Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Samenvatting

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Samenvatting

Cel-vrije eiwitsynthese (CFPS) is een opkomende technologie in systemen en synthetische biologie voor de in vitro productie van eiwitten. Als CFP'S echter verder gaan dan het laboratorium en een wijdverspreide en standaard just-in-time productietechnologie worden, moeten we de prestatielimieten van deze systemen begrijpen. In de richting van deze vraag, ontwikkelden we een robuust protocol om te kwantificeren 40 verbindingen die betrokken zijn bij glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, energiemetabolisme en cofactor regeneratie in CFPS reacties. De methode maakt gebruik van interne normen gelabeld met ¹³c-aniline, terwijl verbindingen in het monster zijn guarderivaten met ¹²c-aniline. De interne normen en het monster werden gemengd en geanalyseerd met reversed-phase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC/MS). De co-elutie van verbindingen geëlimineerd ionen onderdrukking, waardoor de nauwkeurige kwantificering van metaboliet concentraties over 2-3 ordes van grootte, waar de gemiddelde correlatiecoëfficiënt 0,988 was. Vijf van de 40-verbindingen waren niet gelabeld met aniline, maar ze werden nog steeds gedetecteerd in het CFPS-monster en gekwantificeerd met een standaard curve methode. De chromatografische uitvoering duurt ongeveer 10 minuten om te voltooien. Samen hebben we een snelle, robuuste methode ontwikkeld voor het scheiden en nauwkeurig kwantificeren van 40-verbindingen die betrokken zijn bij CFP'S in één LC/MS-run. De methode is een uitgebreide en nauwkeurige benadering om het celvrije metabolisme te karakteriseren, zodat we uiteindelijk de opbrengst, productiviteit en energie-efficiëntie van cel-vrije systemen kunnen begrijpen en verbeteren.

Inleiding

Cel-vrije eiwitsynthese (CFPS) is een veelbelovend platform voor de vervaardiging van eiwitten en chemicaliën, een toepassing die traditioneel is gereserveerd voor levende cellen. Cel-vrije systemen zijn afgeleid van ruwe celextracten en elimineren de complicaties geassocieerd met celgroei¹. Bovendien biedt CFPS directe toegang tot metabolieten en de biosynthetische machines zonder interferentie van een celwand. Een fundamenteel begrip van de prestatiegrenzen van de cel-vrije processen ontbreekt echter. High-throughput methoden voor de kwantificering van metaboliet zijn waardevol voor de karakterisering van het metabolisme en zijn van cruciaal belang voor de bouw van metabole computationele modellen^2,3,4. Veelgebruikte methoden voor het bepalen van de metaboliet concentraties zijn nucleaire magnetische resonantie (NMR), Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FT-IR), enzym gebaseerde testen en massaspectrometrie (MS)^{5,6,7 ,8}. Echter, deze methoden worden vaak beperkt door hun onvermogen om efficiënt te meten van meerdere verbindingen tegelijk en vereisen vaak een steekproefgrootte groter is dan de typische cel-vrije reacties. Bijvoorbeeld, enzym gebaseerde assays kunnen vaak alleen worden gebruikt voor het kwantificeren van één samengestelde in een run, en zijn beperkt wanneer de grootte van het monster klein is, zoals in de cel-vrije eiwitsynthese Reacties (meestal uitgevoerd op een schaal van 10-15 μL). Ondertussen vereist NMR een grote overvloed aan metabolieten voor detectie en kwantificering⁵.  In de richting van deze tekortkomingen bieden chromatografie methoden in combinatie met massaspectrometrie (LC/MS) verschillende voordelen, waaronder hoge gevoeligheid en de mogelijkheid om meerdere soorten gelijktijdig te meten⁹; de analytische complexiteit neemt echter aanzienlijk toe met het aantal en de diversiteit van de soorten die worden gemeten. Het is daarom belangrijk om methoden te ontwikkelen die het hoge doorvoer potentieel van LC/MS-systemen volledig realiseren. Verbindingen in een monster worden gescheiden door vloeistofchromatografie en geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie. Het signaal van de verbinding hangt af van de concentratie en de ionisatie-efficiëntie, waarbij de ionisatie kan variëren tussen verbindingen en kan ook afhangen van de monstermatrix.

