Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

Samenvatting

Dit protocol legt uit hoe u bacteriële samples voorbereidt en monit voor Live driedimensionale beeldvorming en hoe u de driedimensionale vorm van E. coli van die beelden reconstrueren.

Samenvatting

De vorm van een bacterie is belangrijk voor de fysiologie. Veel aspecten van celfysiologie zoals celmotiliteit, predatie en biofilmproductie kunnen worden beïnvloed door celvorm. Bacteriële cellen zijn driedimensionale (3D) objecten, hoewel ze zelden als zodanig worden behandeld. De meeste microscopie-technieken resulteren in tweedimensionale (2D) beelden die leiden tot het verlies van gegevens met betrekking tot de werkelijke 3D-celvorm en lokalisatie van eiwitten. Bepaalde vorm parameters, zoals Gaussiaanse kromming (het product van de twee hoofdkrommingen), kunnen alleen in 3D worden gemeten omdat 2D-afbeeldingen niet beide hoofdkrommingen meten. Bovendien liggen niet alle cellen plat wanneer de montage en 2D-beeldvorming van gebogen cellen de vormen van deze cellen mogelijk niet nauwkeurig weergeeft. Het nauwkeurig meten van de eiwit lokalisatie in 3D kan helpen bij het bepalen van de ruimtelijke regulatie en functie van eiwitten. Er is een voorwaartse convolutie techniek ontwikkeld die de vervaging functie van de Microscoop gebruikt om 3D-celvormen te reconstrueren en om eiwitten nauwkeurig te lokaliseren. Hier wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden en monteren van samples voor Live-celbeeldvorming van bacteriën in 3D, zowel om een nauwkeurige celvorm te reconstrueren als om eiwitten te lokaliseren. De methode is gebaseerd op eenvoudige monstervoorbereiding, fluorescerende beeld verwerving en op MATLAB gebaseerde beeldverwerking. Veel hoogwaardige fluorescerende microscopen kunnen eenvoudig worden aangepast om deze metingen uit te voeren. Deze celreconstructies zijn computationeel intensief en de toegang tot high-throughput computationele bronnen wordt aanbevolen, hoewel niet noodzakelijk. Deze methode is met succes toegepast op meerdere bacteriële soorten en mutanten, fluorescerende beeldvormings modaliteiten en Microscoop fabrikanten.

Inleiding

Cellen van alle typen reguleren hun vormen voor specifieke functies. Bijvoorbeeld, neuronen zijn verschillend gevormd dan bloedcellen en hebben verschillende functies. Evenzo, bacteriële cellen komen in een verscheidenheid van vormen en maten, hoewel het doel van deze vormen niet altijd bekend^1,2. Daarom is het belangrijk dat de vorm van bacteriële cellen nauwkeurig wordt bepaald. De beschreven methode toont een eenvoudig geïmplementeerde manier om gegevens te verzamelen die geschikt zijn voor de 3D-analyse van de meeste levende of vaste bacteriële cellen.

De beschreven methode maakt het mogelijk om 3D-beelden van bacteriële cellen te nemen om de 3D-celvorm van het monster nauwkeurig weer te geven en om eiwitten binnen deze vormen nauwkeurig te lokaliseren. Traditionele microscopie-technieken nemen 2D-beelden, wat problematisch is bij het bestuderen van cellen die abnormale of niet-symmetrische vormen hebben, zoals mutanten van Escherichia coli, of gebogen bacteriën zoals Vibrio cholerae en Helicobacter pylori. Hoewel 3D-afbeeldingen met hoge resolutie de belangrijkste invoer zijn voor deze methode, geeft de methode geen resolutie-verbeterde afbeelding als resultaat. Deze methode reconstrueert eerder de 3D-oppervlak coördinaten en vorm van de cel met behulp van een voorwaartse convolutie-algoritme met behulp van actieve contouren en de schijnbare vervaging functie van de Microscoop³ (Figuur 1). Het is gebruikt voor het bestuderen van de bacteriële actine homo mreb in E. coli^4,5,6,7, de roman periskeletal element crva in V. cholerae⁸, en de vermoedelijke bactofilin CcmA in Helicobacter pylori⁹ (Figuur 2).

De lokalisatie van eiwitten kan inzicht geven in hun functies. Bijvoorbeeld, eiwitten die betrokken zijn bij celdeling zijn normaalgesproken gelokaliseerd op de midcell^10,11. Studies met hoge doorvoer zijn ondernomen om alle eiwitten van een bacterie te lokaliseren in de hoop om inzicht te krijgen in hun functies¹². Helaas zijn deze studies uitgevoerd met 2D-beeldvorming en 1D-of 2D-analyse, waardoor het onmogelijk is om specifieke aspecten van eiwit lokalisatie te meten, zoals lokalisatie naar cellulaire geometrische functies.

