Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chronische, acute en Gereactiveerde HIV-infectie in gehumaniseerde Immunodeficiënte Muismodellen

10.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60315

⸱

3 december 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschreven zijn drie experimentele benaderingen voor het bestuderen van de dynamiek van HIV-infectie in gehumaniseerde muizen. De eerste maakt de studie van chronische infectie gebeurtenissen, terwijl de twee laatsten voor de studie van acute gebeurtenissen na primaire infectie of virale reactivatie.

Samenvatting

Gehumaniseerd NOD/SCID/IL-2 receptor γ-ketenNull muizen recapituleren sommige kenmerken van de menselijke immuniteit, die kunnen worden misbruikt in basis-en preklinisch onderzoek naar besmettelijke ziekten. Hier beschreven zijn drie modellen van gehumaniseerd immunodeficiënte muizen voor het bestuderen van de dynamiek van HIV-infectie. De eerste is gebaseerd op de Intrahepatische injectie van CD34+ hematopoietische stamcellen in pasgeboren muizen, die de reconstitutie van verschillende bloed-en lymfoïde weefsel-besloten cellen mogelijk maakt, gevolgd door infectie met een referentie-HIV-stam. Dit model maakt monitoring mogelijk tot 36 weken na infectie en wordt daarom het chronische model genoemd. De tweede en derde modellen worden de acute en reactiverings modellen genoemd, waarin perifere bloed mononucleaire cellen intraperitoneaal worden geïnjecteerd bij volwassen muizen. In het acute model worden cellen van een gezonde donor geënt via de intraperitoneale route, gevolgd door een infectie met een referentie-HIV-stam. Tot slot worden in het reactiveringsmodel cellen van een HIV-geïnfecteerde donor onder antiretrovirale therapie via de intraperitoneale route geënt. In dit geval, een drug-vrije omgeving in de muis zorgt voor virus reactivering en een toename van de virale belasting. De protocollen die hier worden beschreven, beschrijven de conventionele experimentele aanpak voor gehumaniseerde, immunodeficiënte muizen modellen van HIV-infectie.

Inleiding

De gehumaniseerde NOD/SCID/Interleukine (IL)-2-receptor γ-ketenNull (hierna genoemd huns γ-ketenNull) muismodel is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de pathogenese van infecties, auto-immuniteit, en Cancer, evenals voor pre-klinische studies van drugs en menselijke cel gebaseerde therapieën1,2. Deze muizen zijn gebaseerd op een niet-zwaarlijvige diabetische (NOD) achtergrond, met de scid -mutatie en gerichte mutatie bij de Il-2-receptor γ-Chain Locus (gemeenschappelijke γ-keten voor Il-2, Il-4, Il-7, Il-9, Il-15 en Il-21), die een ernstige aantasting veroorzaken bij de ontwikkeling van muis T-, B-en Natural Killer (NK)-cellen1. Zo ondersteunen ze het engraftment van menselijk weefsel, humane CD34+ hematopoietische stamcellen (hscs) en humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)3,4,5. Bovendien bevordert transgene expressie van menselijke hematopoietische factoren, zoals stamcel factor (SCF), granulocyt/macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), en Il-3 de engraftment van menselijke myeloïde populaties6,7,8.

Voor HIV-onderzoeken zijn verschillende huNS γ-ChainNull -Muismodellen beschreven, die verschillen in de muis stam, het type gebruikte menselijke cellen, het type weefsels voor de engraftment en de oorsprong van cellen (d.w.z. gezond versus HIV-geïnfecteerde donor)9,10. De oorspronkelijke stam, echter, wordt veel gebruikt als gevolg van de hoge niveaus van menselijke cellen engraftment en virale replicatie na infectie met een verwijzing HIV-stam11,12,13. Soortgelijke immunodeficiënte muizenstammen met transgene expressie van menselijke hematopoietische factoren (bijv. nog-EXL of NSG-SGM3) of met implantaten van menselijke lever en Thymus weefsels (beenmerg-lever-Thymus [blt] muizen) zijn nuttig voor het evalueren van de rol van myeloïde populaties in de anti-HIV-immuunrespons, effecten van HIV op deze weefsels, en hun deelname als virale reservoirs14,15. Bovendien kunnen sommige stammen met een transgene expressie van humane leukocytenantigeen (HLA) moleculen, evenals blt-muizen, worden gebruikt voor het bestuderen van de T-cel respons op HIV-infectie16,17.

