Dit artikel beschrijft een methode voor het kweken en analyseren van glomerulaire pariëtale epitheelceluitgroeien van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Deze methode kan worden gebruikt om trajecten te bestuderen die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Glomerular Outgrowth als een Ex Vivo Assay om trajecten betrokken bij pariëtale epitheelcelactivering te analyseren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pariëtale epitheelcel (PEC) activering is een van de belangrijkste factoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling en progressie van glomerulosclerose. Remming van trajecten die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelactivering kan daarom een hulpmiddel zijn om de progressie van glomerulaire ziekten te verzachten. Dit artikel beschrijft een methode om te cultuur en analyseren pariëtale epitheelcel uitgroei van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Na het ontleden van geïsoleerde muizennieren wordt het weefsel gehakt en glomeruli geïsoleerd door te zeven. Ingekapselde glomeruli worden verzameld, en enkele glomeruli worden gekweekt voor 6 dagen tot glomerulaire uitgroei van pariëtale epitheelcellen te verkrijgen. Tijdens deze periode kunnen pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie worden geanalyseerd door het celgetal of het oppervlak van ontgroeiende cellen te bepalen. Deze test kan daarom worden gebruikt als een instrument om de effecten van een veranderde genexpressie bij transgene- of knock-outmuizen of de effecten van cultuuromstandigheden op pariëtale epitheelcelgroeikenmerken en signalering te bestuderen. Met behulp van deze methode kunnen belangrijke trajecten worden bestudeerd die betrokken zijn bij het proces van pariëtale epitheliale celactivering en bijgevolg bij glomerulosclerose.
Inleiding
Glomerulaire ziekten zijn een belangrijke groep nieraandoeningen en vormen een belangrijke oorzaak van nierziekten in het eindstadium (ESRD). Helaas zijn specifieke behandelingsopties beperkt en is progressie naar ESRD onvermijdelijk. Glomerulaire ziekten worden gedefinieerd door de aanwezigheid van glomerulair letsel en kunnen worden gegroepeerd bij ontstekings- en niet-ontstekingsziekten. Hoewel de eerste belediging anders is, hebben recente studies aangetoond dat een gemeenschappelijk cellulair mechanisme leidt tot glomerulaire epitheliale celhyperplasie en uiteindelijk tot glomerulosclerose bij alle glomerulaire ziekten, ongeacht de onderliggende oorzaak1,2,3,4.
Concreet werd aangetoond dat glomermerosclerotische laesies voornamelijk bestaan uit geactiveerde pariëtale epitheelcellen5,6. Onder fysiologische omstandigheden zijn pariëtale epitheelcellen platte rustige epitheliale cellen die de Bowman's capsule van de glomerulus belijnen. Echter, elke glomerulaire schade als gevolg van genetische mutaties (bijvoorbeeld podocyte specifieke of mitochondriale cytopathieën), ontsteking of hyperfiltratie (bijvoorbeeld veroorzaakt door verminderde niermassa, hypertensie, obesitas of diabetische mellitus) kan leiden tot de activering van pariëtale epitheelcellen. Geactiveerde pariëtale epitheelcellen vermenigvuldigen en deponeren extracellulaire matrix wat resulteert in de vorming van cellulaire halve maan of sclerotische laesies5,7,8. Progressie van deze processen resulteert in verlies van nierfunctie9. Daarom is pariëtale epitheelcelactivering een belangrijke factor in de ontwikkeling en progressie van glomerulosclerose bij zowel ontstekings- als niet-inflammatoire glomerulare ziekten1,2,3,4,10.
De moleculaire processen die pariëtale epitheelcelactivering bemiddelen zijn nog grotendeels onbekend. Recente studies tonen aan dat geactiveerde pariëtale epitheelcellen de novo express CD44, een receptor die belangrijk is voor de activering van verschillende trajecten die betrokken zijn bij cellulaire proliferatie en migratie. Bovendien bleek dat remming van CD44 pariëtale epitheelcelactivering remt en de progressie van halve maanvorming en glomermerorose in diermodellen van ontstekings- en niet-inflammatoire glomerrale ziekten11,12.