Bijvoorbeeld, mreb, een dynamisch eiwit nodig voor de staaf vorm van vele bacteriën, is veronderstelde om te werken door het leiden van de lokalisatie van de celwandsynthese, en de lokalisatie weerspiegelt de lokalisatie van de celwandsynthese^7,13. Mreb van meerdere soorten toont geometrische verrijking^4,6,7,14,15. Dynamische oppervlakte polymeren, zoals MreB, kunnen de geometrie van het oppervlak aan de tijd gemiddelde verrijkings profiel¹⁶ koppel en kunnen oriënteren op specifieke geometrieën door het minimaliseren van de energie die gepaard gaat met binding aan het membraan¹⁷. Hoewel het belang van Twisting, bundeling, buigen en dynamiek niet volledig is opgelost voor MreB, is het belangrijk om op te merken dat nauwkeurige metingen van beide hoofdkrommingen van een oppervlak een volledige 3D-representatie van de cel vereisen. Daarom, om de krommingen waarop eiwitten lokaliseren nauwkeurig te meten, is het preferentieel om 3D te gebruiken, in plaats van 2D-beeldvorming. 3D-beeldvorming elimineert de noodzaak om te berekenen die krommingen die niet kunnen worden gemeten in 2D, een schatting die mogelijk niet nauwkeurig in asymmetrische cellen¹⁸.

Hoewel 2D-beeldvorming van cellen sneller is en niet zoveel rekenwerk vereist, biedt 3D-beeldvorming een nauwkeurigere weergave van de cel, evenals de mogelijkheid om oppervlak functies te meten, zoals kromming, die niet in 2D kan worden gemeten. Daarom zal, naarmate 3D-beeldvorming meer gemeengoed wordt, nieuwe inzichten in celvorm en eiwit lokalisatie mogelijk worden.

Protocol

1. monstervoorbereiding

1. Maak E. coli tl-licht voorbeeld vorming door ze te instrueren om een cytoplasmisch TL-eiwit⁶ uit te drukken of een membraan kleurstof⁵te gebruiken. Andere bacteriële soorten kunnen worden gebruikt in plaats van E. coli.
   1. Transformeren cellen via electroporatie met een plasmide die codeert voor het cytoplasmatische mcherry fluorescerende eiwitten.
      Opmerking: Verschillende TL-eiwitten van andere kleuren kunnen worden gebruikt.
   2. Kweek de transformanten op een LB plaat met het juiste antibioticum bij 37 °C. Verkrijg enkele kolonies en Identificeer positieve klonen door microscopie. Antibiotica resistente kolonies die rood lijken onder de Microscoop bevatten het plasmide dat mCherry draagt.
2. Kweek 2 mL van de nachtelijke cultuur in LB vloeibare media met de juiste antibiotica bij 37 ° c in een schud incubator. Gebruik ofwel een kolonie van een plaat of een kleine hoeveelheid van een vrieskist als het entmateriaal.
   Opmerking: Gebruik de media die nodig zijn voor de bacteriecellen die voor het experiment zijn geselecteerd.
3. Subcultuur de nachtelijke cultuur 1:1000 in 5 mL verse LB media en laat de cellen groeien tot exponentiële fase bij 37 ° c in een schud incubator voor 3 − 4 h. meet de OD₆₀₀ van de cellen om te bevestigen dat ze zich in de exponentiële fase bevinden (d.w.z. , OD₆₀₀ = 0,2 − 0,4).
   Opmerking: De beeldvorming kan worden uitgevoerd in elke groeifase, afhankelijk van het experiment dat wordt uitgevoerd.

2. voorbereiding schuiven

Opmerking: Het is belangrijk om media te gebruiken die een lage auto fluorescentie hebben. Elk medium met een lage auto fluorescentie kan worden gebruikt. In dit experiment is 1% agarose M63 minimale media pads en afdichting met VaLaP¹⁹ vereist voorbeeld cellen in 3D.

