Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen

8.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60353

⸱

18 december 2019

 , 
1Department of Physiology, Northwestern University, Feinberg School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Organotypische segment culturen zijn een krachtig hulpmiddel om neuroontwikkelingsof degeneratieve/regeneratieve processen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol dat de neuroontwikkelingsdood van Purkinje-cellen in muizen cerebellaire segment culturen modelheeft. Deze methode kan profiteren van onderzoek in neuroprotectieve Drug Discovery.

Samenvatting

Organotypic slice Culture is een krachtig in-vitro model dat in vivo condities nauwer bootst dan dissociatie van primaire celculturen. In de vroege postnatale ontwikkeling, cerebellaire Purkinje cellen zijn bekend om te gaan door middel van een kwetsbare periode, waarin ze ondergaan geprogrammeerde celdood. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van de organotypische cerebellaire segment cultuur van de muis tijdens deze kritieke tijd. De plakjes zijn verder gelabeld om de overleving van de Purkinje-cel en de werkzaamheid van neuroprotectieve behandelingen te beoordelen. Deze methode kan zeer waardevol zijn voor het scherm voor nieuwe neuroactieve moleculen.

Inleiding

In vitro Modeling is een essentieel instrument in biomedisch onderzoek. Het stelt onderzoekers in staat om specifieke mechanismen in beperkte celtypen te bestuderen en nauw te beheersen, of in geïsoleerde systemen/organen. Organotypic slice Culture is een veel gebruikte in vitro techniek, vooral op het gebied van neurowetenschappen1. De methode werd voor het eerst vastgesteld door Gähwiler, die hersenen plakjes met behulp van de roller Tube techniek2, en later gewijzigd door Yamamoto et al., die introduceerde het gebruik van een microporeus membraan voor het uitvoeren van corticale segment culturen3. In vergelijking met primaire celculturen presenteren organotypische segment culturen het voordeel van het behoud van de cytoarchitectuur van het weefsel, evenals inheemse celcelverbindingen in het vlak van de weefsel sectie.

Organotypic plakjes zijn gekweekt uit vele delen van het centrale zenuwstelsel, zoals de Hippocampus4, cortex5, striatum6, cerebellum4,7, en ruggenmerg8,9, onder anderen. Ze zijn bewezen een krachtig instrument in de Drug Discovery studies10. De effecten van neuroactieve moleculen kunnen op vele manieren worden beoordeeld: overleving en neurodegeneratie met behulp van immunokleuring en biochemie testen, neuronale circuit vorming, of verstoring met behulp van elektrofysiologie en live-beeldvorming.

Het doel van dit werk is om een eenvoudige methode te beschrijven om organotypische cerebellaire segment cultuur uit te voeren, waarvan bekend is dat het een relevant model is om de Cerebellaire ontwikkeling in vitro na te bootsen. In het bijzonder richtten we ons op de studie van de Purkinje Cell-ontwikkelings dood. In vivo ondergaan de Purkinje-cellen apoptosis tijdens de eerste postnatale week, met een piek op postnatale dag 3 (P3)11. Hetzelfde patroon wordt waargenomen in cerebellaire segment cultuur, met Purkinje neuronen sterven door apoptosis wanneer cerebella worden genomen van dieren tussen P1 en P8, met een piek op P34,12. Het gebruik van de organotypische cerebellaire segment culturen heeft het toegestaan verschillende neuroprotectieve moleculen7,13te identificeren en een deel van de mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij deze geprogrammeerde celdood14,15,16. Hier beschrijven we een protocol op basis van de studie van Stoppini et al.17 in Hippocampus, en aangepast aan cerebellum door Dusart et al.4 het omvat snelle dissectie en hakken van postnatale cerebella; snijden cultuur op een celkweek invoegen met een microporeus membraan, met of zonder neuroprotectieve behandeling; en immunofluorescentie kleuring om neuronale overleving te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de noordwestelijke universitaire dierenstudies Commissie.