Aangezien pariëtale epitheelcelactivering een belangrijke speler is voor de ontwikkeling van glomerulosclerose en halve maanvorming, kan remming van deze cellen de progressie van glomerulaire ziekten vertragen. Opheldering van de moleculaire paden die pariëtale epitheelcelactivering stimuleren, kan leiden tot de ontwikkeling van specifieke therapeutische interventies die de vorming van de hyperplastische en glomerolosclerotische laesies bij glomerrale ziekte verzachten.
In experimentele diermodellen is het vaak moeilijk om bewijs te leveren voor een direct effect van een veranderde genexpressie (knock-outmodellen of transgene muismodellen) of medicamenteuze behandeling op de pariëtale epitheelcellen. Bij een conventionele knock-outmuis kunnen de waargenomen in vivo veranderingen worden verklaard door directe veranderingen in pariëtale epitheelcellen. Aangezien de genexpressie echter ook in andere celtypen binnen de muis wordt gewijzigd, kan men indirecte effecten die door andere celtypen worden bemiddeld, niet uitsluiten. De ontwikkeling van voorwaardelijke cre-lox muizen gedreven door promotors voornamelijk actief in pariëtale epitheelcellen heeft een oplossing in sommige gevallen13. Niettemin zijn voorwaardelijke transgene modellen complex en hoewel er meer voorwaardelijke lijnen beschikbaar komen, is er voor veel van de conventionele knock-out- of transgene muislijnen nog geen voorwaardelijk substituut.
Om de directe effecten op pariëtale epitheelcellen te bestuderen, heeft onze groep een ex vivo test ontwikkeld met behulp van enkele ingekapselde glomeruli geïsoleerd van muizennieren om pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie te meten en te analyseren. Deze methode zal ons in staat stellen om pariëtale epitheelcelspecifieke effecten te bepalen en verantwoordelijke trajecten te vinden voor pariëtale epitheelcelactivering en testbehandelingsopties om deze activering te remmen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Commissie Dierethiek van de Radboud Universiteit Nijmegen.
OPMERKING: Onbehandelde, gezonde wilde type (WT) muizen (n = 4) en cd44-/- (n = 4) muizen werden geofferd op de leeftijd van 12−16 weken. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden gebruikt. Alle muizen waren op de C57Bl/6 achtergrond.
1. Muis nierdissectie
- Offer gezonde WT muizen of genetisch veranderde muizen door cervicale dislocatie.
- Ontleden hele muis nieren direct na het offeren van de muizen. Hiervoor voert u een mediane laparotomie uit met een buikschaar, het snijden van de huid en vervolgens de buikspieren. Verwijder de darm en plaats deze naast de muis.
- Bevrijd de nieren van het aansluiten van weefsel en trek de nier met behulp van chirurgische tangen, het snijden van de nierslagader, nierader en ureter met een schaar.
- Verwijder de niercapsules uit de nieren door de nier vast te houden met chirurgische tangen en trek de capsule af met behulp van een ander paar tangen.
- Plaats de nieren in een 6-well cell cultuur plaat (2 nieren / goed) bereid met 2 mL van hanks ' evenwichtige zoutoplossing (HBSS) per goed en plaats op ijs.
2. Isolatie van glomeruli van de muizennier
- Breng de nieren over op een petrischaal van 100 mm en hak de nieren in kleine stukjes van 1−2 mm met behulp van twee scalpels. Houd de gehakte nierstukken nat met behulp van 1−2 mL HBSS.
- Plaats de gehakte nierstukken bovenop een 300 μm metalen zeef en druk de nier door de zeef met behulp van een zuiger van een spuit van 20 mL. Spoel de zeef herhaaldelijk met HBSS ertussen en verzamel de flow-through in een schone petrischaal met behulp van een serologische pipet. Verzamel ook alles wat overblijft / kleeft aan de onderkant van de zeef door het af te schrapen met de scalpel en breng het over naar de verzamelde flow-through (nierhomogenaat).
