Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën

Samenvatting

Mycobacterium tuberculose vertoont een verhoogde productie en afgifte van extracellulaire blaasjes als reactie op lage ijzer omstandigheden. Dit werk Details een protocol voor het genereren van lage ijzer omstandigheden en methoden voor de zuivering en karakterisering van mycobacteriële extracellulaire blaasjes vrijgegeven in reactie op ijzertekort.

Samenvatting

Mycobacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculose (MTB), de veroorzaker van humane tuberculose, brengen natuurlijke extracellulaire blaasjes (ev's) met immunologisch actieve moleculen vrij. Kennis over de moleculaire mechanismen van blaasje biogenese, de inhoud van de blaasjes, en hun functies op de pathogeen-hostinterface is zeer beperkt. Het aanpakken van deze vragen vergt strenge procedures voor isolatie, zuivering en validering van Ev's. Eerder bleek de productie van blaasje te worden verbeterd toen M. tuberculose werd blootgesteld aan ijzer beperking, een aandoening die door MTB in de hostomgeving wordt ondervonden. Hier gepresenteerd is een compleet en gedetailleerd protocol om Ev's te isoleren en te zuiveren van ijzer deficiënte mycobacteriën. Er worden kwantitatieve en kwalitatieve methoden toegepast om gezuiverde Ev's te valideren.

Inleiding

Mycobacteriële extracellulaire blaasjes (mev's) zijn membraan gebonden nanodeeltjes, 60 − 300 nm in grootte, natuurlijk vrijgegeven door snel-en langzaam groeiende mycobacteriën¹. Mev's vrijgegeven door pathogene mycobacteriën vormen een mechanisme om te communiceren met de gastheer via immunologisch actieve eiwitten, lipiden, en glycolipiden uitgescheiden in een geconcentreerde en beschermde manier^2,3,4. Om mevs te karakteriseren en hun biogenese en functies te begrijpen, zijn strikte en efficiënte methoden voor het zuiveren en valideren van blaasje cruciaal. Tot nu toe zijn mev's geïsoleerd van de cultuur filtraten van mycobacteriën geteeld in een ijzerrijke medium^1,5,6,7,8.

Echter, vorig werk toonde aan dat ijzer beperking sterk stimuleert blaasje vrijlating in MTB, mogelijk om ijzer vast te leggen via mycobactin, een siderophore uitgescheiden in mevs⁹. Hoewel er een beschrijving is gegeven van de procedures voor Mev's die geïsoleerd zijn van MTB-culturen in een hoog ijzer medium, is er geen efficiënte methodologie gerapporteerd voor het verkrijgen van Mev's uit een laag ijzergehalte. Daarom is het doel van deze methode het isoleren, zuiveren en kwantificeren van mev's die zijn verkregen uit lage ijzer culturen, zodat ze kunnen worden gebruikt voor biochemische en functionele testen en voor de analyse van genetische determinanten van blaasje productie in mycobacteriën.

Protocol

1. bereiding van met ijzer uitgeput gedefinieerd medium

1. Bereid 1 L minimaal medium (MM) door het oplossen van 5 g KH₂po₄, 5 g L-Asparagine, 20 ml glycerol en 2 g dextrose in 900 ml gedeïoniseerd water in een plastic container. Vermijd glas om ijzer verontreiniging te voorkomen. Pas de pH op 6,8 met 5 N NaOH en het volume op 1 L met water.
2. Voeg 50 g metaal chelaat hars (MCR) toe en roer voorzichtig met een magnetische roer stang gedurende 24 uur bij 4 °C. Steriliseren en verwijderen van de MCR door filtratie door een 0,22 μm filter unit met een plastic ontvanger. Om filtratie te versnellen en filter verstopping te voorkomen, laat de hars gedurende ongeveer 30 minuten voor filtratie.
   Opmerking: Dit medium bevat minder dan 2 μM rest ijzer, zoals bepaald door Atoom Absorptie spectroscopie.
3. Supplement MM met 0,5 mg/L ZnCl₂, 40 mg/l MgSO₄, en 0,1 mg/l mnso₄. Afzonderlijk, bereid geconcentreerde aandelen (1, 000x) van elk van de metalen supplementen in gedeïoniseerd water en steriliseren door filtratie vóór MM suppletie. Ijzer-uitgeput, metaal aangevuld MM zal hier worden verwezen als laag ijzer MM (LIMM).
4. Van een 50 mM voorraad FeCl₃ opgelost in 10 mm HCl, voeg 1 ml aan 1 L van limm (50 μM eindconcentratie) om te bereiden van hoge ijzer mm (himm).

