Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

5.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60362

⸱

29 oktober 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

In dit artikel

Samenvatting

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Samenvatting

C. elegans is het belangrijkste systeem voor de systematische analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen tijdens de embryonale ontwikkeling. Een uitdaging is dat embryogenese dynamisch zich ontvouwt over een periode van ongeveer 13 uur; deze tijdschaal van een halve dag heeft de reikwijdte van experimenten beperkt door het aantal embryo's dat kan worden gefotografeerd te beperken. Hier beschrijven we een semi-High-throughput-protocol dat de gelijktijdige 3D-time-lapse-beeldvorming van ontwikkeling mogelijk maakt in 80 – 100 embryo's bij matige tijdresolutie, van maximaal 14 verschillende omstandigheden, in een enkele nachtelijke run. Het protocol is eenvoudig en kan worden geïmplementeerd door elk laboratorium met toegang tot een microscoop met punt bezoek capaciteit. Het nut van dit protocol wordt aangetoond door het te gebruiken om beeld twee op maat gebouwde stammen uitdrukken fluorescerende markers geoptimaliseerd voor het visualiseren van belangrijke aspecten van de kiem-laag specificatie en morfogenese. Om de gegevens te analyseren, is een aangepast programma dat individuele embryo's uit een breder gezichtsveld in alle kanalen, z-stappen en tijdpunten snijdt en de sequenties voor elk embryo opslaat in een aparte TIFF-stapel gebouwd. Het programma, dat een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI) bevat, stroomlijnt de gegevensverwerking door afzonderlijke embryo's te isoleren, vooraf te verwerken en uniform te oriënteren in voorbereiding op visualisatie of geautomatiseerde analyse. Ook meegeleverd is een ImageJ-macro die individuele embryo gegevens compileert in een bestand met meerdere panelen dat de maximale intensiteit fluorescentie projectie en brightfield-afbeeldingen voor elk embryo op elk tijdstip weergeeft. De protocollen en hulpmiddelen die hierin worden beschreven, werden gevalideerd door ze te gebruiken om embryonale ontwikkeling te karakteriseren na een knock-down van 40 eerder beschreven ontwikkelings genen; deze analyse visualiseerde eerder geannoleerde ontwikkelings fenotypes en onthulde nieuwe. Kortom, dit werk Details een semi-hoge doorvoer imaging methode in combinatie met een bijsnijden programma en ImageJ visualisatietool die, in combinatie met stammen uitdrukken informatieve fluorescerende markers, sterk versnelt experimenten te analyseren embryonale ontwikkeling.

Inleiding

De C. elegans embryo is een belangrijk modelsysteem voor mechanistische celbiologie en analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen die embryonale ontwikkeling stimuleren1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Tot op heden is veel van de karakterisering van zowel gebeurtenissen op cellulair niveau als de specificatie van het lot van cellen in het embryo bereikt met behulp van relatief hoge temporele resolutie One-at-a-time Imaging experimenten (d.w.z. acquisitie elke 10 – 100 s) van embryo's die fluorescerende markers. Hoewel zeer geschikt voor gebeurtenissen op de orde van seconden tot tientallen minuten, wordt deze aanpak technisch beperkt voor de karakterisering van langere processen, op de volgorde van uren tot dagen. Embryonale ontwikkeling van het eerste decolleté tot het einde van de rek duurt ongeveer 10 uur. Op deze tijdschaal, semi-hoge doorvoer methoden die ervoor zorgen dat gelijktijdige lagere tijdresolutie Imaging (d.w.z. acquisitie met 5 – 20 min tijdsintervallen) van grotere cohorten van embryo's, van verschillende omstandigheden, zou een nieuwe reeks experimenten openen; bijvoorbeeld het mogelijk maken van systematische grootschalige screening-inspanningen en de analyse van voldoende aantallen embryo's voor vergelijkingen van de gevolgen van moleculaire verstoringen.

