Pneumococcus-infectie van primaire humane endotheliale cellen in constante stroming

Samenvatting

Deze studie beschrijft de microscopische monitoring van pneumococcus hechting aan Von Willebrand factor snaren geproduceerd op het oppervlak van gedifferentieerde menselijke primaire endotheliale cellen onder shear stress in gedefinieerde stromingsomstandigheden. Dit protocol kan worden uitgebreid naar gedetailleerde visualisatie van specifieke celstructuren en kwantificering van bacteriën door differentiële immunokleurings procedures toe te passen.

Samenvatting

Interactie van Streptococcus pneumoniae met het oppervlak van endotheel cellen wordt gemedieerd in de bloedstroom via mechanosensitieve eiwitten zoals de Von Willebrand factor (vwf). Deze glycoproteïne verandert de moleculaire conformatie in reactie op shear stress, waardoor binding sites bloot voor een breed spectrum van gastheer-ligand interacties. In het algemeen is het kweken van primaire endotheel cellen onder een gedefinieerde schuif stroom bekend om de specifieke celdifferentiatie te bevorderen en de vorming van een stabiele en strak gekoppelde endotheellaag die lijkt op de Fysiologie van de binnenbekleding van een bloedvat . Zo vereist de functionele analyse van interacties tussen bacteriële pathogenen en de gastheer-vasculatuur met mechanogevoelige eiwitten de oprichting van pompsystemen die de fysiologische stroom krachten kunnen simuleren die bekend zijn om het oppervlak van vasculaire cellen.

Het microfluïdische apparaat dat in deze studie wordt gebruikt, maakt een continue en pulseloze recirculatie van vloeistoffen met een gedefinieerde stroomsnelheid mogelijk. Het computergestuurde luchtdruk pompsysteem past een gedefinieerde shear stress op endotheliale celoppervlakken toe door een continue, unidirectionele en gecontroleerde gemiddelde stroom te genereren. Morfologische veranderingen van de cellen en bacteriële gehechtheid kunnen microscopisch worden bewaakt en gekwantificeerd in de stroom door gebruik te maken van speciale kanaal dia's die zijn ontworpen voor microscopische visualisatie. In tegenstelling tot statische celkweek infectie, die in het algemeen een monster fixatie vereist voorafgaand aan immuun labeling en microscopische analyses, maken de microfluïdische dia's zowel de fluorescentie-gebaseerde detectie van eiwitten, bacteriën en cellulaire componenten mogelijk na monster fixatie; seriële immunofluorescentie kleuring; en directe fluorescentiedetectie in real-time. In combinatie met fluorescerende bacteriën en specifieke fluorescentie-gelabelde antilichamen, deze infectie procedure biedt een efficiënte meervoudige component visualisatie systeem voor een groot spectrum van wetenschappelijke toepassingen met betrekking tot vasculaire processen.

Inleiding

De pathogenese van pneumococcus-infecties wordt gekenmerkt door een veelzijdige interactie met een diversiteit aan extracellulaire matrix verbindingen en componenten van de menselijke hemostase, zoals plasminogeen envwf^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. De multi Domain glycoproteïne VWF fungeert als een belangrijke regulator van een evenwichtige hemostase door middel van bemiddeling van trombocyten werving en fibrinincorporatie op de plaats van vasculaire trombus formatie⁹. Het belang van functionele, actieve VWF voor bloedings beheersing en wondgenezing wordt aangetoond door de ziekte van Von Willebrand, een veelvoorkomend erfelijke bloedingsstoornis¹⁰.

Bolvormige vwf circuleert in het humaan bloedsysteem bij een concentratie van maximaal 14,0 μg/ml^11,10. Als reactie op vasculaire letsels is de lokale afgifte van vwf door endotheliale Weibel Palade Bodies (WBP) aanzienlijk toegenomen^11,12. Eerdere studies tonen aan dat de hechting van pneumococcus aan humane endotheelcellen en de productie van de Pore vormende toxine pneumolysine de Luminale VWF secretie¹³aanzienlijk stimuleert. De hydrodynamische krachten van de bloedstroom induceren een structurele opening van de mechanoresponsive VWF domeinen. Bij stroomsnelheden van 10 dyn/cm² de vwf multimerizes tot lange eiwit snaren tot enkele honderden micrometers in lengte die blijven gehecht aan het subendothelium^10,12.