In het algemeen, in deze muizen, is de humanisatie afhankelijk van de cellulaire oorsprong, de toedieningsroute (intraperitoneale, Intrahepatische, intraveneuze, intracardiac) en muis leeftijd op het moment van engraftment18,19,20. Met betrekking tot de celoorsprong kan Human CD34+ HSC afgeleid van snoer bloed, foetale lever of gemobiliseerd perifeer bloed worden geïnjecteerd bij pasgeborenen of jonge muizen3,21. Bovendien kunnen volwassen γ-ketennulmuizen worden gehumaniseerd door de injectie van PBMC (hier, aangeduid als Hu-PBL-NS γ-ChainNull muizen), waardoor de temporale circulatie van deze cellen in het bloed, secundaire lymfoïde organen en ontstoken weefsels22,23,24.

Hier beschreven is een gedetailleerd protocol voor het opzetten van huNS γ-ChainNull Muismodellen voor de studie van HIV-infectie. De eerste is het chronische model, waarbij humane CD34+ hscs afgeleid van bloed van een gezonde donor worden geïnjecteerd in pasgeboren muizen, gevolgd door infectie met een referentie HIV-stam na 14 weken van het menselijk immuunsysteem reconstitutie. Dit model maakt het mogelijk om muizen te monitoren tot ~ 36 weken na infectie. Het tweede model is een acuut model, waarin PBMCs, afgeleid van een gezonde donor, worden geïnjecteerd in volwassen NS γ-ketennulmuizen , gevolgd door infectie met een referentie-HIV-stam na 3 weken menselijke T-cel expansie in de muis. Ten slotte is het derde model het reactiveringsmodel, waarin PBMCs, afkomstig van een HIV-geïnfecteerde donor onder suppressieve antiretrovirale therapie (kunst), wordt geïnjecteerd in volwassen NS γ-Chainnulmuizen . In dit geval, een drug-vrije omgeving zorgt voor virale reactivering en verhoging van de virale belasting. De twee laatste modellen maken bewaking mogelijk tot ~ 9 weken na engraftment.

Over het algemeen zijn deze drie modellen nuttig voor virologische studies, preklinische studies van nieuwe geneesmiddelen, en evaluatie van HIV-infectie effecten op de wereldwijde immuunrespons. Het is ook belangrijk om te bedenken dat het gebruik van met HIV geïnfecteerde gehumaniseerde muizen moet worden herzien en goedgekeurd door het Comité voor institutionele bioveiligheid (IBC) en door het Comité voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC) voor een experiment. Dit zorgt ervoor dat de studie alle interne en externe institutionele voorschriften voor het gebruik van gevaarlijk biologisch materiaal en humane hantering van proefdieren volgt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

In dit werk werden alle dierenverzorging en-procedures uitgevoerd volgens de protocollen die werden beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Maryland School of Medicine (protocol nummers 1018017, 1018018 en 0318009).