Het bereiken van dezelfde ionisatie-efficiëntie tussen het monster en de normen is een uitdaging bij het gebruik van LC/MS om analyten te kwantificeren. Verder wordt kwantificering uitdagender met de diversiteit van de metaboliet als gevolg van signaal splitsing en heterogeniteit in Proton affiniteit en polariteit¹⁰. Ten slotte kan de co-eluting-matrix van het monster ook invloed hebben op de ionisatie-efficiëntie van de verbindingen. Om deze problemen aan te pakken, kunnen metabolieten chemisch worden afgeleid, waardoor de scheidings resolutie en gevoeligheid door LC/MS-systemen worden vergroot, terwijl tegelijkertijd de signaal splitsing in sommige gevallen^10,11wordt verlaagd. Chemische derivatisatie werkt door specifieke functionele groepen van metabolieten te taggen om hun fysische eigenschappen zoals charge of hydrofobiciteit aan te passen om de ionisatie-efficiëntie te verhogen¹¹. Verschillende tagstoffen kunnen worden gebruikt om verschillende functionele groepen te targeten (bijv. amines, hydroxyls, fosfaten, carbonzuren, enz.). Aniline, een dergelijke derivatisatie-agent, richt zich op meerdere functionele groepen tegelijk, en voegt een hydrofobe component toe aan hydrofiele moleculen, waardoor hun scheidings resolutie en signaal¹²toenemen. Om het co-eluting-matrix-ionen onderdrukkings effect aan te pakken, ontwikkelden Yang en collega's een techniek op basis van groepsspecifieke interne standaard technologie (GSIST)-labeling waarbij normen zijn gelabeld met ¹³C aniline-isotopen en vermengd met het monster ^12,13. De metaboliet en de corresponderende interne standaard hebben dezelfde ionisatie-efficiëntie omdat ze co-elute, en hun intensiteit ratio kan worden gebruikt om de concentratie in het experimentele monster te kwantificeren.

In deze studie ontwikkelden we een protocol voor het opsporen en kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij de glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, het energiemetabolisme en de cofactor-regeneratie bij CFPS-reacties. De methode is gebaseerd op de GSIST-benadering, waarbij we ¹²c-aniline en ¹³c-aniline gebruikten om metabolieten te taggen, te detecteren en te kwantificeren met behulp van omgekeerde fase LC/MS. Het lineaire bereik van alle verbindingen omspannen 2-3 ordes van grootte met een gemiddelde correlatiecoëfficiënt van 0,988. Dus, de methode is een robuuste en nauwkeurige benadering van interrogaat cel-vrije metabolisme, en eventueel hele-celextracten.

Protocol

1. bereiding van reagentia voor aniline-tagging

1. Bereid een aniline oplossing van 6 M bij pH 4,5. Werk in een afzuigkap, combineer 550 μL aniline met 337,5 μL LCMS water en 112,5 μL van 12 M zoutzuur (HCl) in een centrifugebuis. Vortex goed en bewaren bij 4 °C.
   Opmerking: aniline kan gedurende 2 maanden bij 4 °C worden bewaard.
   Let op: aniline is zeer giftig en moet in een rook afzuigkap worden bewerkt. Zoutzuur is zeer corrosief
2. Bereid een aniline oplossing van 6 M ¹³C bij pH 4,5. Combineer 250 mg ¹³C₆-aniline met 132 μL water en 44 μl van 12 M HCl. Vortex goed en bewaren bij 4 °c.
3. Bereid 200 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) oplossing. Los 2 mg EDC op in 10 μL water voor elk monster dat moet worden gelabeld en Vortex goed.
   Opmerking: EDC oplossing moet worden bereid op dezelfde dag als de reactie. EDC fungeert als een katalysator voor de derivatisering van verbindingen met aniline¹².

2. voorbereiding van de normen

1. Maak afzonderlijke stamoplossingen van alle verbindingen opgelost in LC/MS-kwaliteit water (tabel 1).
2. Voorbereiding van de interne standaardvoorraad oplossing
   1. Combineer alle verbindingen met uitzondering van Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADP), flavine adenine dinucleotide (FAD), acetyl coenzym A (ACA) en glycerol 3-fosfaat (Gly3P), met de juiste volumes om Creëer een 2 mM stockoplossing van alle verbindingen.
3. Combineer NAD, NADP, FAD, ACA en Gly3P met de juiste volumes om een 2 mM stockoplossing te creëren.