1. Bereid een 1% oplossing van agarose in 20 mL minimale media.
   1. Magnetron de oplossing totdat de agarose volledig is opgelost en de oplossing duidelijk wordt weergegeven.
   2. Bewaar de oplossing in een waterbad van 60 °C tot het klaar is voor gebruik.
      Opmerking: Deze oplossing kan worden gestald en gesmolten indien nodig of kan worden uitgedrukt in kleinere hoeveelheden die zo nodig worden gesmolten. Na meerdere toepassingen kan de media worden verkleurd en moet worden vervangen.
2. Smelt VaLaP sealant op een hete plaat bij 80 − 100 °C.
   Opmerking: Bereid VaLaP, om te worden gebruikt als een Sealant, door het smelten van 50 g elk van Petroleum gelei, lanoline en paraffine samen in een bekerglas op een hete plaat bij 80 − 100 °C. Deze grote hoeveelheid VaLaP kan voor onbepaalde tijd op kamertemperatuur worden bewaard en is voldoende voor > 500 dia's. Verwarmen bij > 100 °C zal leiden tot degraderen en de kleur zal donkerder worden.
3. Plaats twee stapels van elk 3 20 mm x 20 mm afdekking aan de tegenoverliggende uiteinden van een glijbaan (zes totale afdek stroken).
4. Pipetteer 200 μL agarose pad-oplossing op de glijbaan.
   Opmerking: Als u geen engineered fluorescerende vlek gebruikt, kan vóór deze stap een membraan kleurstof aan de agarose pad-oplossing worden toegevoegd. Rebreng de kleurstof in water en voeg kleurstof toe aan 1 mL van de agarose pad-oplossing tot een eindconcentratie van 5 μg/mL.
5. Plaats onmiddellijk en stevig een tweede dia omlaag op de stapel afdek stroken om de agar af te vlakken en laat deze gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur stollen.
6. Schuif voorzichtig van de bovenste dia af.
7. Gebruik het grote uiteinde van een pipetpunt van 200 μL om individuele pads van de gel (~ 5 mm in diameter) op de glijbaan te knippen en gooi verkeerd ingedeelde of onnodige gel weg.
   Opmerking: Als Imaging meerdere stammen of voorwaarden, een aparte pad nodig voor elk een. Als er slechts één stam moet worden gefotografeerd, maak dan 3 − 4 pads om de dekslip te helpen ondersteunen.
8. Pipetteer cellen meerdere malen omhoog en omlaag om celklonters te verstoren en te zorgen dat de cultuurgoed gemengd is. Pipetteer 1 μL subcultuur van stap 1,3 op een pad.
   Opmerking: Celvorm reconstructies vereisen afzonderlijke cellen die geen andere cellen aanraken. Bij gebruik van stationaire fase-of hogeceldichtheids culturen kan het nodig zijn om het monster 1:10 te verdunnen voordat u het op de pad plaatst.
9. Laat de monster lucht drogen gedurende 5 − 10 min. Zorg ervoor dat de druppel volledig in de pad wordt opgenomen. Als er vloeistof overblijft, bewegen de cellen zich in de vloeistof en kunnen ze niet worden afgebeeld.
10. Plaats een dekslip op de bovenkant van de pads.
11. Sluit de Afdekstrook met gesmolten VaLaP af door zachtjes met een wattenstaafje rond de rand van de Afdekstrook te borstelen. Zorg ervoor dat u het van de bovenkant van de Afdekstrook weghoudt waar het objectief zal raken. De VaLaP zal harden in een kwestie van seconden, het afdichten van het monster.
12. Onmiddellijk het monster te beelden.
    Opmerking: Het monster moet worden gefotografeerd zodra de dia is voorbereid. De cellen kunnen groeien op de pads, en als ze verdelen de reconstructies zal moeilijker.

3. ImagingRequirements

1. Zorg ervoor dat de z-of scherpstel as van de Microscoop precieze bewegingen van minder dan 50 nm kan maken. Gebruik z piëzo-stadia (Zie tabel met materialen), beschikbaar op onderzoeksafstanden microscopen, omdat typische gemotoriseerde scherpstel apparaten niet in staat zijn om deze precisie te leveren.
   Opmerking: Uitgaande van de Nyquist-Shannon sampling criterium²⁰, moet men de mogelijkheid hebben om te bewegen 0.5 x de kleinste gewenste stapgrootte, of 2x de gewenste ruimtelijke frequentie. Voor de 100 nm-stappen die in dit protocol nodig zijn, is een fase met een nauwkeurigheid van 50 nm of minder vereist.
2. Zorg ervoor dat de Microscoop een 100x-doelstelling bevat met een minimaal numeriek diafragma (NA) van 1,45.
   1. Verzamel z-stapels tussen 200 − 400 verschillende cellen om ervoor te zorgen dat er voldoende cellen worden verkregen voor downstreamtoepassingen.
      Opmerking: Het aantal benodigde cellen hangt af van de onderliggende variabiliteit van het belang van de steekproef. Sommige van de cellen verzameld op dit punt zal het niet door de wederopbouw stappen te maken.
3. Zorg ervoor dat de z-stack overeenkomt met de instellingen die worden gebruikt voor het vorm kanaal als een secundair fluorescerende kanaal (eiwit, metabolisch label, enz.) wordt gemeten.