Om te begrijpen van de functie van multimerized VWF snaren gegenereerd onder shear stress in de interactie van pneumococcus met het endotheliale oppervlak, een microfluidic gebaseerde cel cultuur infectie aanpak werd vastgesteld. Een microfluïdisch apparaat met een software-gestuurde luchtdruk pompsysteem werd gebruikt. Hierdoor kon een continue, unidirectionele recirculatie van het celkweekmedium met een gedefinieerde stroomsnelheid worden ingeschakeld. Daardoor paste het systeem een gedefinieerde shear stress op het oppervlak van endotheliale cellen, die bleef bevestigd in gespecialiseerde kanaal dia's. Deze aanpak stelde de simulatie van de dwarskracht binnen de bloedstroom van het menselijke vasculaire systeem, waarbij VWF snaren worden gegenereerd op gedifferentieerde endotheliale cellen onder gedefinieerde constante stroom omstandigheden. Voor dit doel werden de endotheelcellen gekweekt in specifieke kanaal glaasjes (Zie tabel van materialen), die tijdens de stroming werden aangepast voor microscopische analyses. Het microfluïdische pompsysteem voorzag in de sterk gedefinieerde en gecontroleerde shear stresssituatie die nodig was voor de vorming van verlengde VWF snaren op de confluente endotheliale cellaag. Na de stimulatie van VWF-afscheiding van de door de mens geteelde humane navelstreng endotheliale cellen (HUVEC) door histamine suppletie, werd de snaar vorming geïnduceerd door het aanbrengen van een shear stress (ԏ) van 10 dyn/cm². De shear stress wordt gedefinieerd als de kracht die op de cellaag optreedt. Het wordt ongeveer berekend volgens Cornish et. al.¹⁴ met vergelijking 1:

Waarbij ԏ = afschuif spanning in dyn/cm², η = viscositeit in (DYN ∙ s)/cm², h = helft van de kanaal hoogte, w = de helft van de kanaal breedte en Φ = debiet in ml/min.

Het resultaat van vergelijking 1 is afhankelijk van de verschillende hoogtes en breedten van de verschillende gebruikte dia's (Zie tabel met materialen). In deze studie werd een Luer-kanaal glijbaan van 0,4 μm gebruikt, resulterend in een kamer glijbaan factor van 131,6 (zie formule 2).

Viscositeit van het medium bij 37 °C is 0,0072 dyn ∙ s/cm ² en een shear stress van 10 dyn/cm ² werd gebruikt. Dit resulteerde in een debiet van 10,5 mL/min (Zie Formule 3).

Hier wordt de aanpassing en vooruitgang van een microfluïdische celculturing procedure met behulp van een unidirectioneel laminaire stroomsysteem voor het onderzoek en visualisatie van bacteriële infectiemechanismen in de gastheer-vasculatuur gedetailleerd beschreven. Het genereren van VWF-snaren op endotheliale lagen kan ook worden gestimuleerd door gebruik te maken van andere pompsystemen die in staat zijn om een continue en stabiele shear stress¹⁵toe te passen.

Na de teelt van primaire endotheelcellen tot samenvloeiing in stroming en stimulatie van VWF-snaar vorming, werden pneumokokken die rood fluorescentie-eiwit (RFP)¹⁶ uitdrukken, toegevoegd aan de endotheelcellaag onder constante microscopische controle. Het gehechtheid van bacteriën aan VWF-snaren op het oppervlak van endotheelcellen werd microscopisch gevisualiseerd en gedurende maximaal drie uur in real-time gemonitord door gebruik te maken van VWF-specifieke antilichamen met fluorescentie-label. Met deze aanpak werd de rol van VWF als adhesie cofactor voor het bevorderen van bacteriële gehechtheid aan het vasculaire endotheel bepaald⁸.

Naast de microscopische visualisatie van eiwit secretie en conformationele veranderingen, deze methode kan worden gebruikt voor het bewaken van enkele stappen van bacteriële infectie processen in real time en kwantificeren van de hoeveelheid bijgevoegde bacteriën op verschillende tijdstippen van Infectie. Het specifieke software-gestuurde pompsysteem biedt ook de mogelijkheid om de endotheelcellen in gedefinieerde constante stromingsomstandigheden gedurende maximaal enkele dagen te kweken en maakt een gedefinieerde gepulseerde-medium stroom incubatie mogelijk. Bovendien kan deze methode worden toegepast met behulp van verschillende celtypen. Het aanpassen van het kleurings protocol maakt ook de detectie en visualisatie van bacteriën geïnternationaliseerd in eukaryotische cellen mogelijk.

Dit manuscript beschrijft dit geavanceerde experimentele protocol, dat kan worden gebruikt als een gedefinieerde, betrouwbare en reproduceerbaar benadering voor een efficiënte en veelzijdige karakterisering van pathofysiologische processen.

Protocol

De microfluïdische celkweek werd uitgevoerd met commerciële primaire humane navelstreng endotheliale cellen (HUVEC). Het bedrijf isoleerde de cellen met geïnformeerde toestemming van de donor. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de kamer van de artsen van de federale staat Baden-Wuerttemberg met het referentienummer 219-04.

Opmerking: Zie tabel met materialen voor protocol benodigdheden.

1. preultivatie van primaire endotheel cellen

1. Ontdooi een bevroren glycerol flacon met 1 x 10⁵ primaire huvec van drie verschillende donoren zachtjes bij 37 °c en zaai de cellen in 7 ml voorverwarmde endotheliale celgroei medium (ecgm, klaar voor gebruik met supplementen) in een 25 cm² celkolf.
   Opmerking: De primaire endotheliale cellen verliezen differentiatie capaciteit na meer dan 5 proliferatie cycli. Daarom kunnen alleen cellen met minder dan 5 passages worden gebruikt als een hoge graad van celdifferentiatie vereist is.
2. Cultiveer de cellen bij 37 °C in 5% CO₂ -atmosfeer voor 60 min om oppervlakte bevestiging toe te staan en het ecgm-celcultuurmedium uit te wisselen om resten van cryoconservering kwijt te raken.
3. Ga door met het kweken van de cellen bij 37 °C in 5% CO₂ -atmosfeer totdat ze een subconfluente cellaag vormen.
   Opmerking: De HUVEC mag niet uitgroeien tot een confluente laag, omdat de nauwe celcelcontacten de vorming van een stabiele cellaag later in de stroming verhinderen.