3. bereiding van het monster (Figuur 1)

1. Quench en neerslaan van de eiwitten in een cel-vrije eiwitsynthese reactie door toevoeging van een gelijk volume ijskoude 100% ethanol aan de reactie. Centrifugeer het monster bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Breng de supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis.
   Opmerking: monsters kunnen op dit punt bij-80 °C worden bewaard en op een later tijdstip worden geanalyseerd

4. etiketteer reactie

1. Etiketterings monster met ¹²C-aniline oplossing
   1. Breng 6 μL monster over in een nieuwe centrifugebuis om het volume met water tot 50 μL te brengen.
      Opmerking: volume steekproefgrootte kan afhangen van de specifieke CFPS-reactie.
   2. Voeg 5 μL 200 mg/mL EDC-oplossing toe.
   3. Voeg 5 μL ¹²C-aniline oplossing toe.
      NB: de aniline oplossing wordt in twee fasen gescheiden. Meng goed voordat u de reactie toevoegt.
   4. Vortex de reactie met zacht schudden voor 2 uur bij kamertemperatuur.
   5. Verwijder na 2 uur de buisjes uit de shaker en voeg 1,5 μL Triethylamine (thee) toe aan de reactie in een rook afzuigkap.
      Opmerking: Triethylamine verhoogt de pH van de oplossing die de aniline-tagreactie stopt en de verbindingen stabiliseert.
      Let op: Triethylamine is giftig en veroorzaakt irritatie van de ogen en de luchtwegen.
   6. Centrifugeer bij 13.500 x g gedurende 3 min.
2. Labeling van interne standaarden met ¹³C-aniline oplossing
   1. Verdun de interne voorraadoplossing tot 80 μM met een eindvolume van 50 μL.
      Opmerking: de concentratie van interne normen kan worden aangepast aan de niveaus die dicht bij het experimentele monster liggen.
   2. Voeg 5 μL 200 mg/mL EDC-oplossing toe.
   3. Voeg 5 μL ¹³C-aniline oplossing toe.
   4. Vortex de reactie met zacht schudden voor 2 uur bij kamertemperatuur.
   5. Verwijder na 2 uur de buizen van de shaker en voeg 1,5 μL thee toe aan de reactie in een rook afzuigkap.
   6. Centrifugeer bij 13.500 x g gedurende 3 min.
3. Gelabelde interne standaard en gelabeld voorbeeld combineren
   1. Meng 25 μL ¹²c-aniline met het gelabelde monster met 25 μl ¹³c-aniline-standaard.
   2. Overbrengen naar een injectieflacon met automatische sampler en analyseren via de LC/MS-procedure.
4. Een standaard curve voor niet-gelabelde metabolieten maken
   1. Verdunde stamoplossing van niet-gelabelde metabolieten (NAD, NADP, FAD, ACA en Gly3P) tot de eindconcentraties van 320 μM, 80 μM, 20 μM en 5 μM met een volume van 50 μL.
   2. Voeg 5 μL 200 mg/mL EDC-oplossing toe.
   3. Voeg 5 μL ¹²C-aniline oplossing toe.
   4. Vortex de reactie met zacht schudden voor 2 uur bij kamertemperatuur.
   5. Verwijder na 2 uur de buizen van de shaker en voeg 1,5 μL thee toe aan de reactie in een rook afzuigkap.
   6. Centrifugeer bij 13.500 x g gedurende 3 min.
   7. Breng supernatant over naar een injectieflacon met automatische sampler en Analyseer deze met de LC/MS-procedure.
      Opmerking: de niet-gelabelde metabolieten volgen dezelfde procedure als het monster om de monstermatrix te repliceren om een vergelijkbare ionisatie-efficiëntie te behouden.