4. Imaging

1. Plaats de verzegelde glijbaan op de Microscoop en laat het 5 minuten zitten om de temperatuur met de omgeving te laten lopen, omdat de Microscoop ruimte op een andere temperatuur kan zijn dan de monster voorbereidingsruimte.
2. Neem een fluorescerende z-stack van het monster.
   Opmerking: de z-stack moet het monster volledig bedekken met een z-afstand kleiner dan de scherptediepte. Voor een 1,45 NA 100x objectief en ~ 1 μm dikke E. coli cellen, 40 stappen bij 100 nm per stap werken goed. Voor grotere cellen of cellen die niet perfect vlak op het oppervlak liggen, kunnen 50 of meer stappen nodig zijn. Neem voldoende stappen op en zorg ervoor dat het monster volledig vervaagd is boven en onder.
   1. Gebruik de software die is gekoppeld aan de Microscoop (Zie tabel met materialen) om de Microscoop te bedienen.
   2. Focus op het midden van de cel met behulp van de Microscoop focus wielen. Controleer onder ND-acquisitie het z- vak om een z-stack te maken. Klik op de knop Home om het midden van de cel in te stellen als het beginpunt. Stel de stapgrootte in op 0,1 μm en stel het bereik in op 4 μm. Zorg ervoor dat het Z-apparaat is ingesteld op de piëzo-fase.
   3. Stel de fluorescentie kanalen onder het Lambda-venster in op de instellingen voor de fluorescerende moleculen die worden afgebeeld. In dit experiment werden GFP en mCherry gebruikt.
      Opmerking: Neem een extra z-stack met dezelfde stapgrootte en bereik in het tweede kleurkanaal als de 3D-verdeling van een extra fluorescerende kanaal gewenst is. In dit experiment, cytoplasmatische mcherry werd gebruikt om te bepalen van de celvorm en MreB-GFP werd gebruikt als een tweede kleurkanaal²¹.
   4. Zorg ervoor dat de volgorde van experiment is ingesteld op Lambda (z-serie), zodat het een volledige z-stack in elk kleurkanaal voordat u overschakelt.
   5. Klik op nu uitvoeren om de installatiekopie te starten en het bestand op te slaan onece één of beide z-stapels zijn voltooid.
   6. Ga naar een nieuw gebied op de pad en herhaal stap 4.2.2-4.2.5.

5. celreconstructie

1. Snijd afzonderlijke cellen bij en sla de afbeeldingen op als een gestapeld TIFF-bestand, zodat er slechts één cel per bestand is. Zorg ervoor dat deze cel goed geïsoleerd is van andere cellen (d.w.z. ongeveer 5x de volledige halve breedte van de vervaging-functie in XY.
   Opmerking: dit kan worden gedaan met behulp van vrij beschikbare beeldanalyse software (Zie tabel van de materialen).
   1. Teken een vak rond een afzonderlijke cel en Dupliceer die cel 2x, eenmaal voor elk kanaal. Zorg ervoor dat het dubbele hyperstack-vakje is aangevinkt en verander het kanaal in 1 of 2, en zorg ervoor dat de segmenten de hele z-stack bevatten.
      Opmerking: Als alleen de vorm van de cellen en niet een aanvullend fluorescerende eiwit worden geimaging, zal er slechts één kanaal aanwezig zijn.
   2. Zodra beide stapels beschikbaar zijn, gaat u naar afbeeldingen | Stapels | Tools | Samenvoegen om de beelden te combineren met het eiwit kanaal eerst en de vorm kanaal tweede.
   3. Sla de nieuwe afbeelding op als een TIFF-bestand.
2. Meet de vervaging functie van de microscoop met behulp van subdiffractie beperkt fluorescerende kralen²². Dit moet worden gedaan voor elke Microscoop en Microscoop doel, maar kan worden uitgevoerd voor of na het beeld van de monsters van belang.
   1. Gemiddelde samen meerdere onafhankelijke kralen met een handmatige interventie met behulp van beschikbare software (Zie tabel van materialen).
      Opmerking: Het eindproduct moet een 3D-beeld zijn van de vervaging-functie met dezelfde XYZ-afstand als de belangrijke monsters.
3. Voer de voorwaartse convolutie Cell shape reconstructie scripts uit met behulp van de beschikbare software. De nieuwste versie van deze scripts kan vrijelijk worden gedownload van https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public.
   1. Maak een map in een map op het bureaublad met de bijgesneden afbeeldingen en het bestand cell_shape_settings_tri. txt van Shae-cellshape-Public/exampleData_tri.
   2. Bewerk cell_shape_setting_tri. txt om de juiste instellingen voor het experiment van belang te hebben. Voor dit experiment bevat het instellingenbestand de volgende regels:
      nm_per_pixel 70
      Z_scale 0,65
      stack_z_size 41
      stack_t_size 1
      Fstack_z_size 41
      Fstack_t_size 1
      stack_seperation_nm 100
      Fstack_seperation_nm 100
      psfScript-999 osuPSF20180726
      kleurovergang 1
      