- Spoel het nierhomogenaat door een 75 μm zeef met HBSS. Verzamel de doorstroom en spoel deze flow-through vervolgens door een zeef van 53 μm. Was beide zeven met HBSS om alle kleinere structuren te verwijderen.
LET OP: In deze stap wordt de stroom-al alleen gespoeld, maar niet geperst door de 75 μm en 53 μm zeef. Wassen met HBSS is noodzakelijk om puin en kleinere structuren op de zeven te verwijderen. Daarom wordt normaal gesproken 200−300 mL HBSS gebruikt. - Verzamel de nierstructuren/het materiaal dat op de zeef van 75 μm en 53 μm achterblijft door het bovenste oppervlak van de zeven te wassen met Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 20% foetaal kalfsserum (FCS) en breng het materiaal over in een 6-well ultra-low attachment microplate.
OPMERKING: Om het bovenste oppervlak van de zeef te wassen, spoelt u de zeef in een gekantelde positie (>45°) en verzamelt u het niermateriaal aan de rand van de zeef. Het verzamelde materiaal is verrijkt voor ingekapselde en gedecapsuleerde glomeruli, met slechts een paar buisvormige fragmenten. Ingekapselde glomeruli zijn erg plakkerig. Om enkele glomeruli te verzamelen, is het daarom belangrijk om te voorkomen dat glomeruli zich aan het oppervlak van een petrischaal of putplaat hechten. Om hechting te voorkomen, gebruik medium met 20% FCS en gebruik ultra-lage bevestigingsplaten voor deze stap.
3. Culturing van glomerulaire uitgroei
- Breng de ultralaage bevestigingsmicroplate naar een omgekeerde lichtmicroscoop en verzamel enkele ingekapselde en/of gedecapsuleerde glomeruli met een pipet van 20 μL. Vermijd het pipetteren van andere structuren en puin. Na het verzamelen van een enkele glomerulus in de pipetpunt, voeg vers DMEM-medium zonder verzameld niermateriaal toe in dezelfde pipetpunt tot een volume van 20 μL.
- Breng de enkele glomerulus met het 20 μL DMEM-medium over naar het midden van een put van een 24-bron celkweekplaat en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C en 5% (v/v) CO2 om gehechtheid van de glomerulus aan het midden van de put mogelijk te maken. Beweeg de plaat voorzichtig om te voorkomen dat de glomerulus naar de boorden van de put zweeft.
- Na 3 uur incubatie is de glomerulus bevestigd aan het midden van de put. Voeg voorzichtig 500 μL endotheel basaal medium (EBM) toe, aangevuld met een groeifactorkit met hydrocortison, menselijke endotheelgroeifactor, runderhersenextract en gentamicine sulfaat-amphotericine B (Tabel van materialen)en nog eens 5% (v/v) FBS en 1% (v/v) penicilline/strep (pen/strep) voor elke put.
- Kweek de enkele glomeruli gedurende 6 dagen bij 37 °C, 5% (v/v) CO2.
OPMERKING: Binnen 6 dagen wordt de uitgroei bestaande uit pariëtale epitheelcellen gevormd. Als men ernaar streeft om de effecten van specifieke verbindingen of geneesmiddelen op de pariëtale epitheelcellen te testen, moet het binnen deze periode van zes dagen aan het medium worden toegevoegd.
4. Analyse van pariëtale epitheelcelproliferatie
- Analyseer de glomerulaire uitgroei na 6 dagen. Maak microscopische beelden met behulp van een digitale omgekeerde lichtmicroscoop.
- Gebruik een beeldanalysesoftware (bijvoorbeeld ImageJ/FIJI) om het oppervlak en de diameter van de glomerular uitgroei te bepalen, en het aantal ontgroeiende cellen of ontgroeiende glomeruli.
- Open de tif om het oppervlak van de glomerulaire uitgroei te bepalen. bestand van de glomerular uitgroei met schaalbalk in ImageJ. Teken een rechte lijn op de schaalbalk en bepaal de afstand in pixels door op analyseren te klikken en te meten (bijvoorbeeld 1 mm = 460 pixel).