5. instelling van de LC/MS-procedure

1. Bereiding van oplosmiddelen
   1. Bereid 5 mM Tri-Butylamine (TBA) waterige oplossing aangepast aan pH 4,75 met azijnzuur.
      Opmerking: TBA in de mobiele fase helpt de analyten bereiken goede resolutie en scheiding¹⁴.
   2. Bereid 5 mM TBA in acetonitril (ACN).
   3. Bereid wasoplosmiddel met 5% water en 95% ACN.
   4. Bereid het reinigings solvent met 95% water en 5% ACN.
2. Instellen van MS-voorwaarden
   1. Stel de massaspectrometer in op de negatieve Ion-modus met een sonde temperatuur van 520 °C, negatieve capillaire spanning van-0,8 kV, positieve capillaire spanning van 0,8 kV, en stel de software in om gegevens te verzamelen op 5 punten/s.
   2. Stel geselecteerde Ion-opnames (SIR) in voor elke metaboliet met gespecificeerde kegel spanningen en massa-overlaad waarden (m/z). Zie tabel 1.
3. Het initialiseren van LC/MS volgens de instructies van de fabrikant
   1. Prime solvent lijnen in de solvent Manager gedurende 3 min.
   2. Prime Wash solvent (5% water, 95% ACN) en purge solvent (95% water, 5% ACN) gedurende 5 cycli gedurende 15 sec.
   3. Stel de Sample Manager in op 10 °C.
   4. Installeer een C18 (1,7 μm, 2,1 mm x 150mm) kolom en Initialiseer de kolom met 100% ACN bij 0,3 mL/min gedurende 10 min.
   5. Staat de kolom op 95% water en 5% ACN op 0,3 mL/min gedurende 10 minuten voorafgaand aan het introduceren van oplosmiddelen met buffers.
   6. Voorwaarde voor de kolom op 95% oplosmiddel A (5mM TBA waterige, pH 4,75) en 5% oplosmiddel B (5 mM TBA in ACN) bij 0,3 mL/min gedurende 10 min.
   7. Stel een verloop protocol in met de elutie beginnend bij 95% oplosmiddel A en 5% oplosmiddel B, verhoogd tot 70% oplosmiddel B in 10 min, verhoogd tot 100% oplosmiddel B in 2 minuten en gehouden bij 100% oplosmiddel B gedurende 3 min. terugkeren naar de initiële condities (95% oplosmiddel A , 5% oplosmiddel B) over 1 min en houd 9 min vast om de kolom opnieuw te evenwichts-
   8. Staat de kolom met het verloop Protocol 3 keer vóór eventuele injecties op de kolom.
4. Injecteren van monster en normen
   1. Injecteer 5 μL van het monster in de kolom en verkrijg de juiste m/z-ionen intensiteiten voor het ¹²C-aniline gelabelde monster.
   2. Injecteer nogmaals 5 μL van hetzelfde monster, maar deze keer verkrijgt u de m/z-intensiteiten voor de ¹³C-aniline-normen.
      Opmerking: ons LC/MS-systeem is niet in staat om zowel ¹²c-als ¹³c m/z-intensiteiten te verwerven op de gespecificeerde Sir time-Vensters, omdat het te veel gegevens is om te verwerven in het opgegeven tijdvenster. Daarom injecteren we hetzelfde monster twee keer.
   3. Injecteer niet-gelabelde metaboliet normen van de laagste concentratie tot het hoogste en noteer de juiste m/z-ionen intensiteiten.