1. Human CD34+ HSC engraftment van pasgeboren muizen

  1. Gebruik altijd wegwerp persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder steriele scrubs, handschoenen, speciale schoenen, schoen hoezen, masker, bril, haar/baard motorkap en steriele Labjassen.
  2. Resuspendeer 1 x 106 van bevroren CD34+ Hscs (Zie tabel met materialen) in 10 ml RPMI 1640 media 10% FBS onder een gecertificeerde bioveiligheids kast en houdster iele condities.
  3. Gebruik 10 μL van de suspensie om te tellen (om de aanwezigheid van het verwachte aantal cellen te verzekeren) en controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypeen blauwe uitsluitings kleuring in een hemocytometer.
  4. Centrifugeer op 400 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg en regeer in koude 1x PBS naar de gewenste concentratie (1,4 x 105 van CD34+ Hscs in 50 μL). Houd de cellen op het ijs tot de injectie.
  5. Plaats pups (NS γ-ketenNull pups van beide geslachten van 1 – 4 dagen oud) in een steriele 100 mm2 Petri schaal samen met een kleine hoeveelheid van het strooisel van de kweker kooi. Bovendien, wrijf schoon beddengoed tussen de handen om verder te maskeren eventuele vreemde geuren op de ontvanger pups.
    Let op: Dit minimaliseert vreemde geuren die worden geïmpregneerd op de pups, waardoor de kans dat moeders hun pups na de ingreep weer in kooien accepteren, wordt verbeterd.
  6. Zet de Petri schaal in een schone TRANSPORTKOOI en plaats de kooi in een schone muis microisolator kooi om pups te beschermen tegen de omgeving. Bedek de TRANSPORTKOOI met een afdek kussen om blootstelling van dieren aan uitwendig licht te voorkomen tijdens het vervoer naar de bestralings ruimte.
  7. Bestraleren pups met 100 cGy Whole Body bestraling (WBI) door blootstelling aan een 137 CS bron. Reinig het inwendige van de irradiator met desinfecterende oplossing, plaats muizen in de irradiator en zet de draaitafel aan zodat alle pups homogeen worden bestraald. Sluit de irradiator en druk op de aan/uit-schakelaar om het bestralings proces te starten. Wacht tot de bestralings tijd is voltooid en verwijder onmiddellijk de muizen.
    Opmerking: aangezien bestraling geen stress in de muizen genereert, is eerdere anesthesie niet vereist.
  8. 2 – 4 h na de bestralings procedure, plaats pups in een bioveiligheidskast in een gekoeld steriel Petri schaaltje bedekt met steriel gaas op ijs, tot verdoven (~ 5 – 10 min). Voldoende verdoving wordt bereikt wanneer de bruto bewegingen ophouden.
  9. Plaats de spuit met een bijgevoegde naald (29 G, 0,5 ") met 50 μL celsuspensie en 1,4 x 105 van CD34+ hscs onder de gecertificeerde bioveiligheid-kast.
  10. Voor de engraftment via hepatische injectie, bedwingen pups met de duim en wijsvingers. Om de muis terughoudendheid te minimaliseren (~ 30 – 45 s), laat een onderzoeker de pup vasthouden en de injectie toedienen en de tweede onderzoeker de spuit met de HSC-suspensie laten laden. Reinig de injectieplaats met 70% alcohol en lever 50 μL cellen direct in de lever. Gebruik een ondiepe naald hoek bij het injecteren om te voorkomen dat volledig doorboren van de lever. Als controle injecteert u muizen met 50 μL 1x PBS in de lever.
  11. Plaats de pups op een voorverwarmde steriele Petri schaal bedekt met steriel gaas gedurende 1 – 5 minuten om het herstel mogelijk te maken. Verwarm het Gerecht voor op 20 °C met een infrarood verwarmingspad voor knaagdieren om te zorgen dat de pups niet overwarmd worden.
  12. Onmiddellijk voor het terugsturen van de pups aan hun ouders, breng een kleine hoeveelheid menthol-en eucalyptus-gebaseerde zalf, met behulp van de duim en wijsvingers, aan de snuit van beide ouders om kannibalisme of afwijzing van de pups te voorkomen.
  13. Check kooien elke dag, op zoek naar tekenen van transplantaat-versus-host ziekte (GVHD) in de pups zoals droge huid, geen voeding, huiduitslag, en alopecia. Euthaniseer de dieren als een van deze verschijnselen wordt waargenomen.
  14. Wean muizen op 3 weken oud, groeperen op geslacht. Plaats niet meer dan 5 dieren per kooi. Controleer de engraftment in het perifere bloed door flow cytometrie op de leeftijd van 14 weken.
    Opmerking: het succespercentage van engraftment ligt tussen 80% – 100%.