Hier beschrijven we een semi-High-throughput-methode voor het bewaken van C. elegans embryogenese die gelijktijdige 3D-timelapse-beeldvorming van de ontwikkeling mogelijk maakt in 80 – 100 embryo's, van maximaal 14 verschillende omstandigheden, in een enkele nachtelijke run. Het protocol is eenvoudig te implementeren en kan worden uitgevoerd door elk laboratorium met toegang tot een microscoop met punt bezoek mogelijkheden. De belangrijkste stappen in dit protocol zijn uiteengezet in Figuur 1. In het kort, embryo's worden ontleed van zwangere volwassenen uitdrukken van fluorescerende markers van belang en overdracht van jonge embryo's (2 – 8 cel stage) naar putten van een 384-put voorbeeld vorming. In dit formaat, de relatief kleine goed grootte trechters embryo's in een smal gebied, die de identificatie van velden met meerdere embryo's voor time-lapse beeldvorming vergemakkelijkt. Om ruwweg synchrone ontwikkeling in de cohort van embryo's te handhaven, worden dissecties uitgevoerd in gekoelde media en wordt de plaat op ijs gehouden, waardoor significante ontwikkeling tijdens het urenlange dissectie tijdvenster wordt voorkomen. De plaat wordt overgebracht naar de Microscoop en de embryo's worden gefilmd in een kamer met temperatuurregeling, 's nachts, op 20 min tijdsintervallen, met een 60x olie onderdompeling 1,35 NA lens, om het volledige z-bereik in stappen van 2 μm te verzamelen. 50 velden, elk met een tussen 1 – 5 embryo's, worden in één enkele nacht run afgebeeld. Afhankelijk van het gewenste experiment kan de tijdresolutie worden verhoogd (bijvoorbeeld Imaging met intervallen van 5 tot 10 minuten) door het aantal afbeeldingsvelden proportioneel te verlagen.

Met dit protocol genereert zelfs één overnight run een aanzienlijke hoeveelheid gegevens (80 – 100 embryo's verspreid over 50 velden) en grotere experimenten kunnen snel onbeheersbaar worden met betrekking tot data-analyse. Om de verwerking, visualisatie en stroomlijn analyse van deze gegevens te vergemakkelijken, werd een programma gebouwd om embryo's uit te snijden en te oriënteren en pre-processing stappen uit te voeren (optioneel), en een ImageJ-macro die de gegevens compileert om de weergave te vereenvoudigen. Deze Programma's kunnen worden gebruikt om beelden te verwerken die zijn verzameld met conventionele benaderingen, omdat ze onafhankelijk zijn van de beeldvormings methode, waarbij slechts één brightfield-vlak vereist is. Het eerste programma neemt een 4D-veld met meerdere embryo's (GUI-optie of broncode embryoCrop.py) of meerdere 4D-velden met meerdere embryo's (screenCrop.py), snijdt embryo's goed en oriënteert ze in een anterieure-posterieure configuratie. Deze Programma's geven gebruikers ook de mogelijkheid om achtergrond aftrekken, drift correctie en demping correctie uit te voeren. De resulterende bestanden zijn uniform voorbewerkte, strak bijgesneden TIFF-stapels voor elk embryo dat kan worden geamendeerbaar voor geautomatiseerde beeldanalyse. Om het eenvoudiger te maken om alle embryo's voor elke aandoening te bekijken, is een ImageJ-macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) geschreven, die alle embryo's van een bepaalde voorwaarde samenstelt tot één TIFF-stack en matrices van brightfield-afbeeldingen en projectie kleur voor maximale intensiteit ( RGB)-overlays, naast elkaar, voor elk embryo. De methoden werden gevalideerd door ze te gebruiken om embryonale ontwikkeling te karakteriseren na een knock-down van 40 eerder beschreven ontwikkelings genen in een paar op maat gebouwde stammen die fluorescerende markers uitdrukken die geoptimaliseerd zijn om belangrijke aspecten van kiem-laag te visualiseren specificatie en morfogenese10,11. Samen zullen de semi-hoge doorvoer embryo Imaging protocol en beeldverwerkings hulpmiddelen hogere sample-getalexperimenten en grootschalige screening-inspanningen mogelijk maken die gericht zijn op het begrijpen van ontwikkelingsprocessen. Daarnaast zullen deze stammen ook een efficiënt middel zijn om de effecten van moleculaire verstoringen op embryogenese te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding van C. elegans embryo's voorbeeld vorming met semi-hoge doorvoer

Opmerking: Het doel van dit deel van het protocol is het laden van een populatie van semi-gesynchroniseerde (2 tot 8-cel stage) C. elegans embryo's, ontleed uit geschikte marker stammen (Figuur 2), in een glazen bodem 384-well plate voor Imaging. Andere plaat formaten kunnen ook werken, maar de 384 well Plates hebben de voorkeur omdat de kleine put de verspreiding van embryo's beperkt tot een relatief klein gebied, wat de identificatie van velden met meerdere embryo's voor timelapse-beeldvorming vergemakkelijkt. Een ruwweg synchroniseren van de embryo's zorgt ervoor dat het volledige verloop van de ontwikkeling wordt opgevangen voor elk van de embryo's in een veld.