      Opmerking: Dit tekstbestand is ingedeeld in secties en elke sectie wordt geparseerd in een eigen variabele. Hoewel veel van de instellingen niet hoeven te worden gewijzigd van experiment om te experimenteren, moet men ervoor zorgen dat de grootte van de z-stack (stack_z_size voor vorm, Fstack_z_size voor eiwit van belang), afstand van de z-stack (stack_seperation_ nm, Fstack_seperation_nm), relatieve focale verschuiving van de Microscoop (Z_scale)²³, de pixelgrootte in XY (nm_per_pixel), en de naam van het script dat de vervaging functie van de Microscoop laadt (psfscript ) overeenkomen met het experiment. Het veld verloop moet worden ingesteld op 1 als het vorm kanaal cytoplasmically is gevuld en 0 als het een membraan-gekleurd object is.
   3. Voer Cell_shape_detector3dConvTriFolder functie uit (Shae-cellshape-Public/CellShapeDetectorTri/) met de tekenreeks naar de maplocatie gevolgd door het nummer van de cel om op te starten en het aantal cellen dat u wilt uitvoeren.
      Opmerking: Een voorbeeld voor de invoer ziet er als volgt uit: Cell_shape_detector3dConvTriFolder (' pad naar map met bijgesneden afbeeldingen ', startIndex in map, aantal cellen). Een typische cel kan tussen 5 − 20 minuten duren om de reconstructie te convergeren en te voltooien.
4. Scherm de celreconstructies om ervoor te zorgen dat ze correct zijn voordat u de cellen voor een statistische analyse.
   1. Voer Screenfits uit (Shae-cellshape-Public/Shae-fitViewerGui/) om individuele celreconstructies visueel te flatscreen.
   2. Klik op de knop map selecteren wanneer de grafische gebruikersinterface (GUI) wordt geopend en selecteer vervolgens de map met de gegevensbestanden voor reconstructie (TRI. mat) die zijn gemaakt in stap 5,3.
   3. Vink het vakje aan naast de reconstructie van de cel als een cel misvormde of niet volledig convergeert (Figuur 3). Dit kan eruit zien als een cel met een gat, een platte kant of een tak die eruit komt. Hiermee wordt 'Flag' toegevoegd aan de bestandsnaam, zodat deze kan worden uitgesloten van een downstream-analyse.
      Opmerking: De gereconstrueerde cel kan worden vergeleken met de originele beelden. Dit kan vooral belangrijk zijn als uw cellen afkomstig zijn van verschillende heterogene populatie vormen.
5. Voer enrichmentSmoothingSpline (Shae-cellshape-Public/) uit om een verrijkings profiel te maken van de relatieve concentratie van het eiwit van belang als functie van de Gaussiaanse kromming aan de oppervlakte.
   1. Selecteer elke map met TRI. mat-bestanden die zijn gemaakt in stap 5.3.3.
   2. Selecteer de zojuist gemaakte (5.5.1) curve. mat bestand.
      Opmerking: Een curve. mat-bestand wordt gemaakt voor elke map die is geselecteerd in 5.5.1. Alle verrijkings profielen worden op één grafiek weergegeven. Als afzonderlijke grafieken vereist zijn dan 5,5 uitvoeren voor elke map.
      Opmerking: Naast de precieze geometrische lokalisatie van een fluorescerend eiwit, zijn er vele andere manieren om de gegevens van het secundaire kanaal te analyseren, inclusief het tellen van het aantal, de grootte en de oriëntatie van objecten⁴.

