.
    2. Als u de celvering wilt voorversterken, vult u 100 μL van elke celmix in 200 μL pipettips en plaatst u deze gedurende 15 minuten in een celcouveuse.
    3. Implanteer 100 μL celsuspensie voor elk ei op het CAM-oppervlak door het raam.
      OPMERKING: Sommige protocollen vereisen krassen op de CAM voor de implantatie23. Dit is niet nodig voor RENCA cellen, omdat ze zeer snel groeien.
  5. Kweek cellen op de CAM gedurende 10 dagen en fotografeer elke 2 dagen.
  6. Euthanaseren en oogst de tumor, bloed en organen.
    1. Op ontwikkelingsdag 20 (tumordag 10) verzamel je bloed via de chorioallantoische ader met een gehepariniseerde spuit van 10 mL.
    2. Euthanaseer de embryo's door ze 15 min op ijs te zetten.
    3. Oogst en weeg tumoren. Ontleed longen en levers met behulp van een steriele weefseloogsttechniek vergelijkbaar met die gebruikt worden voor muizen22.
      OPMERKING: Kippen levers hebben twee lobben, die de eerste organen gezien in de buikholte. Verwar deze niet met de longen. De kippenlongen bevinden zich onder het hart en septum26. De succesvolle verzameling van de longen kan worden bevestigd door blootgestelde ribben.
    4. Fix de tumoren en de ontleed organen in 4% paraformaldehyde 's nachts voor paraffine-wax inbedding.
  7. Broed de kippen uit.
    1. Om een langere periode van tumorgroei mogelijk te maken, zet u de incubatie door dag 21 voort en laat u de kippen uitkomen bij 37 °C en ten minste 60% vochtigheid.
      LET OP: Kippen natuurlijk uitkomen na dag 21 over een periode van 24 uur, maar af en toe moeite hebben broeden door zelf. In dit geval, het kraken van de eierschalen wat helpt. Het is belangrijk voor kippen om het broedproces binnen 24 uur te voltooien, omdat ze daarna zullen sterven aan een gebrek aan voedingsstoffen.
    2. Kweek de kippen in een dierenvoorziening (2017-102-01A) gedurende 2 weken.
    3. Op ontwikkelingsdag 34 (tumordag 24) euthanaseren de kuikens met isoflurane inademing gevolgd door cervicale dislocatie.
    4. Ontleed de longen met behulp van een steriele weefseloogsttechniek die vergelijkbaar is met die voor muizen22. Dan, fix ze in 4% paraformaldehyde 's nachts voor paraffine-wax inbedding.

3. Immunohistochemie

OPMERKING: Alle weefselsectie en H&E-kleuring werden gedaan door het Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) aan de Universiteit van Californië, Los Angeles.

  1. Bak dia's op 65 °C gedurende 20 min en deparaffinize 3x met xyleen en hydrateren serieel van 100% ethanol tot water.
  2. Haal de antigenen in een citrate buffer gekookt in een plantaardige stoomboot voor 25 min.
  3. Breng 1% BSA aan voor blokkering. Breng vervolgens de primaire antilichamen (anti-VHL, anti-HA, anti-vlag) bereid bij een 1:200 verdunningsverhouding in PBS. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
  4. Na het wassen van 3x met TBST (elk 7 min), incubeer dia's met het secundaire antilichaam op 1:200 verdunning. Was 3x met TBST (elk 7 min) en breng DAB-reagentia aan, gevolgd door hematoxylinecountervlekken.

4. Stroom Cytometrie

  1. Verwerk de muis of het kippenbloed met rode bloedcel (RBC) lysis buffer volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: Voldoende RBC lyse is vooral belangrijk bij het analyseren van CAM bloed omdat kip RBC's zijn nucleated en kan niet gemakkelijk worden onderscheiden in flow cytometrie met behulp van de voorwaartse en zijverstrooiing.
  2. Voer de cytometrie op het bloedlysaat uit en analyseer de gegevens voor mStrawberry- en EGFP-expressie.
  3. Stel de primaire poorten in op basis van de voorwaartse en zijverstrooiing, met uitzondering van puin, dode cellen en ongeseerde RBC's.
  4. Stel de fluorescentiepoorten in op basis van de onbevlekte monsters en enkele bevlekte bedieningselementen. Gebruik bloedlysaat geprimed met VHL-WT, VHL-KO, of niet-gelabelde RENCA cellen als de single gekleurde controles en onbevlekte controles, respectievelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Elk experiment werd uitgevoerd ten minste 3x tenzij anders vermeld. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Betekenis werd bepaald door een gekoppelde, Student's T-test toen er twee groepen of door een eenrichtings ANOVA waren toen er drie of meer groepen waren. Een p-waarde cutoff van 0,05 werd gebruikt om betekenis vast te stellen.