2. preultivatie van Streptococcus pneumoniae

Let op: Streptococcus pneumoniae is een bioveiligheid niveau 2 agent en mag alleen worden gekweekt in bioveiligheid niveau 2 laboratoria. Gebruik een schone bank die is geclassificeerd voor veiligheidsniveau 2 voor alle bacteriële behandelingen, Vermijd strikt aërosolvorming en gebruik een centrifuge met aerosol bescherming voor sedimentatie van bacteriën.

1. Inoculeren een Columbia Blood agar Plate met een klinisch isolaat van Streptococcus pneumoniae ATCC11733 afgeleid van een glycerol kolf die constant bij-80 °c is opgeslagen en de agar-plaat 's nachts bij 37 °c en 5% Co₂cultiveren.
2. Bereid 40 mL Todd Hewitt Liquid Bouillon aangevuld met 1% gistextract (THY) en 15 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4, voor bacteriële teelt en wasstappen.
3. Gebruik een steriele buis voor bacteriële teelt en inoculeren van de vloeibare kweek bouillon met bacteriële massa. Controle van de hoeveelheid inoculatie door fotometrische meting van 1 mL aliquots bij 600 nm tegen niet-geënt vloeibare Bouillon als referentie. Vul de bacterie massa in de vloeibare Bouillon tot deze een optische dichtheid bereikt bij 600 nm (OD₆₀₀) van 0,15.
4. Incureren de geënt vloeibare Bouillon zonder te schudden bij 37 °C en 5% CO₂ en bepalen de OD₆₀₀ elke 30 minuten door het meten van 1 ml aliquots met behulp van plastic cuvettes.
5. Zodra de bacteriecultuur een OD₆₀₀ van 0,4 heeft bereikt, wat overeenkomt met de exponentiële groeifase, centrifugeer de bacteriële kweek suspensie gedurende 10 minuten bij 1.000 x g bij kamertemperatuur (RT).
   Opmerking: Sta niet toe dat een pneumococcus-cultuur een OD-₆₀₀ van meer dan 1,0 bereikt, omdat een hoge pneumococcus-cultuur dichtheid bekend is om bacteriële autolyse te veroorzaken, wat de algehele bacteriële geschiktheid kan beïnvloeden.
6. Rebreng het bacteriële sediment voorzichtig met 10 mL PBS en sediment opnieuw gedurende 10 minuten bij 1.000 x g bij RT.
7. Rebreng het gewassen bacteriële sediment voorzichtig in 1 mL PBS en bepaal de OD₆₀₀ van 10 μL van de bacteriële suspensie met 1 ml PBS als referentie.
8. Pas de hoeveelheid bacteriën in PBS aan op een OD₆₀₀ van 2,0. Volgens vroeger bepaalde bacteriële telling, een OD₆₀₀ van 2,0 komt overeen met 2 x 10⁹ kolonie vormende eenheden (CFU). Onmiddellijk doorgaan met de infectie procedure om bacteriële autolyse te voorkomen.