Resultaten

Bacteriën komen in een breed scala van vormen en maten die hun functies in de natuur kunnen bepalen¹. De uitkomst van deze procedure is een nauwkeurige 3D-representatie van cellen van de voorwaartse convolutie van een z-stack met afbeeldingen (Figuur 1). Deze methode is vooral belangrijk bij het omgaan met gebogen cellen (Figuur 2), of met abnormaal gevormde cellen (Figuur 4A), omdat een 2D-representatie de kromming van de cellen niet nauwkeurig weergeeft. Om de voorwaartse convolutie methode (Figuur 1A) te gebruiken, moeten cellen ofwel perikaal gekleurd zijn of een cytoplasmische vlek hebben (Figuur 2B links versus rechts).

Figuur 4 toont de lokalisatie van mreb in de cel. Er werd een GFP-fusie gemaakt met het bacteriële actine proteïne MreB²¹ om de precieze lokalisatie in zowel wild type als Mutant E. coli cellen⁴te bestuderen. Omdat MreB geassocieerd is met het membraan, is 3D-beeldvorming vereist om zijn positie in de cel getrouw te reproduceren. Door deze metingen in 3D te maken, konden we de vormen van zowel wild type als Rodz Mutant cellen reconstrueren (Figuur 4A). De lokalisatie van MreB bleek te zijn verrijkt bij kleine Gaussiaanse krommingen, een geometrisch kenmerk dat alleen in 3D kan worden gemeten, in een RodZ afhankelijke manier (Figuur 4B).

Figuur 1: voorwaartse convolutie methode reconstruteert cellen zonder voorafgaande kennis van de celvorm. A) de uiteindelijke output van de methode is een 3D-celreconstructie die is afgeleid door een testvorm te vergelijken met de gekalibreerde vervaging functie van de Microscoop. Dit wordt vergeleken met de waargenomen z-stack totdat de waargenomen 3D-afbeelding overeenkomt met de hypothetische. De afbeelding die hier wordt weergegeven is een weergave van de reconstructie van één C. crescentus -cel. (B) de reconstructie pijplijn werkt de geschatte posities van de oppervlakte-elementen op basis van de waargenomen afbeeldings stack iteratief bij. Voor volledige algoritmische Details van de methode, zie Nguyen³. C) de reconstructie-pijpleiding begint met geen a priori kennis van de vorm van de cel en werkt de positie en het aantal oppervlakte hoekpunten bij die overeenkomen met de waargenomen z-stack. Representatieve beelden uit elke 30 stappen tijdens de 3D reconstructie worden getoond uit drie verschillende hoeken van een V. cholerae cel. De oppervlakte posities van deze vorm worden bijgewerkt om het verschil tussen de gesimuleerde en waargenomen stapels te minimaliseren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: representatieve 3D-reconstructies van drie verschillende gevormde bacteriesoorten. Driedimensionale reconstructies kunnen worden gemaakt van cellen met hun membraan gekleurd (links) of gevuld met een cytoplasmatische de (rechts). De vorm en kromming van de startcel is niet belangrijk, omdat een gebogen staaf, gedraaide staaf of rechte staaf allemaal nauwkeurig kunnen worden gereconstrueerd. De gereconstrueerde oppervlakken zijn gekleurd op basis van de lokale Gaussiaanse kromming van het oppervlak. Schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: reconstructies kunnen om meerdere redenen mislukken. De cellen moeten worden gescreend om ervoor te zorgen dat het algoritme van de reconstructie naar een redelijk resultaat converteerd. Left = representatief wild type (boven) en Rodz Mutant (onder) E. coli cellen die kwaliteitscontrole hebben doorstaan. Right = cellen die niet correct reconstrueren en geen kwaliteitscontrole doorstaan. Er worden vijf klassen van mislukte convergentie weergegeven: (i) cellen die te dicht bij de rand van het bijsnijdgebied liggen en tot een scherpe afbakening leiden, (II) cellen die te dicht bij een andere cel liggen, (III) cellen die een Divot hebben geproduceerd, (IV) cellen die niet verder gaan dan de initiële s en (v) andere onbekende fouten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: representatieve gegevens die eiwit lokalisatie tonen aan specifieke cellulaire geometrieën. A) driedimensionaal gereconstrueerde cellen van wild type en Rodz E. coli cellen met Gaussiaanse kromming en mreb fluorescentie intensiteit weergegeven. Schaalbalk = 1 μm.B) verrijkings percelen van mreb van wild type en Rodz E. coli cellen. Waarden > 1 verrijking en waarden weergeven < 1 Toon uitputting van MreB uit deze cellulaire regio's ten opzichte van uniforme dekking van de cel. Gearceerde gebieden geven het gemiddelde aan van ± 90% van de bootstrap-betrouwbaarheidsinterval. De curve voor elke stam is een kubieke gladmakende spline en wordt afgekapt met behulp van een waarschijnlijkheids drempel voor extreme krommingen van p > 5 x 10^-3. Dit cijfer is gewijzigd van (Bratton et al.) ⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Een cruciale stap in dit protocol is het verwerven van afbeeldingen van hoge kwaliteit. Om de cellen correct te reconstrueren, moet er voldoende vervaging boven en onder de cel zijn. Daarom is het noodzakelijk dat de z-stack genomen bestrijkt een groot genoeg afstand. Het aantal stappen dat tijdens het verzamelen van de afbeelding is uitgevoerd, kan voor elke stam worden aangepast. Bijvoorbeeld, E. coli cellen verwijderd voor Rodz zijn breder en vereisen meer stappen, en daarom, een grotere afstand, dan wilde type cellen. Als het voorbeeld Drifts tijdens beeld verwerving, de reconstructie kan grote fouten. Daarom is het belangrijk om de dia te laten komen tot thermisch evenwicht met de Microscoop vóór beeldvorming om drift te voorkomen tijdens de z-stack overname. Cellen moeten worden gefotografeerd op pads met lage auto fluorescentie. Media componenten, zoals die gevonden in de common LB medium, hebben auto fluorescentie die problemen kan veroorzaken bij het reconstrueren van de cellen. De dichtheid van cellen op het Imaging pad is belangrijk omdat het reconstructie proces onafhankelijk van elkaar wordt uitgevoerd op elke cel. Te weinig cellen zullen de tijd verhogen die nodig is om afbeeldingen van een voldoende aantal cellen te verkrijgen, terwijl te veel cellen resulteren in afbeeldingsvelden die te dicht zijn om afzonderlijke cellen eenvoudig in te snijden. Omdat niet alle cellen goed reconstrueren, moeten extra cellen worden afgebeeld tijdens de acquisitie stap en moeten alle uitgangen worden gescreend voordat ze verder gaan met statistische analyse (Figuur 3).