Orthotopically geïmplanteerde RENCA cellen met succes groeide op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voor veel patiënten met epitheliale maligniteiten is metastase naar vitale organen de belangrijkste oorzaak van sterfte. Daarom is het essentieel om het onderliggende mechanisme en een nieuwe manier van therapie voor gemetastaseerde ziekte te vinden. Helaas is er een gebrek aan relevante gemetastaseerde ccRCC diermodellen. De uitdaging is voor een groot deel te wijten aan het onvermogen om ccRCC opnieuw in muizen, ondanks de generatie van tal van transgene nier epithelial-gerichte VHL knock-out muis modellen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de UCLA JCCC seed grant, UCLA 3R grant, UCLA CTSI en UC TRDRP (LW). Wij danken de Preklinische Beeldvormingsfaciliteit van het Crump Institute, de TPCL en het Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) van het Crump Institute voor hun hulp bij experimentele methoden. Flow cytometrie werd uitgevoerd in de UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) en Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility, die wordt ondersteund door National Institutes of Health awards P30 CA016042 en 5P30 AI028697, en door de JCCC, de UCLA AIDS Institute, de David Geffen School of Medicine aan de UCLA, de UCLA Chancellor's Office, en de UCLA Vice Chancellor's Office of Research. Statistieken consulting en data-analyse diensten werden geleverd door de UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiologie, en Research Design (BERD) Programma dat wordt ondersteund door NIH / National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS zonder Calcium, Magnesium en Sodium BicarbonaatCorning25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool KitDremel8050-N/18
anti-VHL-antilichaamAbcamab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin-seringBD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences555899
BD-algemeen gebruik en PrecisionGlide hypodermische naaldenFisher Scientific14-826-5D
DAB Chromogen KitBiocare MedicalDB801R
D-Luciferine van vuurvlieg, kaliumzoutGoldbioLUCK-1G
DPBS zonder calcium en magnesiumGibcoLS14190250
DYKDDDDK Tag Monoklonaal Antilichaam (FG4R)eBioscience14-6681-82
Ethanol 200 ProofCylinders Management43196-11Bereid 70% in water
Fetaal bovien serum, gekwalificeerd, USDA-goedgekeurde regio'sFisher Scientific10-437-028
Fisherbrand scherp gepunte dissectiescharenFisher Scientific08-940
Fisherbrand steriele wattenschijfjesFisher Scientific22-456-885
FisherbrandHoge precisie rechte conische ultrafijne pincet/tangFisher Scientific12-000-122
FisherbrandPremium microcentrifugebuizen: 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Formaldehyde-oplossing, 4%, gebufferd, pH 6,9 (ongeveer 10% Formaline-oplossing), voor histologieMilliporeSigma1.00496.5000
Hamilton aangepaste spuitHamilton8040825 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Lengte naald: 17 mm
HA-probe Antilichaam (Y-11)Santa Cruz Biotechnologysc805
HemocytometersHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo KitIncubator WarehouseHB1588D
Isothesia (Isoflurane) oplossingHenry Schein Animal Health1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging SystemPerkin Elmer
Matrigel GFR-membraanmatrixCorningC354230
Medline chirurgische instrumenten-afdekdoek, helder kleefmiddel, 24" x 18"Medex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovien Serum Albumine] Warmteshock-isolatieMilliporeSigma2910-25GM
Penicilline-Streptomycine-oplossing, 100X, 10.000 IU Penicilline, 10.000ug/mL StreptomycineFisher ScientificMT-30-002-CI
Pentobarbital-natriumSigma Aldrich57-33-0Bereid 1% in zoutoplossing
Peroxidase AffiniPure Geit Anti-Muis IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
Peroxidase AffiniPure Geit Anti-Konijn IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
Povidon-jodium-oplossing USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Beschikbare jodium, voor laboratoriumgebruikRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Puromycin dihydrochloride hydraat, 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X met L-GlutamineCorning10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low ProfileFisher ScientificAB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, Voor P-200, 200 µl, 960 (10 racks van 96)Thomas Scientific1159M40
Verpakkingstape, Multifunctioneel, 1,89" x 109,4 Yd., Tan, Pack Of 6 RollsOffice Depot220717
NaaldEthiconJ385H
Tegaderm Transparant Verband Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"Moore Medical1634
Thermo-Chicken Verwarmd PadK&H manufacturing1000
Tygon Clear Laboratory Buizen - 1/4 x 3/8 x 1/16 wand (50 voet)TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR/Cas9-gemedieerde knockout van VHL, vervolgens lentiviraal gelabeld met flag-gelabelde EGFP & vuurvlieg luciferase
VHL-WTLentiviraal gelabeld met HA-gelabelde mStrawberry fluorescente eiwit & vuurvlieg luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
Wound autoclips kitBraintree scientific, inc.ACS KIT
Xyleens (histologisch), Fisher ChemicalFisher ScientificX3S-4

Referenties

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009(2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032(2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6(2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815(2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nierimplantatie bij muizenVHL genknock outorthotopische tumorimplantatieanalyse van longmetastasentelling van circulerende tumorcellenimmunohistochemische detectieCRISPR genbewerkingpati ntafgeleide xenografts

Gerelateerde artikelen