2. mycobacteriën kweken in ijzer beperkte omstandigheden

1. Ontdooien 50 μL van een bevroren 15% glycerol voorraad MTB en streak een agar plaat aangevuld met 10% ADN verrijking (5 g/L albumine, 2 g/L dextrose, en 0,85 g/L natriumchloride, 0,2% glycerol en 0,05% Tween-80)¹⁰. Inincuberen van de plaat bij 37 °C tot kolonies zichtbaar zijn.
2. Inoculeren van een enkele kolonie MTB¹⁰ in 2 ml mycobacteriële Bouillon medium (tabel van de materialen) aangevuld met ADN verrijking. Incuberen met roeren bij 37 °C.
3. Laat de MTB-cultuur uitgroeien tot de late logaritmische fase (OD₅₄₀ is ~ 0,8). Om dit te controleren meet u de OD₅₄₀ met behulp van een spectrofotometer.
4. Verdeel 200 μL van de late logaritmische cultuur op de mycobacteriële agar-platen (tabel met materialen) aangevuld met 0,2% glycerol, 0,05% Tween-80 en ADN. Inoculeren ten minste 5 platen. Inincuberen de platen bij 37 °C tot de bacteriegroei zichtbaar is als een confluente laag. Dit duurt ~ 1 week voor MTB.
5. Bevochtig een steriel wattenstaafje in LIMM. Gebruik dit wattenstaafje om bacteriën van de agar-platen te verzamelen en 100 mL LIMM te gebruiken om een geconcentreerde bacteriële suspensie te bereiden met een OD₅₄₀ van ~ 1,0.
6. Verdun deze suspensie 10 keer tot 1 L met LIMM en verdeel deze in twee, 2 L steriele plastic flessen, elk met 500 mL cultuur.
7. Neem 2 mL cultuur en breng het over naar een 5 mL kweek buis. Voeg 10 μL 10% vol/vol tyloxapol toe.
8. Incuberen de culturen bij 37 °C die 14 dagen staan.

3. verzameling van Mev's

1. Meet de OD₅₄₀ van de 2 ml cultuur op het moment van de inzameling. Maak 1:10 seriële verdunningen van de kweek en plaat 100 μL van elke verdunning op agarplaten met ADN en 0,05% Tween-80.
2. Breng de cultuur over naar 5 225 mL conische centrifugebuizen en centrifugeer bij 2.850 x g gedurende 7 minuten bij 20 °c.
3. Verzamel de kweek supernatant met een 50 mL pipet en filter steriliseren door een 0,22 μm filter unit.

4. isolatie van Mev's

1. Breng het filtraat van de cultuur over in een met 4 °C geplaatst roercel-ultrafiltratie systeem en filtreer het concentraat bij < 50 psi door middel van een 100 kDa-cutoff-membraan tot ~ 50 mL.
2. Centrifugeer het filtraat van geconcentreerde kweek bij 15.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c en vang het supernatant op.
3. Centrifuge de cultuur filtraat in polycarbonaat ultracentrifugatie buisjes bij 100.000 x g voor 2 uur bij 4 °c.
4. Breng de membraneuze pellets in totaal 1 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan door voorzichtig te pipetteren.
5. Meng 0,5 mL van de pelletsuspensie die is verkregen in stap 4,4 met 1,5 mL 60% iodixanol-oplossing, wat een uiteindelijke iodixanolconcentratie oplevert van 45% WT/vol. Verdeel deze mix aan de onderkant van een 13 mm x 51 mm polypropyleen dunwandige ultracentrifuge buis.
6. Overlay de MEV-iodixanol 45% suspensie met 1 mL 40%, 35%, 30%, 25% en 20% (vol/vol in PBS) iodixanol-oplossingen en 1 mL PBS aan de bovenkant.
7. Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 18 uur bij 4 °c.
8. Verzamel de 1 mL dichtheidsgradiënt fracties vanaf de bovenkant met behulp van een 1 mL Hamilton spuit.
9. Verdun elke verzamelde fractie tot 20 mL met PBS en centrifugeer op 100.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °c.
10. Verwijder de supernatant en onderbreek de pellet in 0,5 mL PBS. Bewaar deze pellet bij 4 °C.

5. kwantificering van Mev's

1. Meet de eiwitconcentratie in elke fractie door een Bradford-test (tabel met materialen), volgens de richtlijnen van de fabrikant.
2. Voer membraan lipiden analyse uit.
   1. Incuberen 10 μL van elke gradiënt fractie met de fluorescerende membraan sonde 1-(4-Trimethylammoniumfenyl) -6-fenyl-1, 3, 5-Hexatrieen p-toluenesulfonaat (TMA-dph) bij een eindconcentratie van 1 μg/ml in een laatste 50 ΜL volume PBS in 96 goed zwart Platen.
   2. Incuberen de platen gedurende 20 minuten bij 33 °C.
   3. Meet de fluorescentie bij een excitatie van 360 nm en een emissie van 430 nm.