1. bereiding voorafgaand aan organotypische cerebellaire segment culturen

  1. In een celcultuurkap gespoten met 70% ethanol vooraf, bereid 200 mL kweekmedium in een 250 mL fles-top vacuüm filter aangesloten op een steriele fles ontvanger. Voeg 100 mL basale medium Eagle (BME) toe, 50 mL van de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks (HBSS), 50 mL warmtegeïnactiveerd paarden serum, 1 mL 200 mM L-glutamine (eindconcentratie 1 mM) en 5 mL 200 g/L glucose (eindconcentratie 5 mg/mL). Vacuüm-filter het kweekmedium en bewaar het op + 4 °C gedurende maximaal een maand.
  2. In de gesteriliseerde bioveiligheid Cabinet Haal je een 6-well kweek plaat uit de verpakking. Vul elk goed met 1 mL kweekmedium. Als een behandeling wordt getest, voegt u de farmacologische stof toe aan de behandelde put en hetzelfde volume van de voertuig oplossing voor de controle goed. In de huidige studie hebben we 1 μL steriele 3 M KCl-oplossing toegevoegd aan de behandelde put (30 mM Final) en 1 μL steriel water aan de controle putten.
  3. Breng in de cel cultuur kap het benodigde aantal individueel verpakte celkweek inserts met hydrofiele polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan (poriegrootte = 0,4 μm). Pak ze voorzichtig uit en verwijder de celkweek wisselplaten met steriele Tang. Laat ze een voor een in een put van een 6-put plaat, het vermijden van bubbels op de interface tussen het wisselplaat membraan en het celkweekmedium. Laat de inserts in het medium in een 37 ° c, 5% CO2 incubator voor ten minste 2 uur voor de cultuur.
    Opmerking: de weefsel Chopper bevindt zich permanent in de celcultuurkap.
  4. Bereid 2 200 mL Bekerglazen, een gevuld met 150 mL steriel water, en de andere gevuld met 150 mL 70% ethanol. Dompel de chirurgische gereedschappen in het 70% ethanol bad en vervolgens in water voordat u ze gebruikt.
    Opmerking: gebruik geen chirurgische hulpmiddelen onmiddellijk na contact met ethanol.
  5. Desinfecteer het dubbele snijmes in het 70% ethanol bekerglas. Plaats deze op de Meshouder met behulp van een steriele Tang en houd deze op zijn plaats met behulp van de messen klem sleutel. Laat het drogen tot het gebruik.
  6. Desinfecteer de met de weefsel Chopper meegeleverde plastic schijf in het 70% ethanol bekerglas. Spuit de snijtafel met 70% ethanol voordat u de schijf erop plaatst. Laat drogen tot het gebruik.

2. dissectie-en cerebellaire Organotypische segment culturen

  1. Breng de muis pup in de cel cultuur kap om de dissectie uit te voeren.
  2. Onthapitate de pup snel met behulp van rechte schaar (Figuur 1A).
  3. Terwijl je het hoofd van de pup door de neus vasthoudt met een rechte kaptang, open je de hoofdhuid met een rechte oogschaar, beginnend vanaf het achterste uiteinde, en dwars door de middenlijn.
  4. Ga identiek voor de schedel.
    Opmerking: Zorg ervoor dat u schaar tips naar buiten wijst om beschadiging van het cerebellum tijdens dissectie te voorkomen.
  5. Neem de hersenen en breng het over naar een 60-mm-schotel gevuld met koude HBSS + 5 mg/mL glucose.
  6. Voorzichtig ontleden het cerebellum met behulp van steriele rechte fijne Tang (Figuur 1B). Breng het op de plastic schijf die op de snijtafel van de weefsel Chopper wordt geplaatst met behulp van steriele gebogen fijne Tang.
  7. Oriënteer het weefsel door het draaien van de snijtafel om parasagitale secties uit te voeren.
  8. Beweeg de snijtafel door de tafel ontgrendelingsknop naar rechts te trekken, zodat het blad aan de rand van het weefsel wordt geplaatst.
  9. Stel de segment dikte in op 350 μm en de blad snelheid naar gemiddeld.
  10. Start de Chopper. Zodra het hele cerebellum is gesneden (Figuur 1C), zet u de Chopper uit.
  11. Verwijder de plastic schijf met steriele Tang.
  12. Breng de plastic schijf voorzichtig dicht bij een schaal van 60 mm met HBSS + 5 mg/mL glucose. Pipetteer koude HBSS + 5 mg/mL glucose op het weefsel met behulp van een steriele pipet om het oogsten van cerebellaire schijfjes in de buffer gevulde schaal mogelijk te maken.
  13. Scheid de cerebellaire segmenten van elkaar met behulp van een micro sonde. Neem goede kwaliteits secties met de Pipet (het wordt aanbevolen om weefsel secties te gebruiken die dicht bij de vermis liggen) en zet ze af in een pre-equilibrated celcultuurinsert (Figuur 1D).
  14. Plaats de cerebellaire schijfjes op het celkweek-wisselplaat met behulp van de microprobe en verwijder vervolgens voorzichtig de overtollige HBSS + 5 mg/mL glucoseoplossing met de pipet voor het overbrengen.
    Opmerking: in dit stadium is het weefsel extreem mals en gevoelig voor lichamelijke schade. Het maximum aantal cerebellaire schijfjes per celcultuurinsert is afhankelijk van de leeftijd van het donordier. 6 – 8 sneetjes kunnen gekweekt worden voor een P0-P4-oud dier, en 4 – 6 sneetjes voor dieren ouder dan P5.
  15. Plaats de kweek schaal in de incubator, waarbij het medium volledig om de 2 – 3 dagen wordt vervangen.
  16. Om de overleving van de Purkinje-cel te beoordelen, kunnen segmenten al 5 dagen in vitro worden verzameld. Voor andere doeleinden kunnen ze gedurende enkele weken in cultuur worden gehouden (Figuur 1F).
    Opmerking: in het geval van overlevings experimenten met Purkinje-cellen is het niet nodig om de farmacologische behandeling te vernieuwen bij het veranderen van het celkweekmedium (Figuur 1F).