3. endotheliale celkweek van HUVEC onder Microfluïdische condities

1. Maak de primaire endotheel cellen los van de celkweek kolf door gecontroleerde proteolyse. Voer de volgende stappen uit in een steriele omgeving met een schone Bank. Bereid een volume van 15 mL steriele PBS voor de wasstappen.
   1. Verwijder de ECGM uit een subconfluently geteelde HUVEC-laag en was de cellaag met 10 mL PBS met behulp van een serologische pipet om van het celkweekmedium af te komen.
   2. Inbroed de gewassen HUVEC met 3 mL 37 °C voorverwarmde celdissociatie oplossing voor celloslating gedurende 5 min bij 37 °C. Observeer de Proteolytische celloslating door microscopisch toezicht per minuut.
   3. Pipetteer de losgekoppelde celsuspensie in een buisje met 7 mL ECGM aangevuld met 2% foetaal kalf serum (FCS) voor het stoppen van de proteolyse en sediment de cellen gedurende 3 minuten bij 220 x g bij RT.
   4. Verwijder de supernatant en rebreng de HUVEC in 250 μL ECGM aangevuld met 5% FCS en 1 mM MgSO₄. Gebruik 10 μL celsuspensie voor het tellen van cellen met behulp van de celtelkamer van Neubauer en stel het aantal cellen in op 4 x 10⁶ celwaarden/ml ecgm aangevuld met 5% FCS en 1 mm MgSO₄.
      Opmerking: Voor elk flow experiment is 30 mL ECGM medium aangevuld met 5% FCS en met 1 mM MgSO₄ vereist. Vanaf hier op deze medium samenstelling heet ECGMS-medium. De toename van de FCS-concentratie in het kweekmedium van 2% tot 5% ondersteunt de celhechting en de levensvatbaarheid van de cellen van HUVEC in de kanaal glijbaan. De medium supplementen FCS en MgSO₄ stabiliseren de celgehechtheid van huvec onder afschuif spanning aanzienlijk.
2. Zaai en cultiveer de HUVEC in een kanaal glijbaan. Werk in een steriele omgeving met een schone Bank. De cellen zullen worden gekweekt onder shear stress voor 2 dagen gevolgd door infectie met bacteriën en microscopische monitoring voor nog eens 2 h.
   1. Een kanaal glijbaan, een perfusie-set van 1,6 mm in diameter en 50 cm in lengte, een aliquot van het ECGMS-medium en een Luer-kanaal van 0,4 μm in hoogte, voor 24 uur in een incubator met 5% CO₂ -atmosfeer bij 37 °c om het aantal luchtbellen te verminderen.
      Opmerking: Deze procedure wordt aanbevolen om de plastic apparatuur te degassen en om het medium, de perfusie buizen en de reservoirs vooraf te verwarmen. Als er materialen of vloeistoffen bij RT of in de koelkast zijn opgeslagen, worden de gassen die in de kunststof zijn opgelost en vloeistoffen tijdens het experiment opgewarmd in de incubator vrijgegeven. Er zullen dan gasbellen verschijnen. Het ontgassen van alle kunststof componenten vóór het experiment zal dit effect elimineren. Telkens wanneer het systeem uit de incubator wordt gehaald, begint het proces van gasabsorptie opnieuw. Werk daarom snel bij RT en laat de fluidic unit nooit langer buiten de incubator achter.
   2. Gebruik een pipet om 100 μL van een met 2% steriele gefilterde varkens gelatine oplossing in PBS-oplossing te injecteren in een van de reservoirs van een kanaal glijbaan met temperatuur evenwicht. Inbroed de gelatine-oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C en spoel het kanaal van de glijbaan met 1 mL PBS onder steriele omstandigheden af met een 1 mL Luer spuit.
   3. Plaats de Gelatin-gecoate kanaal glijbaan op een dun polystyreen of piepschuim plaat om te voorkomen dat een druppel in de schuif temperatuur. Voeg 100 μL van de 4 x 10⁶/ml huvec suspensie toe met een 1 ml Luer spuit in de glijbaan.
      Opmerking: Het plaatsen van de kanaal glijbaan op het koude metalen oppervlak van de schone Bank kan de temperatuur van de schuif bodem verminderen, waardoor koude stress ontstaat voor de endotheelcellen. Tijdens het pipetteren houdt u de dia een beetje omhoog om luchtbellen te laten stijgen en uit de dia te verdwijnen.
   4. Inbroed de kanaal glijbaan met de HUVEC voor 60 min bij 37 °C en 5% CO₂ en vul de middelgrote reservoirs aan beide uiteinden van de kanaal glijbaan met 60 ΜL ecgms-medium per stuk. Incuberen gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO₂.
3. Pas de microfluïdische pomp en de software-instellingen aan.
   1. Sluit de geëquilibreerd perfusie-set aan op de pompeenheid, vul met 13,6 ml ecgms-medium en start de pomp controle software. Selecteer de geschikte perfusie set en type kamer Slide met behulp van de scroll down Windows in het menu van de fluidic Unit ingesteld. Kies 0,007 (DYN ∙ s/cm²) in de software voor gemiddelde viscositeit. (Zie de druk pomp software-instellingen gemarkeerd met rode pijlen in aanvullende figuur 1).
   2. Sluit buiten de incubator een glazen fles aan die gevuld is met het drogen van silica kralen aan de luchtdruk slang (Zie Figuur 1, inset 3). De lucht van de druk pomp circuleert tussen de perfusie reservoirs en de pomp en moet droog zijn voordat het pomp apparaat opnieuw wordt ingevoerd. Selecteer stroom parameters in het menu software, stel de druk in op 40 mbar en spoel de pomp buizen met het vloeistof medium door de continue gemiddelde stroom te starten. (Deze instellingen worden ook aangeduid met rode pijlen in aanvullende figuur 1).
   3. Program meer de gewenste shear stress cycli van flow teelt. Begin met 5 dyn/cm², controle gebalanceerde reservoir pumpinng en verzeker dat er geen luchtbellen circuleren in het pompsysteem.