6. kwalitatieve analyse van Mev's

1. Voer eiwit elektroforese.
   1. Meng ongeveer 1 μg MeV-monsters in 16 μl met 4 μl 5x monster laad buffer (10% w/v SDS, 10 mm dithiothreitol, 20% v/v glycerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v broomfenolblauw) en verwarm de monsters in de monster buffer bij 85 °c gedurende 5 minuten.
   2. Laden in een 10% tris/Glycine SDS-Polyacrylamide gel¹¹ en lopen op 10 V/cm in lopende buffer (25 mm tris-basis, 190 mm Glycine, 0,1% SDS) totdat het blauwe kleurstof front de bodem van de gel bereikt.
   3. Vlek de gel met een ultragevoelige eiwit kleurings oplossing (tabel met materialen).
2. Voer de dot-Blot uit.
   1. Laad 2 μL van een MEVs-suspensie met een concentratie van ongeveer 0,5 μg/μL, en tweevoudige seriële verdunningen op een nitrocellulose membraan en proces voor een dot-vlek volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Gebruik een antiserum dat in muizen is verhoogd tegen een preparaat van Mev's bij een verdunning van 1:5000 als primair antilichaam en een geit-anti muis, gekoppeld aan mierikswortelperoxidase (HRP) bij een verdunning van 1:10000 als secundair antilichaam. Detecteer antilichaam complexen met een geschikte HRP substraat blotting Detection reagens en een imaging systeem.
3. Voer negatieve kleuring en elektronenmicroscopie uit.
   1. Fixeer 250 μL MEVs met 2% Glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en inbroed in een nacht in 4% formaldehyde, 1% Glutaaraldehyde en 0,1% PBS.
   2. Vlek de vaste monsters met 2% osmium tetroxide voor 90 min.
   3. Dehydraat het monster in ethanol en sluit het aan op epoxy hars van Spurr.
   4. Observeer de MEVs onder een transmissie elektronen microscoop.

Resultaten

Mev's werden gezuiverd door differentiële sedimentatie in een dichtheidsgradiënt (Figuur 1, Figuur 2). Onder de beschreven omstandigheden scheidden Mev's meestal in gradiënt breuk 3 (F3), wat overeenkomt met 25% iodixanol. Deze conclusie is gebaseerd op de detectie van eiwitten, membraan lipide, microscopische visualisatie van intact MEVs, nanodeeltjes grootteverdeling, en positieve reactiviteit met een antivesicle antiserum (

Discussie

Er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het zuiveren van eukaryote celafgeleide exosomen¹². Er is daarentegen beperkte informatie beschikbaar over effectieve methoden voor het zuiveren van door bacteriën afgeleide Ev's⁷. Efficiënte isolatie van Ev's met MTB-derivaten moet rekening houden met de intrinsieke moeilijkheden bij het kweken van deze pathogene Mycobacterium. MTB heeft een lange delings tijd (~ 24 uur) en moet worden behandeld in de bioveiligheid niveau drie (BSL...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Amicon stirred cell Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cel ultrafiltratiesysteem
BD Polypropyleen 225 mL conische buizen	Fisher	05-538-61	Conische centrifugeerbuizen
Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltratie membraan	EMD Milipore	PBHK07610	Ultrafiltratie membraan
Chelex-100 hars	Bio-Rad	142-2842	Metaalchelerende hars
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mycobacteriale agar platen
Middlebrook 7H9 Bouillon	BD Difco	271310	Mycobacteriale bouillonmedium
Nitro cellulose blotting membraan	GE Healthcare	10600001	Blotting Membraan
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonaat ultracentrifugeerbuizen 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Polycarbonaat ultracentrifugeerbuizen 25 mm x 89 mm
Polypropyleen dunne wand centrifugeerbuis 13 mm x 15 mm	Beckman Coulter	344059	Polypropyleen dunne wand centrifugeerbuis 13 mm x 15 mm
Proteïne assay kleurstof	BioRad	5000006	Bradford Proteïne Kleuring
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	Ultragevoelige eiwitkleuring
TMA-DPH	Molecular Probes	T204	1-(4-Trimethylammoniumfenyl)-6-fenyl-1,3,5-hexatrieen p-Tolueensulfonaat
Vacuum filtratie kolven	CellPro	V50022	Filter Unit