3. immunofluorescentie

  1. Haal de 6-put plaat uit de incubator. Verwijder celkweekmedium, was de celkweek insert met 1x PBS en bevestig de schijfjes met koude 4% Paraformaldehyde oplossing voor 1 uur, met 1 mL onder het celkweek inzetstuk en 500 μL bovenop het celkweek inzetstuk.
  2. Was de wisselplaten 4x 10 min met 1x PBS, met 1 mL onder en 500 μL bovenop de wisselplaat, op een rondschudapparaat.
  3. Breng met een borstel de cerebellaire schijfjes over van 1 celkweek insert naar 1 put van een 24-Well voorgevulde met 1x PBS, 0,25% Triton X-100 en 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/well.
  4. Permeabilize en Blokkeer de plakjes door incubatie in PBS-TB voor 1 uur bij kamertemperatuur.
  5. Inincuberen met primaire antilichamen verdund in de PBS-TB-oplossing, 's nachts bij + 4 °C, op een rondschudapparaat, 200 μL/goed.
  6. Doe de volgende dag vier wasgoed van 10 min met 1x PBS, op een rondschudapparaat, 500 μL/Nou.
  7. Inincuberen met secundaire antilichamen verdund in de PBS-TB-oplossing, twee uur bij kamertemperatuur, op een rondschudapparaat en beschermd tegen licht, 200 μL/goed.
  8. Voer vier wasgoed van 10 min met 1x PBS, op een rondschudapparaat, 500 μL/put.
  9. De plakjes met behulp van Hoechst 33342, verdund in 1x PBS (2 μg/mL), gedurende 10 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, 500 μL/goed.
  10. Monteer de cerebellaire-segmenten op een microscopie dia met een pipet voor overdracht. Laat ze volledig lucht drogen, beschermd tegen licht. Bevochtigen ze met 1x PBS en breng een dekslip aan die bedekt is met enkele druppels afdekmedium (~ 80 μL). Vermijd het maken van bubbels.
  11. Zodra het afdekmedium is uitgehard, zijn cerebellaire-secties klaar om te worden gefotografeerd.