2. menselijke PBMC engraftment van juveniele muizen

  1. Injecteer voor de acute en reactiverings modellen 6 – 8 weken oude NS γ-ketennulmuizen intraperitoneaal met humane PBMCs, afgeleid van een gezonde donor of HIV-geïnfecteerde patiënt, respectievelijk onder kunst. In beide modellen, omvatten muizen geïnjecteerd met PBMCs van een gezonde donor zonder HIV-infectie (Sham) als besturingselementen.
  2. Laag 15 mL volbloed in 5 mL steriel dichtheidsgradiënt in een conische buis van 50 mL.
  3. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 30 minuten bij RT, zonder remmen, om te voorkomen dat de Buffy coat gemengd raakt met het dichtheidsgradiënt medium.
  4. Verzamel voorzichtig de Fractie van mononucleaire cellen (tussen de dichtheidsgradiënt en de supernatant) en breng de Buffy coat over naar een centrifugebuis van 15 mL met 10 mL 1x PBS. Centrifugeer bij RT 300 x g gedurende 10 minuten.
  5. Gooi de supernatant weg en verwijder de overgebleven rode bloedcellen door lyseren met 5 ml ACK buffer toegevoegd aan de cellen van de gepileerde. Inincuberen gedurende 4 minuten bij RT.
  6. Centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij RT. Gooi de supernatant weg en respendeer in 10 ml 1x PBS of rpmi 1640 medium.
  7. Gebruik 10 μL van de celsuspensie om de cellen te tellen en de levensvatbaarheid te controleren door trypeen blauwe uitsluitings kleuring in een hemocytometer. Typisch, 1 – 2 x 106 cellen worden verkregen voor elke 1 ml bloed, met meer dan 95% levensvatbaarheid.
  8. Centrifugeer op 300 x g gedurende 10 min bij RT. Gooi het supernatant weg en stel het celnummer in op de gewenste concentratie (in dit geval 3,5 x 106 cellen in 200 μL 1x PBS).
  9. Plaats de spuit met een bijgevoegde naald (28 G, 0,5 ") met 3,5 x 106 PBMCs in 200 ΜL 1x PBS onder een gecertificeerde bioveiligheidskast.
  10. Verwijder de muis uit de kooi en houd deze vast aan de staart, zodat deze het gaas kan vasthouden, waardoor de zachte tractie achteruit wordt toegepast. Plaats vervolgens de index en duim vingers op de schouders van het dier, het grijpen van de losse huid van de nek en het gebruik van de middelvinger om de rug te stabiliseren.
  11. Schuif de muis naar achteren zodat de achterkant boven het hoofd ligt. Hierdoor kan de ingewanden in de buikholte achteruit worden verplaatst en wordt het risico op het doorprikken van de inwendige organen tijdens de injectie verminderd.
  12. Reinig de injectieplaats met 70% alcohol.
  13. Penetreren de spuit gebruikt in stap 2,9 door de buikwand en aspiraat voor het injecteren van de cellen, als er materiaal wordt aangezogen, verwijder de spuit en gooi deze weg. Injecteer anders de cellen langzaam in de intraperitoneale Holte, verwijder de spuit en gooi deze weg. Injecteer 1x PBS om muizen te besturen.
  14. Voer het dier terug naar de kooi.
  15. Controleer of de engraftment in perifeer bloed doorstroming cytometrie na 3 weken na de injectie.

3. post-engraftment zorg

  1. Identificeer muizen op oormerken.
  2. Observeer de muizen die in deze experimenten worden gebruikt nauwkeurig 2x per dag na elke procedure voor klinische tekenen van nood.
  3. Na menselijke cellen transplantatie, monitor muizen voor GVHD. Voor het bewaken van GVHD-symptomen bij pasgeboren, juveniele en volwassen muizen, evalueer je dieren voor het verschijnen van een huidziekte (d.w.z. kleur, droogheid, huiduitslag, alopecia), naast de lichaamsgewicht maatregel. Evalueer dieren die deze tekenen door een dierenarts laten zien om vroege euthanasie te overwegen.