Veel van de beperkingen voor deze methode zijn technisch. Op de te gebruiken Microscoop moet men een objectief hebben dat een hoog numeriek diafragma heeft (typisch > 1.4), omdat hierdoor optische snijden op de grootte schaal van bacteriën mogelijk is. Bovendien moet de Microscoop worden uitgerust met een piëzo-fase die kleine, precieze stappen in de z-richting kan nemen. Bovendien, hoewel het niet noodzakelijk is, wordt de toegang tot rekenresources met hoge doorvoer voor het uitvoeren van de Image Analysis-software sterk aanbevolen, omdat het de verwerkingstijd voor het reconstrueren van cellen verkort.

Een conceptuele beperking van de methode is dat de juiste energie weegschalen worden gekozen om de gladheid van de reconstructie te wegen ten opzichte van de signaal-ruis verhouding van de beelden. Om een keuze van parameters te valideren, moeten de maten en vormen van cellen worden gemeten met behulp van onafhankelijke methoden zoals transmissie elektronenmicroscopie (TEM) of atoom kracht microscopie (AFM). Als bewijs van het principe werden 3D-reconstructies van cellen uitgevoerd op een AFM om te testen op z-nauwkeurigheid (< 50 nm) of op een TEM-raster om te testen op XY-nauwkeurigheid (< 30 nm)³. Een dergelijke gecorreleerde benadering is tijdrovend en kostbaar. Een eenvoudigere aanpak kan zijn voorbeeld standaardmonsters zoals wilde type cellen of 1 μm bolvormige kralen. De diameter en bolvorm van de reconstructies kunnen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de grootte en de energie schalen die bij de reconstructie worden gebruikt correct zijn.