      Opmerking: De wand afschuif spanning in een kanaal glijbaan is afhankelijk van de stromingssnelheid en de viscositeit van het perfusie medium. Als u een ander pompsysteem gebruikt, raadpleeg dan de in de inleiding beschreven vergelijkingen om een debiet in te stellen dat het gewenste shear stressniveau genereert. De beschreven instellingen komen overeen met een debiet van 5,42 mL/min. (een voorbeeldscherm opname met de adequate stromings parameterinstellingen in de druk pomp software wordt weergegeven in aanvullende figuur 2).
   4. Stop de stromings circulatie in de pomp besturingssoftware en houd de gemiddelde stroom in de perfusie slang vast door de buizen in de buurt van de Luer-aansluitingen te klemmen. Verbind de kanaal glijbaan, Vermijd luchtbellen en plaats de wervelende eenheid met de aangesloten kanaal glijbaan in een CO₂ -incubator bij 37 °c en 5% Co₂. Start de shear stress bij 5 dyn/cm² gedurende 30 min om de cellen soepel aan te passen aan de krachten die door de shear stress worden gegenereerd voordat het afschuif stressniveau wordt versneld (Zie aanvullende figuur 3).
      Opmerking: Zorg dat er geen luchtbellen achterblijven in het buis systeem of in de glijbaan na connectinng naar het buis systeem omdat de beweging van luchtbellen in de stroom kan leiden tot celloslating.
   5. Versnel de shear stress tot 10 dyn/cm² (die overeenkomen met 10,86 ml/min in deze stroominstelling) en incueren de kanaal Slide in continue shear stress voor 48 h in een kleine co₂ -incubator bij 37 °C en 5% Co₂ om celdifferentiatie mogelijk te maken ( de respectievelijke software settinngs zijn aangegeven met rode pijlen in aanvullende figuur 4).
      Opmerking: HUVEC-cellen hebben de neiging om te ontkoppelen van het kanaal oppervlak als de stroom teelt direct wordt gestart bij 10 dyn/cm². De cellen blijven bevestigd aan het oppervlak van de kamer als de stroom teelt wordt gestart met minder shear stress met behulp van 5 dyn/cm² voor een minimum van 30 min gevolgd door het verhogen van de shear stress langzaam tot de gewenste 10 dyn/cm². Een shear stress van 10 dyn/cm² is de minimale waarde in deze perfusie-instelling die vereist is voor vwf-snaar vorming.
   6. Na 24 h van microfluïdische celteelt, stop de gemiddelde stroom met de pomp besturingssoftware precies wanneer een uitgebalanceerd medium niveau wordt bereikt in beide middelgrote reservoirs. Plaats de wervelende eenheid in een schone Bank en verwijder 10 mL van het gecirculeerde kweekmedium van de perfusie reservoirs met een serologische Pipet van 10 mL. Voeg 10 mL ECGMS-medium toe aan de reservoirs om het medium te vernieuwen, plaats de wervelende eenheid weer in de CO₂ -incubator bij 37 °c en 5% Co₂, en herstart de fluïdische teelt met behulp van de pomp controle software.
      Opmerking: De functie van de druk pomp kan plotseling worden verstoord door laboratorium machines zoals grote centrifuges, wat een sterke magnetische veld verstoring kan veroorzaken. Deze plotselinge verstoring kan leiden tot celloslating. Zorg dat dergelijke machines niet actief zijn in de buurt van de druk pomp tijdens het experiment.
   7. Begin met het voorverwarmen van de temperatuur incubatie kamer die de fase van de fluorescentiemicroscoop bedekt tot 37 °C voor een Evenwichts temperatuur van 24 uur vóór de microscopische visualisatie. Nadat de Microscoop is voorverwarmd, start u de Microscoop software besturing en past u de belangrijkste instellingen voor de fluorescentie microscopische controle aan door de juiste filterinstellingen te selecteren (540 nm/590 nm voor detectie van de RFP-expressie van bacteriën en 470 nm/515 nm voor de detectie van de emissie van fluoresceïne van de FITC-geconjugeerde vwf-specifieke antilichamen). Verwarm een extra verwarmingskamer voor incubatie van de fluïdische eenheid bij 37 °C.
      Opmerking: Tijdens de infectie analyses en microscopisch toezicht moet de temperatuur van de kanaal glijbaan en het circulerende medium niet substantieel afnemen, omdat dit koude stress op de cellen zou genereren. In het algemeen is de grootte van de temperatuur kamers die betrekking hebben op de Microscoop fase niet genoeg om de hele fluidic eenheid te bedekken. Daarom wordt het gebruik van een extra verwarmingskamer voorverwarmd tot 37 °C aanbevolen.
   8. Plaats voor microscopische visualisatie de fluidic-eenheid in de voorverwarmde verwarmingskamer van 37 °C en plaats de kanaal glijbaan op een fase van de voorverwarmde Microscoop 37 °C.
      Opmerking: Voor microscopische visualisatie moesten de fluïdische eenheid en de kanaal glijbaan uit de CO₂ -incubator worden verwijderd vanwege de beperkte lengte van de perfusie slang. Als infectie tijden en microscopische bewaking langer dan 180 minuten nodig zijn buiten de 5% CO₂ -atmosfeer voor pH-buffering, moet een pH-gebufferd medium worden gebruikt voor de microfluïdische teelt.
   9. Bedien de celmorfologie en de integriteit van de HUVEC-laag voorafgaand aan de injectie van histamine en bacteriën aan de stroom circulatie gedurende de tijd van het flow-experiment en na het voltooien van het flow-experiment met behulp van de heldere veld modus van de Microscoop.