4. HIV-infectie procedure en schijn infectie procedure

Opmerking: voor de chronische en acute modellen zijn muizen geïnfecteerd met de HIV-BaL referentiestam op respectievelijk week 14 en week 3 na engraftment. Injecties met HIV worden intraperitoneaal in de lagere abdominale kwadranten toegediend.

  1. Voer het laadproces van het virus/PBS in spuiten, met behulp van een 28 G 0,5 "naald, in BSL2 kasten na ABSL2 procedures. De totale hoeveelheid geïnjecteerd virus is 15.000 mediane weefselcultuur infectieuze dosis (TCID50) in 200 μL steriele rpmi 1640.
  2. Verwijder de muis uit de kooi en houd deze vast aan de staart zodat deze het gaas kan vasthouden, waardoor de zachte tractie achteruit wordt toegepast. Plaats vervolgens de wijsvinger en duim op de schouders van het dier, het grijpen van de losse huid van de nek en het gebruik van de middelvinger om de rug te stabiliseren.
  3. Schuif de muis naar achteren zodat de achterkant boven het hoofd is. Hierdoor kan de ingewanden in de buikholte achteruit worden verplaatst en wordt het risico op het doorprikken van inwendige organen tijdens de injectie verminderd.
  4. Reinig de muizen met een voorbevoafd alcoholdoekje in de linker-en rechter kwadrant van de buik. Injecteer 15.000 TCID50 van het HIV-BaL virus in 200 μL steriele rpmi 1640.
  5. Na de injectie, keert u de muis terug naar zijn huis kooi.

5. bloedafname door retroorbitale punctie

Opmerking: Retroorbitaal bloeden zorgt voor de snelle inzameling van bloed, waardoor de totale afname tijd te verminderen en het verhogen van de stabiliteit van menselijke lymfocyten markers. Gebruik EDTA-buizen om muizen bloed te verzamelen.

  1. In het chronische model, na 14 weken na-HSC injectie, haalt u het bloed op via een retroorbitale ader. In de acute en reactivering modellen, deze procedure uitvoeren na 3 weken post-PBMC injectie.
  2. Anesthetiseer de dieren met behulp van 250 μL Isofluraan inademing voorafgaand aan het verzamelen van bloed in een bioveiligheid Hood klasse B2 die extern wordt geducteerd.
  3. Verdeel de isoflurane in katoenen pads onder een gaas in een doorzichtige 1 L pot in een bioveiligheid Cabinet die buiten het gebouw wordt geventileerd. Het gebruik van het gaas zorgt ervoor dat de dieren geen contact maken met het Isofluraan-geweekte pad, dat huidirritatie en mogelijke overdosering kan veroorzaken, aangezien Isofluraan ook door de huid wordt geabsorbeerd. Leg ook een zachte papieren handdoek tussen het gaas en het dier om ledematen letsel te voorkomen.
  4. Zodra de pot verzadigd is met Isofluraan (ongeveer 1 minuut na toevoeging), Introduceer het dier en observeer de ademhalingsfrequentie, die dan zal toenemen. Controleer de klinische indicatie van een diep vlak van anesthesie, waaronder het ontbreken van een rechtse reflex (bij het zachtjes kantelen van de pot) en het ontbreken van grove bewegingen. Start de bloedings procedure zodra het dier volledig is ontspannen en de teen pinch reflex ontbreekt.
    Opmerking: aangezien Isoflurane verdampt, doseren meer geneesmiddelen als er geen tekenen van anesthesie worden waargenomen.
  5. Voor de retroorbitale bloeding, druk de muis externe halsader ader caudal aan de onderkaak met de duim, en met dezelfde hand, voorzichtig verheffen het bovenste ooglid met de wijsvinger.
  6. Steek een hematocriet buis in de mediale Canthus van het oog en direct in een ventrolaterale richting totdat het bloed begint te fluxing.
  7. Verzamel ten minste 100 μL bloed. Zodra het gewenste volume van het bloed is verkregen (een volume niet meer dan de 1% van het lichaamsgewicht van het dier), stop dan de uitwendige jugulaire druk en verwijder de hematocriet buis.
  8. Verzeker u ervan dat de hemostase compleet is door de directe druk op het oog toe te passen met een steriel gaas voor een minimum van 30 sec.
  9. Breng tetracaine druppels in het oog. Bewaak het dier totdat het volledig is hersteld van anesthesie en plaats het terug in de kooi.
    NB: de 100 μL ingezameld bloed wordt gebruikt voor de evaluatie van het niveau van de engraftment van humaan CD45+ en andere bloedcel populaties, alsmede voor de evaluatie van de plasma-virale Last.