Dit is niet de enige methode die streeft naar ruimtelijke informatie met hoge resolutie uit fluorescentiemicroscopie beelden te extraheren. Veel Review artikelen beschrijven recente vooruitgang op het gebied van super-resolution microscopie^24,25. Resolutie-verbeterende technieken zoals deconvolutie microscopie²⁶, Spinning Disk confocale microscopie²⁷, pixel hertoewijzing²⁸, en gestructureerde verlichtings microscopie (SIM)²⁹ streven naar verbetering van de resolutie van de beelden verkregen door de Microscoop. Deze methoden zijn niet onverenigbaar met de gepresenteerde benadering. Onlangs is deze methode aangepast om te zorgen voor SIM-gebaseerde beelden als ingangen⁹. Terwijl de voorwaartse convolutie methode een deel van zijn onderbouwing deelt met deconvolutie microscopie, heeft het een volledig verschillende output. Terwijl benaderingen zoals deconvolutie microscopie proberen om de resolutie van het beeld te verbeteren, deze aanpak genereert geen beeld, maar eerder een cel vorm reconstructie met ruwweg 50 nm precisie. Single-molecuul Active-Control microscopie technieken op basis van dun gelabelde monsters kunnen bieden nog hogere niveaus van ruimtelijke precisie dan deze methode. In veel gevallen, deze enkelvoudige molecuul benaderingen vereisen optimalisatie van de fluorescerende constructies en kan vereisen lange acquisitie tijden, waardoor ze moeilijk te gebruiken met Live of dynamische monsters. Elk van deze methoden wordt geleverd met een of meer voorbehoud dat deze methode niet. Bijvoorbeeld, de voordelen geadverteerd door spinnen schijf confocale microscopie zijn niet zo van toepassing op monolagen van bacteriële cellen, waar er niet veel buiten het licht van het vliegtuig. Bovendien biedt deze methode een pijplijn om nauwkeurige 3D-celvormen en eiwit lokalisatie te verwerven zonder de noodzaak van gespecialiseerde fluor Foren. Deze methode heeft minimale hardwarevereisten (d.w.z. z piezo, High NA Objective) en vereist slechts tientallen afbeeldingen per tijdpunt, waardoor een eenvoudig te onderzoeken dynamische 3D structuren⁶.

Er is een toenemend aantal benaderingen om de organisatie van bacteriële cellen in 3D-structuren te bestuderen. Deze omvatten benaderingen conceptueel vergelijkbaar met deze die profiteren van hoge kwaliteit, 3D fluorescentie beelden^30,31,32. Deze aanpak vereist goed geïsoleerde cellen en maakt geen a priori veronderstellingen over cellulaire geometrie. Echter, om te verplaatsen in dichte cellulaire aggregaten of biofilms, worden de cellen verondersteld te zijn Rod-achtige. Deze lagere resolutie-weergave nog steeds het onderzoeken van verpakkings regelingen van de cellen, hoewel de hoge dichtheid van cellen in de biofilm voorkomt analyse van de subcellulaire lokalisatie van specifieke factoren.

In de toekomst kan het interessant zijn om een kader te ontwikkelen voor de integratie van de enkelvoudige molecule en breed-veld benaderingen met deze 3D-reconstructie techniek. Bovendien kan het mogelijk zijn om deze voorwaartse convolutie benadering met machine Vision segmentatie tools³² op te nemen om reconstructies van meer dichte celclusters mogelijk te maken.

Waarom cellen zijn geëvolueerd tot specifieke vormen, is een complex probleem dat de complexe omgeving waarin ze leven moet weerspiegelen. Het begrijpen van de evolutie en functie van celvormen vereist het nemen van nauwkeurige en nauwkeurige metingen van die vormen, wat deze methode biedt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
50 nm fluorescente kralen	Invitrogen	F8795	deze worden gebruikt om de vervagingsfunctie van de microscoop te meten
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Wattenstaafje	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	gebruikt om VaLaP aan te brengen
Dekglasjes	VWR	16004-302
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc	gebruikt om cellen te cro
FM4-64	Invitrogen	LST3166	membraankleurstof gebruikt om cellen te kleuren
Huygens Software	Scientific Volume Imaging	Huygens essential of professional	Gebruikt om de vervagingsfunctie van de microscoop te meten
Lanolin	Sigma-Aldrich	L7387	combineren met paraffine en vaseline om VaLaP te maken
LB-groeimedium	BD Difco	DF0446173
M63 medium	US Biological	M1015
MATLAB	Mathworks		Nodig om forward convolution-scripts uit te voeren
Microscoopglazen	Fisher	12-550-133
NIS Elements	Nikon
Paraffine	Sigma-Aldrich	327212
Petroleum jelly	Equate	49035-038-27
Piezo z stage	Nikon	77011589
Pipettips -p200	USA Scientific	1111-0730
Pipettips- p10	USA Scientific	1111-3730