4. inductie van VWF-release en visualisatie van Multimerized VWF-snaren

1. Onderhouden van de stroominstelling, omdat een shear stress van 10 dyn/cm² is vereist voor het activeren van de multimerization van vwf tot lange tekenreeksen tot 200 MDA. Induceren van de afgifte van VWF van endotheliale WPB door het injecteren van 136 μL van een 100 mM histamine voorraadoplossing in het ECGMS-medium dat in de perfusie slang circuleert met behulp van een injectie poort. De uiteindelijke concentratie van histamine in het stroom medium is 1 mM. Als er geen injectie poort beschikbaar is, kan de histamine ook worden toegevoegd door Pipetteer in het medium van de pomp reservoirs.
2. Voor immunofluorescentie detectie van multimerized VWF-snaren, stop de stroom wanneer een uitgebalanceerd medium niveau in de reservoirs wordt bereikt, en Injecteer 20 μg VWF-specifiek FITC-geconjugeerd antilichaam in een volume van 200 μL PBS (pH 7,4) in de circulerende 13,6 mL ECGMS-medium met behulp van een injectie poort. Als er geen injectie poort beschikbaar is, kan het antilichaam ook worden toegevoegd door Pipetteer in het medium van de pomp reservoirs. Dit resulteert in een uiteindelijke antilichaam concentratie van 1,3 μg/mL.
3. Voor microscopisch scannen van verschillende kijk velden in korte tijd, gebruikt u de fluorescentie-eenheid van de microscoop met een Xenon fluorescentie-apparaat met een vermogen van 30% en een epifluorescentie camera. Bewaak de vorm en morfologie van de HUVEC-laag met de heldere veld modus om representatieve cellen te selecteren die geschikt zijn voor de visualisatie van VWF-strings.
4. Voor visualisatie van groene fluorescerende VWF-snaren, selecteert u een 63x/1.40-olie doelstelling en een 470 nm-detectie filter in het fluorescentie-eenheids menu van de Microscoop software (LasX). Maak snapshots van Z-stacks van ten minste 50 representatieve veld weergaven, elk met ongeveer 10 morfologisch intacte HUVEC. Voor de kwantificering van de groene fluorescerende VWF-snaren op verschillende tijdstippen scant u verschillende kijk velden.

5. microscopische evaluatie van bacteriële gehechtheid aan VWF-strings in flow in real time

1. Kwantificeer de pneumokokken bevestiging aan de VWF-snaren die op HUVEC-celoppervlakken worden gegenereerd via immunofluorescentie detectie.
   1. Houd de stroom vast en Injecteer 1,35 x 10⁸ CFU/ml RFP-uitdrukken pneumokokken in een maximaal volume van 1 ml in het ecgms-medium met behulp van de injectie poort. U ook de bacteriën in het medium in het pompreservoir Pipetteer. Herstart de shear stress op 10 dyn/cm² om de bacteriën in het pompsysteem te laten circuleren.
   2. Selecteer een 63x-olie-immersie doelstelling voor de vergroting van de Microscoop en pas de fluorescentie filterinstellingen in de Microscoop software aan op het RFP-kanaal (540 nm-detectie filter) voor detectie van pneumokokken met RFP-expressie.
   3. Voor het kwantificeren van bacteriële gehechtheid aan de VWF-snaren, stop de stroom en maak snapshots van Z-stacks van ten minste 30 representatieve veld weergaven, elk met ongeveer 10 morfologisch intacte HUVEC, en Tel de hoeveelheid pneumokokken.
   4. Gebruik het ANOVA One-factoriële statistiek algoritme om de gegevens te evalueren, gevolgd door een post hoc tweezijdige ongepaarde Sample test voor gedetailleerde statistische vergelijking. De P-waarden van < 0,05 werden statistisch significant geacht.

6. microscopische evaluatie van bacteriële gehechtheid aan VWF-snaren na monster fixatie