6. screening van engraftment niveau en Flowcytometrie analyse

  1. Volg een conventioneel flow cytometrie kleurings protocol voor volbloed, waaronder de incubatie van fluor chroom-gelabelde anti-humane antilichamen (voor voorgesteld stromings paneel, Zie tabel van materialen), gevolgd door de lysis van rode bloedcellen en het wassen van stappen13,15.
    Opmerking: voor de screening van het niveau van engraftment, omvatten een anti-humaan CD45 antilichaam. Voor de vergelijking kan ook een anti-muis CD45 antilichaam worden gebruikt. Omvatten compensatie controles evenals een menselijke bloedmonster gekleurd met dezelfde antilichaammix, ongekleurde muis en menselijke bloedmonsters, en niet-gehumaniseerde controle om Kruisreactiviteit van de reagentia te testen. Na kleuring is er altijd een achtergrond signaal; alle positieve signalen worden echter duidelijk onderscheiden van negatieve en kruisreactieve controles.
  2. In een geschikte flow cytometer, verwerven ten minste 10.000 gebeurtenissen op de lymfocyten poort (FSC-A VS. SSC-a). Voor Flowcytometrie analyse, na dubbele uitsluiting, bepalen het percentage van de menselijke CD45+ cellen en andere celpopulaties van belang.

7. evaluatie van de plasma-virale belasting

  1. Evalueer de virale belasting bij HIV-geïnfecteerde dieren 1x per week na infectie.
  2. Na de retroorbitale bloeding (ongeveer 100 μL), verkrijgt u plasma door het supernatant te verzamelen na centrifugeren van het anti-gecoaguleerde bloed bij 3.500 x g gedurende 3 minuten in een micro centrifuge. De pellet wordt gebruikt voor het fenotypen van bloedcellen.
  3. Gebruik een commerciële virale RNA-extractie Kit (Zie tabel met materialen) om RNA te verkrijgen van 40 μL plasma.
  4. Zet RNA om in cDNA met behulp van de eerste stam synthese mix (Zie tabel met materialen) en HIV Gag primer SK431.
  5. Voer kwantitatieve real-time PCR uit met de primers SK38/SK39 van HIV gag en fluorescerende groene kleurstoffen (bijv. sybr Green) zoals beschreven in voorgaande onderzoeken13,25.

8. toediening van antiretrovirale therapie

  1. Dien orale kunst toe ten minste 3 weken na infectie, wanneer een hoge virale belasting wordt waargenomen, in de chronische, acute, en reactivatie modellen.
  2. Bereken de doses van tenofovirdisoproxilfumaraat (TDF), emtricitabine (FTC) en raltegravir (RAL), volgens km -waarden van 37 en 3 voor mensen en muizen, respectievelijk26. Typisch, de humane-equivalente doses van TDF, FTC, en RAL zijn 61,7 mg/kg/dag, 40,7 mg/kg/dag, en 164 mg/kg/dag, respectievelijk.
  3. Voor toediening in drinkwater, crush drug tabletten en voeg de respectieve hoeveelheid in de waterfles, ervoor te zorgen dat elke muis in de kooi krijgt zijn dagelijkse dosis. Aangezien het geneesmiddel poeder sediment in de fles kan vormen, schud periodiek de waterfles om homogene suspensie te bereiken.
  4. Verander elke week de waterfles met vers opgeloste geneesmiddelen.
  5. Verzamelen van het bloed via retroorbitale ader elke week of elke 2 weken na de kunstinitiatie om de veranderingen in de virale belasting en CD4: CD8 ratio evalueren.