6. kwantificering

1. Export methode maken
   1. In software voor gegevensverzameling selecteert u bestand ≫ nieuwe methode ≫ export methode.
   2. Geef een bestandsnaam op, bijvoorbeeld AnilineTagging_Date.
   3. Controleer het ASCII -bestand exporteren en kies een map waarin u het tekstbestand wilt exporteren.
   4. In rapport type, selecteer Samenvatting door alle.
   5. In scheidingstekens, voor kolom Selecteer a ,. Voor rijselecteert u [CR] [If].
   6. Selecteer in tabelde optie exporteren en vervolgens tabel bewerken om samplename, gebied, hoogte, bedrag en eenhedenop te nemen.
   7. Exportmethode opslaan.
2. Kwantificeren van metabolieten met interne standaarden met behulp van Data Acquisition software
   1. Klik onder het tabblad sample sets met de rechtermuisknop op de bijbehorende LC/MS run en selecteer View as > channels.
   2. Selecteer alle SIR kanalen voor de ¹³C-aniline interne normen van één injectie, klik met de rechtermuisknop en selecteer recensie.
   3. Als het venster indeling van kredietbrief verwerkingsmethode niet automatisch wordt weergegeven, gaat u naar de lay-out ≫ verwerkingsmethode weergeven.
   4. Ga in de indeling van de methode processingnaar het tabblad integratie en stel apextrack in als het algoritme.
   5. Ga naar het tabblad vloeiend maken en stel het type in op mean en het gladmakende niveau op 13.
      Opmerking: elk vloeiend niveau kan worden geselecteerd, zolang deze consistent is voor alle voorbeelden.
   6. Schakel MS 3D - verwerkinguit op het tabblad MS - kanaal .
   7. In het SIR Channel-venster integreer je elke piek, één kanaal per keer. Zodra een piek is geïntegreerd, gaat u naar opties ≫ vulling van resultaat en de details van de piek zullen worden ingevuld op de componenten tab. Wijzig de piek naam in de corresponderende samengestelde naam.
   8. Zodra alle SIR-kanalen zijn geëvalueerd, slaat u de verwerkingsmethode op en sluit u het venster.
   9. Selecteer alle SIR kanalen van de ¹³c-aniline en ¹²c-aniline Tagged sample, klik met de rechtermuisknop en selecteer proces.
   10. Schakel het selectievakje proces in, selecteer gespecificeerde verwerkingsmethode gebruikenen kies de verwerkingsmethode die u zojuist hebt opgeslagen. Vink ook het vakje exporteren aan, selecteer gebruik gespecificeerde exportmethode en kies de opgeslagen exportmethode die eerder is gemaakt. Klik op OK.
   11. Open het geëxporteerde tekstbestand met Excel en bereken de concentratie van het onbekende samengestelde met behulp van:
       
       waar C_{x, i} de concentratie is van het onbekende monster voor metaboliet i, a_{x, i} is het geïntegreerde gebied van de onbekende metaboliet i, een_{Std, i} is het geïntegreerde gebied van de interne standaard van metaboliet i, C_{Std, i} is de concentratie van de interne standaard van metaboliet i, en D is de verdunningsfactor.
3. Kwantificeren van niet-gelabelde metabolieten met standaard curve
   1. Klik onder het tabblad sample sets met de rechtermuisknop op de bijbehorende LC/MS run en selecteer View as > channels.
   2. Selecteer alle SIR channels voor de niet-gelabelde standaarden van één injectie, klik met de rechtermuisknop en selecteer recensie.
   3. Als het venster indeling van kredietbrief verwerkingsmethode niet automatisch wordt weergegeven, gaat u naar de lay-out ≫ verwerkingsmethode weergeven.
   4. Ga in de indeling van de methode processing naar het tabblad integratie en stel apextrack in als het algoritme.
   5. Ga naar het tabblad vloeiend maken en stel het type in op mean en het gladmakende niveau op 13.
      Opmerking: elk vloeiend niveau kan worden geselecteerd, zolang deze consistent is voor alle voorbeelden.
   6. Schakel MS 3D - verwerkinguit op het tabblad MS - kanaal .
   7. In het SIR Channel-venster integreer je elke piek, één kanaal per keer. Zodra een piek is geïntegreerd, gaat u naar opties ≫ vulling van resultaat en de details van de piek zullen worden ingevuld op de componenten tab. Wijzig de piek naam in de corresponderende samengestelde naam.
   8. Zodra alle SIR-kanalen zijn geëvalueerd, slaat u de verwerkingsmethode op en sluit u het venster.
   9. Klik onder het tabblad sample sets met de rechtermuisknop op de Voorbeeldset en selecteer voorbeeld wijzigen.
   10. Selecteer bedrag in het nieuwe venster.
   11. Selecteer kopiëren van proces methode en kies de proces methode die zojuist is opgeslagen.
   12. Voer de concentratie van elke metaboliet in voor elke injectieflacon en voer de eenheid in als < μM voor elk onderdeel (of de corresponderende eenheid) en selecteer OK.
   13. Selecteer de Voorbeeldset opnieuw, klik met de rechtermuisknop, Bekijk als ≫ kanalen.
   14. Selecteer alle SIR-kanalen van de niet-gelabelde metabolieten voor de standaarden, klik met de rechtermuisknop en selecteer proces.
   15. Vink het vakje proces aan en kies gespecificeerde verwerkingsmethode gebruiken. Selecteer de juiste verwerkingsmethode en klik op OK.
   16. Selecteer SIR channels voor alle niet-gelabelde metabolieten voor de samples, klik met de rechtermuisknop en selecteer proces.
   17. Schakel het selectievakje proces in, selecteer gespecificeerde verwerkingsmethode gebruiken en kies de verwerkingsmethode die zojuist is opgeslagen. Vink ook het vakje exporteren aan, selecteer gebruik gespecificeerde exportmethode en kies de opgeslagen exportmethode die eerder is gemaakt. Klik op OK.
   18. Kwantificeer de niet-gelabelde metabolieten met de standaard curve en exporteer de resultaten naar een tekstbestand naar de opgegeven map.