4. beeldvorming en kwantificering van de overleving van de cel

  1. Schakel de Microscoop en lasers in volgens de fabrikant en/of de instructies van de Imaging Core Facility.
  2. Start de acquisitie software.
  3. Gebruik een 10x doelstelling om niet-veranderde cerebellaire schijfjes te vinden die 9 – 10 door bevatten (meestal cerebellaire secties dicht bij de vermis).
  4. Z-stack-acquisitie activeren. Definieer het bereik van de z-stack om alle Purkinje-cellen in het cerebellaire segment op te nemen. Stel een stapgrootte van 2 μm in en start de overname. Sla de verkregen afbeelding op in de indeling van de fabrikant van de aanschaf software om de bijbehorende metagegevens te behouden.
  5. Open het verkregen bestand in ImageJ met behulp van de plug-in bio-formaten18.
  6. Ga naar afbeelding > stapels > Z-project... (Figuur 2A).
  7. Kies maximale intensiteit in het vervolgkeuzemenu projectietype en klik op OK (afbeelding 2B).
  8. Er wordt een afgevlakte 2-D-afbeelding gegenereerd. Dubbelklik op het gereedschap met meerdere punten om het venster punt te laten verschijnen. Schakel de optie Label punten uit om de visualisatie van getelde cellen te vereenvoudigen. Klik vervolgens direct op een Soma van een Purkinje-cel om te beginnen met tellen (Figuur 1E). Het totale aantal getelde cellen wordt aangegeven onder in het venster van het gereedschap punt (Figuur 3).
    Opmerking: meestal kunnen ten minste 3 niet-beschadigde secties met 9 – 10 door per celcultuurinsert worden gekwantificeerd. Om het neuroprotectieve effect van een farmacologisch agens te beoordelen, moeten ten minste 3 onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals weergegeven in Figuur 4, produceert dit protocol organotypische cerebellaire segment culturen waarin de overleving van de Purkinje-cel kan worden beoordeeld na de immunofluorescentie-en beeldverwervings stappen. Purkinje-cellen werden gelabeld met een combinatie van anti-Calbindin D-28K (verdunning 1/200) en Alexa594 anti-muis (verdunning 1/300) antilichamen. Beeld stiksels werd automatisch gedaan door de Microscoop acquisitie software (NIS-elementen) om een foto van de hele cerebellai...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Cerebellaire segment cultuur is een krachtig hulpmiddel om geprogrammeerde Purkinje celdood te bestuderen tijdens de postnatale ontwikkeling. Deze techniek kan worden gebruikt om snel kandidaatmoleculen voor hun neuroprotectieve potentieel te scherm. Het belangrijkste voordeel is dat de installatie eenvoudig en zeer kosteneffectief is, en alleen een bescheiden investering in apparatuur vereist (een vibratome kan tot 3 keer meer kosten dan een weefsel Chopper). Bovendien kunnen 10 tot 15 gezonde schijfjes worden gegeneree...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Imaging work werd uitgevoerd in het Northwestern University Center voor geavanceerde microscopie royaal ondersteund door NCI CCSG P30 CA060553 toegekend aan het Robert H Lurie uitgebreide Kankercentrum. We danken Sean McDermott voor zijn technische assistentie en ondersteuning, en Maya Epstein voor de hand getekende illustraties getoond in Figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secundair antilichaamThermoFisher scientificA21203
Basal Medium Eagle (BME)ThermoFisher scientific21010046
Biosafety cabinet Klasse II, Type A2NuAireNU-540-400
Bovine serum albuminMillipore SigmaA2153
Borstel
anti-Calbindin D-28K antilichaam (CB-955)Abcamab82812
CO2 IncubatorNuAireNU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture PlatesFisher Scientific07-200-83
Dekglasjes, 22 x 50 mmFisher Scientific12-545-E
Dressingtang, rechtHarvard Apparatus72-8949
Dubbelzijdige messenFisher Scientific50949411
Ethanol 200 proofDecon Labs, Inc2701
Ogenschaar, rechtHarvard Apparatus72-8428
Fijne pincetFisher Scientific16-100-127
L-Glutamine 100XThermoFisher scientific25030149
Glucose oplossingThermoFisher scientificA2494001
Hanks' Balanced Salt SolutionThermoFisher scientific14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydraatFisher ScientificH21492
Paarden serum, warmte-inactivering, Nieuw-Zeelandse oorsprongThermoFisher scientific26050088
ImageJ
McIlwain Tissue ChopperFisher ScientificNC9914528
MicroprobesFisher Scientific08-850
Millicell Cell Culture InsertsMillipore SigmaPICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow steriele wegwerpfilterunits met PES-membraan, 250 mLThermoFisher scientific168-0045
Nikon A1R confocale lasermicroscoopsysteemNikon
NIS-Elements Imaging SoftwareNikon
ParaformaldehydeAcros Organics41678-0010
Pasteur pipettenFisher Scientific13-678-20D
KaliumchlorideFisher ScientificBP366-500
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisher scientificP10144
Operatieschaar, rechtHarvard Apparatus72-8403
Orbitale shaker Belly DancerIBI ScientificBDRLS0003
Prism 8GraphPad
Superfrost Plus MicroscoopglazenFisher Scientific12-550-15
Weefselkweekschaal, 60 mm met gripringFisher ScientificFB012921
Weefselkweekplaat, 24 wellFalcon/Corning353047
Transferpijpjes, sterieleThermoFisher scientific13-711-21
Triton X-100ThermoFisher scientificBP151-500

Referenties

  1. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  2. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  3. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
  4. Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
  5. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886(2017).
  6. Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
  7. Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
  8. Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
  9. Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
  10. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
  11. Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
  12. Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
  13. Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
  14. Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
  15. Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
  16. Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
  17. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  18. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  19. Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
  20. Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985(2012).
  21. Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
  22. Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
  23. Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Organotypische plakcultuurpreparatie van cerebellaire plakkenimmunofluorescentiekleuringscreening van neuroprotectieve behandelingenweefselsectiecelkweekinsertsfixatie met paraformaldehydefluorofoor-geconjugeerde antilichamenelektrofysiologische monitoring
Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.