9. euthanasie van muizen, verzameling van secundaire lymfoïde organen en isolatie van mononucleaire cellen

  1. Euthanasie wordt uitgevoerd in de drie gehumaniseerde muismodellen, periodiek langs infectie tijd, of aan het einde van het experiment.
  2. Voer de euthanasie van volwassen muizen door CO2 asphyxiation, gevolgd door de cervicale dislocatie. Gebruik voor verstikking een niet-voorgeladen kamer, verdeel co2 van een commerciële cilinder met vaste drukregelaar en in lijn restrictie die de gasstroom binnen 20%-30% van de kamervolume/minuut regelt om te voldoen aan 2013 AVMA-richtlijnen.
  3. Onderhoud de CO2 -stroom voor > 60 s controle van de ademhalingsstilstand (die tot 5 min kan duren), gevolgd door de cervicale dislocatie om euthanasie te verzekeren.
  4. Euthanize neonaten < 7 dagen oud door een fysieke methode (d.w.z. met behulp van een scherpe schaar).
  5. Visualiseer axillaire, mediastinale en mesenterische lymfeklieren (die meestal worden waargenomen) en extraheer ze met een pincet en een scherpe schaar. Ook extraheren de milt, gelegen in de linker bovenhoek van de peritoneale holte.
  6. Stort de lymfoïde weefsels in 1,5 mL centrifuge buisjes met steriele RPMI 1640 medium.
  7. Onmiddellijk verwerken van de lymfoïde weefsels in een 70 mm porie-size nylon cel zeef, het verzamelen van de cellen in een buis van 50 mL. De weefsels niet aspireren.
  8. Was de cellen met 5 mL RPMI 1640 medium aangevuld met 1% FBS om het filteren van cellen te vergemakkelijken.
  9. Na de weefsel aggregatie Centrifugeer je de cellen suspensie bij 3.500 x g gedurende 10 minuten in een micro centrifuge.
  10. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen met 500 μL 1x PBS.
  11. Breng de cellen suspensie over in een centrifugebuis van 1,5 mL met 500 μL steriele dichtheidsgradiënt.
  12. Centrifugeer bij 3.500 x g gedurende 3 minuten in een micro centrifuge, zonder rem, om te voorkomen dat de Buffy coat wordt gemengd met het dichtheidsgradiënt medium
  13. Verzamel voorzichtig de Fractie van mononucleaire cellen (tussen de dichtheidsgradiënt en de supernatant) en breng de Buffy coat over naar een centrifugebuis van 1,5 mL met 500 μL 1x PBS. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 3 min.
  14. Verwijder de resterende rode bloedcellen door lyseren met 500 μL ACK-buffer, inbroed gedurende 4 minuten bij RT.
  15. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 3 min. Gooi de supernatant weg en respendeer in 1 ml 1x PBS of medium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals hierboven beschreven, na 14 weken na-HSC injectie (chronisch model) of na 3 weken na PBMC injectie (acute en reactivatie modellen), worden de muizen voor het screenen van het niveau van menselijke cellen engraftment door flow cytometrie. Een representatieve strategie voor de evaluatie van 1) humane CD45+ cellen reconstitutie en 2) percentage van de CD4+ -en CD8+ T-cellen wordt weergegeven in Figuur 1A. Meestal varieert het niveau van en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Belangrijke vooruitgang is bereikt in de ontwikkeling van immunodeficiënte muizenstammen voor de humanisering, met een aantal verschillende opties die kunnen worden gebruikt in overeenstemming met het onderzoek belang1. Hier is een algemeen protocol voor de humanisering van NS γ-ketennulmuizen en genetisch vergelijkbare stammen die moeten worden gebruikt in drie verschillende modellen voor het BESTUDEREN van HIV-infecties. In de eerste experimentele benadering worden bestraalde pasgebor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door interne fondsen van de IHV Clinical Division aan JCZ.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3745.S.X