Resultaten

Als proof-of-concept gebruikten we het protocol om metabolieten te kwantificeren in een E. coli gebaseerd CFPS systeem dat groen fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukt.  De CFPS-reactie (14 μL) werd uitgeblust en gedeproteïniseerd met ethanol. De CFPS sample werd vervolgens getagd met ¹²c-aniline, terwijl de normen werden getagd met ¹³c-aniline. Het gelabelde monster en de normen werden vervolgens gecombineerd en geïnjecteerd in de LC/MS (Figuur 1). Het protoco...

Discussie

Cel-vrije systemen hebben geen celwand, dus er is directe toegang tot metabolieten en de biosynthetische machines zonder dat complexe monstervoorbereiding nodig is. Er is echter heel weinig werk verzet om grondige en robuuste protocollen te ontwikkelen voor het meten van de celvrije reactie systemen. In deze studie ontwikkelden we een snelle, robuuste methode om metabolieten te kwantificeren in celvrije reactie mengsels en mogelijk in hele celextracten. Individuele kwantificering van metabolieten in complexe mengsels, zo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
12C Aniline	Sigma-Aldrich	242284	Aniline 12C
13C labeled aniline	Sigma-Aldrich	485797	Aniline 13C6
3-Phosfoglycerinezuur	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
Azijnzuur	FisherScientific	AC222140010	ACE
Acetonitril, LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
Acetyl-coenzym A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Kolom	Waters	186002353	Kolom
Adenosinedifosfaat	Sigma-Aldrich	A2754	ADP
Adenosinemonofosfaat	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
Adenosinetrifosfaat	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
Alfoketoglutaarzuur	Sigma-Aldrich	K1128	aKG
Citraat	Sigma-Aldrich	251275	CIT
Cytidinedifosfaat	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
Cytidinemonofosfaat	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
Cytidinetrifosfaat	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
D-glyceraldehyde 3-fosfaat	Sigma-Aldrich	39705	GAP
Erythrose 4-fosfaat	Sigma-Aldrich	E0377	E4P
Ethanol	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge	FisherScientific		Centrifuge
Flavine adenine dinucleotide	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
Fructose 1,6-bisfosfaat	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
Fructose 6-fosfaat	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
Fumaarzuur	Sigma-Aldrich	F8509	FUM
Gluconaat 6-fosfaat	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
Glucose 6-fosfaat	Sigma-Aldrich	G7879	G6P
Glycerol 3-fosfaat	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
Guanosinedifosfaat	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
Guanosinemonofosfaat	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
Guanosinetrifosfaat	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Zoutzuur	Sigma-Aldrich	258148	HCl
Isocitraat	Sigma-Aldrich	I1252	ICIT
Lactaat	Sigma-Aldrich	L1750	LAC
Malaat	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit	ArborBiosciences	507024	Celvrije eiwitsynthese
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03449	EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide	Sigma-Aldrich	43410	NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat gereduceerd	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide gereduceerd	Sigma-Aldrich	N8129	NADH
Oxalacetaat	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
Fosfo-enolpyruviaat	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
Pyroazijnzuur	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
Ribose 5-fosfaat	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
Ribulose 5-fosfaat	CarboSynth	MR45852	RL5P
Sedoheptulose 7-fosfaat	CarboSynth	MS07457	S7P
Bernsteenzuur	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
Tributylamine	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Triethylamine	FisherScientific	O4884	TEA
Ultrapuur water	FisherScientific	10977-015	water
Uridinedifosfaat	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
Uridinemonofosfaat	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
Uridinetrifosfaat	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR Heavy Duty Vortex	VWR		Vortex
Water, LCMS	JT BAKER	9831-03	WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager	Waters		LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN	Waters		LCMS
Waters Acquity Qda detector	Waters		LCMS
Waters Empower 3	Waters		Software
Waters LCMS Total Recovery Vial	Waters	186000384c	LCMS Vial