1. Proef de fixatie voorafgaand aan immunofluorescentie kleuring.
   1. Stop de stroom, verwijder 10 mL ECGMS-medium uit de pomp reservoirs en voeg 10 mL PBS toe, aangevuld met 5% Paraformaldehyde (PFA). Laat de PFA-oplossing 10 minuten circuleren bij een shear stress van 10 dyn/cm².
   2. Koppel de kanaal glijbaan los van de pompeenheid.
2. Blokkeer niet-specifieke binding sites op het celoppervlak en voer immunodetectie van VWF-snaren en aangesloten bacteriën uit.
   1. Bereid 4 mL van een wasoplossing met 100 mM na₂co₃ (pH 9,2) aangevuld met 4% sucrose voor alle wasstappen. Bereid 1 mL van een blokkerende oplossing met 100 mM na₂co₃ (pH 9,2) aangevuld met 4% sucrose en 2% boviene serumalbumine (BSA) voor het blokkeren van niet-specifieke bindingsplaatsen.
   2. Was de PFA-incubated Channel Slide 3x met een 1 mL Luer spuit om 200 μL van de wasoplossing te injecteren en de glijbaan voor 120 min bij RT met 200 μL blokkerende oplossing te inbrotsen.
   3. Bereid 4 mL van een andere blokkerende oplossing met 100 mM na₂co₃, (pH 9,2) aangevuld met 4% SUCROSE en 0,5% BSA voor de verdunning van de antilichamen. Gebruik 200 μL van deze blokkerende oplossing om het pneumococcus-specifieke konijn antiserum 1:100 te verdunnen. Gebruik 200 μL van deze blokkerende oplossing om het VWF-specifieke muis antilichaam 1:50 te verdunnen om een VWF-specifieke antilichaam concentratie van 4 μg/mL te maken. Verdun het AlexaFluor488 geconjugeerde secundaire antilichaam van een 2 mg/mL stamoplossing 1:100 in 200 μL PBS (pH 7,4) om een eindconcentratie van 20 μg/mL te genereren.
      Opmerking: In de beschreven immunofluorescentie-instellingen leverde de detectie van antilichamen optimale resultaten op toen de antilichamen in de bovengenoemde alkalische carbonaat buffer werden verdund. Op basis van eerdere resultaten zijn de aanbevolen blokkerende oplossingen en de hoeveelheid antilichamen geschikt voor vele toepassingen. Verschillende experimenten kunnen echter individuele optimalisatie van de antilichaam combinatie, antilichaam concentratie, incubatietijd en de constitutie van de blokkerende buffer vereisen. Als alternatief kan een fosfaat-gebufferd systeem met een neutraal pH-bereik geschikt zijn of zelfs de voorkeur krijgen als incubatie buffer. In geval van zwakke fluorescentie signalen moet de concentratie van secundair antilichaam worden verhoogd. Als er te veel onbepaald fluorescentie achtergrondgeluid wordt gedetecteerd, moet de hoeveelheid blokkerende stoffen worden verhoogd.
   4. Voor VWF-immunofluorescentie kleuring, was de kanaal glijbaan met een 1 mL Luer injectiespuit door het injecteren van 200 μL van de wasoplossing 3x en inbroed de glijbaan met de 1:50 verdunde VWF-specifieke antilichamen gedurende 30 minuten bij RT. spoel daarna de kanaal Slide 3x met 200 μL van de wasoplossing en inbroed de glijbaan met de 1:100 verdunde AlexaFluor488-geconjugeerde muis-specifieke antilichamen gedurende 30 minuten bij RT. Was tenslotte de kanaal Slide 3x met 200 μL van de wasoplossing.
      Opmerking: De AlexaFluor-fluorohores zijn gevoelig voor bleken. Daarom moet de glijbaan worden beschermd door deze in een donkere kamer te houden tijdens de incubatie stappen met fluorophore-geconjugeerde antilichamen.
   5. Voor immunodetectie van de pneumokokken, inbroed de glijbaan met een 1:100 verdunde pneumococcus-specifieke konijn antilichaam gedurende 30 min bij RT. Daarna was de kanaal Slide 3x met 200 μL van de wasoplossing en inbroed de glijbaan met 1:100 verdund AlexaFluor568-geconjugeerd konijn-specifiek antilichaam gedurende 30 min bij RT. was de kanaal slede opnieuw 3x met 200 μL van de wasoplossing.
   6. Om de cellulaire actine cytoskelet met fluorescerende phalloidine vlekken, permeabilize de HUVEC door incubatie met 120 μL 0,1% Triton X-100 gedurende 5 min bij RT. was de kanaal glijbaan 3x met 200 μL van de wasoplossing en inbroed de glijbaan met 120 μL 1:1000 verdund AlexaFluor350-geconjugeerde phalloidine. Deze incubatie stap visualiseert het gepolymeriseerde actine cytoskelet en laat toe de celvorm en mogelijke door stress veroorzaakte morfologische veranderingen te bewaken.
   7. Was de kanaal glijbaan 3x met 200 μL van de wasoplossing. Was ten slotte de Slide 4x met 200 μL ddH₂O en visualiseer de groene FLUORESCERENDE vwf-snaren, de rode fluorescerende bacteriën en het blauwe fluorescerende actine cytoskelet met behulp van de juiste filterinstellingen op de fluorescentiemicroscoop.

Resultaten

Het kweken van primaire huvec in een constante unidirectionele stroom resulteert in de vorming van een confluente en strak verpakte cellaag die de generatie van cellulaire wpbs bevordert, gevuld met de mechanosensitive vwf^13,14. Dit protocol beschrijft het gebruik van een luchtdruk pomp-gebaseerd, pulseless recirculatiesysteem voor infectie analyse die vereist nabootsen van de shear stresssituatie in de menselijke bloedstroom.

Dit syst...