10 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0010
15 ml conical tubesStellar scientificT15-600
25 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0025
5 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0005
50 ml conical tubesStellar scientificT50-600
ACK lysis bufferQuality biological118-156-101
Alcohol prep padsFisher scientific06-669-62Steriel
Anti-Human CD3 clone UCHT1Biolegend300439APC geconjugeerd
Anti-Human CD4 clone OKT4Biolegend317420AF488 geconjugeerd
Anti-Human CD45 clone 2D1Biolegend368522BV421 geconjugeerd
Anti-Human CD8 clone SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 geconjugeerd
Biosafaty cabinet level 2Indien mogelijk aangesloten op een afvoer schoorsteen bij het hanteren van Isoflurane
BonnetFisher scientific17-100-900Kap voor eenmalig gebruik voor basisbescherming
CavicideMetrex13-1000Oppervlakte desinfectant
CD34+ cellsLonza2C-101Zoveel mogelijk flessen beschikbaar van een enkele donor
CentrifugeBeckman65-6KR
Clear jarAmazon77977
Cotton gauze padFisher scientific22-415-468Steriel
Disposable lab coatsFisher scientific19-472-422
EDTA micro tubesGreiner bio-one450480
Face MaskFisher scientific17-100-897
FACS lysing solutionBD340202
FBS premium HIAtlanta biologicalsS1115OH
FicollGE health one17-1440-02
Flow cytometerWe gebruikten FACS Aria II
Flow cytometry tubesFalcon3520545 ml polystyreen en ronde bodem
HIV BaLBereid in onze uQUANT core faciliteit
Human PBMCsHIV positieve en negatieve vrijwilligers
Infrared warming padVenet scientificDCT-25Tijdelijke therapeutische opwarmende pad voor kleine dieren
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061Antiretrovirale medicatie voor de behandeling van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) - Integrase-remmer
IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I irradiatorApparatuur van de Universiteit van Maryland
Micro pipettes
MicrocentrifugeEppendorf
Mouse ear tagsNational Band & Tag company1005-1L1
Natelson blood collection tubesFisher scientific02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
NSG miceJackson5557Tijd zwangere vrouwtjes voor CD34 engraftment en Juvenielen voor PBMCs engraftment
NSG-SGM3Jackson13062
Paraformaldehyde 16%Electron microscopy sciences15710
PBS 1X pH 7.4Gibco100-10-023
Petri dishesFisher scientific08-757-28
Quantistudio qPCR machineThermoQS3
Reagent reservoirsCostar4870
RPMI media 1640 1XGibco11875-093
Shoe coversFisher scientific17-100-911
Sterile disposable GlovesMicroflexSUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMixInvitrogen10080-400cDNA-synthese
Syringes 28-G x 1/2BD329-461
Syringes 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabine and TenofovirGileadNDC 61958-0701-1Antiretrovirale medicatie voor de behandeling van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) - Nicleoside analog-transcriptase-remmer
Trypan blueSigmaT8154Celtelling en levensvatbaarheid
Vick VaporubSchool health43214Zalf op basis van menthol en eucalyptus
Water molecular biology gradeQuality biological351-029-131

Referenties

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118(2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280(2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Gehumaniseerde immunodefici nte muizenHIV infectiemodellenchronisch HIV modelacuut HIV modelreactivatie HIV modelCD34 stamcellenmononucleaire cellen uit perifeer bloedflowcytometrieintraperitoneale injectieintrahepatische injectie
Chronische, acute en Gereactiveerde HIV-infectie in gehumaniseerde Immunodeficiënte Muismodellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.