- Bepaal de schaal door op analyserente klikken, schaal in te stellen en de bekende afstand in pixel te typen (bijvoorbeeld 460), typ ook de bekende afstand (bijvoorbeeld 1) en de lengte-eenheid (bijvoorbeeld 1 mm). Klik op ok.
- Bepaal welke resultaten in de resultatentabel worden weergegeven door op analyseren te klikken en vervolgens metingen in te stellen. Activeer het optiegebied en het weergavelabel om de oppervlakte van de glomerulaire uitgroei te bepalen. Klik op ok.
- Om de oppervlakte van de glomerulaire uitgroei te bepalen, trek een vrije hand selectie rond de glomerulaire uitgroei. Klik op analyseren en meet vervolgens, er verschijnt een resultaattabel in ImageJ met het oppervlak van uitgroei in de eerder bepaalde schaal (zie stap 4.4, bijvoorbeeld mm2).
5. Karakterisering van de glomerulaire celuitgroei
OPMERKING: Om de cellulaire samenstelling van de uitgroei te beoordelen, worden immunofluorescentievlekken voor celspecifieke markers uitgevoerd op de glomerulaire uitwassen bij t = 6 dagen.
- Verwijder het medium voorzichtig en was de glomeruli twee maal voorzichtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Fixeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met 2% (w/v) paraformaldehyde (PFA) aangevuld met 4% (w/v) sacharose in PBS en zorgvuldig wassen 2x met PBS.
- Incubeer met het primaire antilichaam met de juiste concentratie(Tabel van materialen) verdund in PBS-eiine serum albumine (BSA) 1% (v/v) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de antilichaamoplossing en was 3x voorzichtig met PBS.
- Incubeer met secundair antilichaam (Tabel van materialen) verdund in PBS-BSA 1% (v/v) in het donker gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Zorgvuldig wassen 3x met PBS en monteren met behulp van 1−2 druppels waterige montage medium met 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om kernen te visualiseren en de put te bedekken met een ronde cover slip.
- Neem microscopische beelden met behulp van een fluorescerende microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een systematisch diagram van de methode om de glomerulaire uitgroeitest uit te voeren wordt weergegeven in figuur 1. Figuur 2A-D toont glomerulaire uitwassen van ingekapselde glomeruli op verschillende tijdstippen zoals waargenomen met behulp van lichte microscopie. Uitwassen worden op dag 2, 4 en 6(figuur 2B-D)in de cultuur weergegeven na glomerulus isolatie van de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met behulp van het protocol beschreven in dit artikel, kan men gebruik maken van enkele ingekapselde glomeruli te evalueren pariëtale epitheelcelproliferatie die een gevolg is van pariëtale epitheelcel activering. Dit ex vivo model zal ons in staat stellen om in detail te bestuderen van de moleculaire trajecten, die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcel activering. De beschreven methode is gebaseerd op het eenvoudige concept van nierdissectie en zeven om glomeruli te isoleren en te kweken en te vergelijken en prolifer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door Dutch Kidney Foundation (subsidie 14A3D104) en NWO VIDI subsidie: 016.156.363).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelcel marker (gebruikte concentratie 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (gebruikte concentratie 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Montagemedium met DAPI | |
| Digitaal omgekeerde lichtmicroscoop | Westburg, EVOS fl microscoop | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (gebruikte concentratie 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (gebruikte concentratie 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | met hydrocortison, hEGF, GA-1000, FBS en BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescente microscoop | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (gebruikte concentratie 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petrischaal | Sarstedt | maat 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Pariëtale epitheliale celmarker (gebruikte concentratie 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | vriendelijk verstrekt door Dr. E. Gelman, Pariëtale epitheliale celmarker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Pariëtale epitheliale celmarker (gebruikte concentratie 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | maat 10 | |
| Zeefjes | Endecotts Ltd | maat 300 µm, 75 µm, 53 µm, staal | |
| syringe | BD Plastipak | maat: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-wells platen |
Referenties
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