Discussie

De simulatie van bacteriële interactie met mechanosensitieve gastheer eiwitten zoals VWF vereist een perfbruikbare celcultuursysteem dat het genereren van een gedefinieerde, unidirectionele en continue stroom van vloeistoffen mogelijk maakt, waardoor betrouwbaar shear stress wordt gegenereerd . Verschillende microfluïdische pompsystemen zijn al beschreven. Een uitgebreid overzicht van Bergmann et al. vat de belangrijkste aspecten van verschillende twee-en driedimensionale celcultuurmodellen¹⁷samen...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL Luer-syringe	Fisher Scientific	10303002	met 1 mL volume voor gelatine injectie met behulp van de luer-verbinding van de slides
2 mL Luer-syringe	Sarstedt	9077136	Voor pieptting/injecteren van vloeistoffen in de luer verbindingen van de kanaalkamers
Accutase	eBioscience nu thermo fisher	00-4555-56	protease mix gebruikt voor het voorzichtig losmaken van endotheelcellen
AlexaFluor350-geconjugeerd Phalloidin	Abcam	ab176751	geen concentratie beschikbaar van de fabrikant, stock oplossing is voldoende voor 300 testen, bedrijf beveelt aan om 100 µL van een 1:1.000 verdunning te gebruiken, blauwe fluorescentie (DAPI-filterinstellingen)
AlexaFluor488-geconjugeerd geitenafkomstig anti-muis antilichaam	Thermo Fisher Scientific	A11001	stockconcentratie: 2 mg/mL voor immunokleuring van menselijk VWF in microfluïdische slide na PFA-fixatie, groene fluorescentie
AlexaFluor568-geconjugeerd geitenafkomstig anti-konijn-antilichaam	Thermo Fisher Scientific	A-11011	stockconcentratie: 2 mg/mL voor immunokleuring van pneumokokken in microfluïdische slide na pFA-fixatie, rode fluorescentie
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	complex bacteriecultuurmedium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	opgelost, voor bereiding van blokkeerbuffer
Celcultuurkolven met filter	TPP	90026	subcultiveren van HUVEC in niet-gecoate celcultuurkolven van 25 cm2 oppervlak
Centrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	bacteriën naar beneden centrifugeren (volumes van >2mL)
Centrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	eukaryote cellen naar beneden centrifugeren
Centrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 - Z 216 M	bacteriën naar beneden centrifugeren (volumes van minder dan 2 mL)
Chloramfenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	gebruikt in een concentratie van 0,2 mg/mL voor de teelt van pneumokokken getransformeerd met genetisch construct draagt rood fluorescent eiwit en chlooramfenicol resistentie cassette
Klem voor perfusieslang	ibidi	10821	voor het vasthouden van de vloeistof in de buis voordat de slide wordt aangesloten op het pompsysteem
CO2-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	incubatorgrootte is perfect aangepast aan de grootte van de vloeistofunit met aangesloten kanaalslide en werd gebruikt voor stroomteelt bij 37 °C en 5% CO2
CO2-Incubator	Sanyo	MCO-18 AIC	voor incubatie van bacteriën en cellen in een gedefinieerde atmosfeer bij 5% CO2 en 37 °C
Colombia bloedagar platen	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	agar-gebaseerd complex kwekerijmedium voor S. pneumoniae aangevuld met 7% schapenbloed
Computer	Dell	Latitude 3440	Computer met drukpomppsoftware
Confocale Laser Scanning Microscoop (CLSM)	Leica	DMi8	Een omgekeerde microscoop met een trap bedekt met een verwarmbare kamer en met een fluorescentie-eenheid uitgerust met een fluorescentiefilter, Xenon-lichtbron (SP8, DMi8) en DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 Megapixel)
Di Kaliumwaterstoffosfaat (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	gebruikt voor PBS-buffer
Droogmateriaal	Merck	101969	oranje silicabeadjes voor drogen gebruikt in een glazen fles met een slangadapter
ECGM supplement Mix	Promocell	C-39215	supplementmix voor ECGM -medium, vereist voor precultivering van endotheelcellen: 0,02 mL/mL foetaal kalfsserum, 0,004 mL/mL endotheelcelgroeisupplement, 0,1 ng/mL epidermale groeifactor, 1 ng/mL basische fibroblastgroeifactor, 90 µg/mL heparine, 1 µg/mL Hydrocortison
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM aangevuld met 5 % [w/w] FCS en 1 mM MgSO4 om celadhesie te verhogen
Endotheelcelgroeimedium (ECGM, klaar voor gebruik)	Promocell	C-22010	kwekerijmedium van HUVECs, al aangevuld met alle componenten van de supplementmix
Foetaal Kalfsserum (FCS)	biochrome nu Merck	S 0415	supplement voor celcultuur, gebruikt voor infectieanalyses
FITC-geconjugeerd geiten anti-menselijk VWF antilichaam	Abcam	ab8822	stockconcentratie: 10 mg/mL, voor immunodetectie van globulaire en gemultimeriseerde VWF in stroom
Vloeistofunit	ibidi	10903	vloeistofunit voor stroomteelt
Gelatine (varkens)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	voor voorcoating van het microkanaaloppervlak
Histamine dihydrochloride	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	voor inductie van VWF secretie uit endotheliale Weibel Palade-lichamen
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primaire endotheelcellen van gepoolde donor, geconserveerd in vloeibare stikstof
Humaan VWF-specifiek antilichaam afkomstig van muis (monoklonaal)	Santa Cruz	sc73268	stockconcentratie: 200 µg/mL voor immunokleuring van VWF in microfluïdische slide na PFA-fixatie
Injectiepoort	ibidi	10820	voor injectie van