  1. Bereid 5 – 10 mL van 0,1 mg/mL oplossing van tetramisole hydrochloride (TMHC) anestheticum opgelost in Ice Cold M9 medium (0,45 M na2HPO4∙ 7h2O, 0,11 m KH2PO4, 0,04 M NaCl, 0,09 m NH4cl) te gebruiken tijdens dissectie en imaging. Deze media omvatten een verdoving om ervoor te zorgen dat bewegend gearceerde larve de beeldvorming van embryo's in eerdere ontwikkelingsstadia niet verstoren.
    Opmerking: Als u de gereedschappen voor uitsnijden en visualisatie gebruikt om gegevens te analyseren die zijn verkregen met behulp van standaard agarose pad-bevestigingsmethoden, gaat u verder met sectie 3 hieronder.
  2. Aliquot 70 μL van de bereide oplossing in afzonderlijke putjes van een glazen bodem 384-putplaat met één goed voor elke toestand; Vermijd de buitenste twee rijen van de plaat om randeffecten te voorkomen.
    Opmerking: Het is handig om omringende putten te maskeren met behulp van zelfklevende PCR-plaat folie (zie voorbeeld in Figuur 1D) dit behoudt aangrenzende putten voor toekomstige experimenten en maakt het gemakkelijker om geschikte putten te lokaliseren onder de dissectie Microscoop. Houd de plaat en de resterende oplossing op het ijs als de oplossing eenmaal is opgegeven.
  3. Het genereren van mond pipets voor het overbrengen van embryo's uit de depressie dia (waar de zwangere hermaphrodites worden ontleed) naar de putten. Trek capillaire pipets (25 μL gekalibreerde pipets) over een vlam en breek om een fijn taps toelopende uiteinde te genereren (Figuur 1D). Er is één pipet per aandoening nodig om kruisbesmetting te voorkomen; Gooi het pipet na gebruik weg.
  4. Gebruik fijne pincet voor het overbrengen van ~ 10 zwangere volwassenen onder een dissectie-bereik in 150 μL van de ijskoude tmhc-oplossing die voor elke aandoening op een depressie dia wordt vermeld. Met behulp van de pincet en een scalpel, ontleden de wormen om de embryo's vrij te geven.
  5. Plaats een getrokken capillaire pipet in de aspirator-bijlage bij de pipets en de mond pipet om alle 2 tot 8-celfase embryo's over te brengen naar een individueel goed van de bereide plaat (Figuur 1D). Vermijd het overdragen van embryo's in de late fase en dissectie puin. Onderzoek onder een dissectie bereik en als er verzamelingen van embryo's aanwezig zijn, pipetteer dan op en neer of tik op klonten embryo's met pipetpunt om te dispergeren.
    Opmerking: Om kruisbesmetting te voorkomen, reinig de dissectie apparatuur en gebruik een verse mond pipet tijdens het verplaatsen tussen de omstandigheden. Bewaar plaat op ijs tussen dissecties.
  6. Zodra de wormen uit alle omstandigheden zijn ontleed en embryo's in hun passende put zijn geplaatst, draai de 384-put plaat gedurende 1 minuut bij 600 x g om de embryo's te vereffenen.
  7. Veeg de onderkant van de plaat af met een door ethanol gedrenkt doekje om eventuele resten te verwijderen en plaats de plaat op een confocale Microscoop die is uitgerust met een plaathouder in een temperatuurgestuurde omgeving.
    Opmerking: De stappen die deze methode in detail volgen met behulp van de Lab-installatie; Wijzig de acquisitie voorwaarden om aan de experimentele behoeften en apparatuur te voldoen. Hier wordt een confocale scanner Box uitgerust met een microlens-Enhanced Dual Nipkow Spinning disk, een 512 x 512 EM-CCD camera, een hoge precisie auto-XY-stage (aangewezen resolutie 0,1 μm) en gemotoriseerde z-axis Control (aangewezen resolutie 0,1 μm). Dit systeem wordt bewaard in een kamer van 16 °C, die de Microscoop temperatuur tussen 21 en 23 °C handhaaft tijdens nachtelijke beeldvorming.
  8. Om velden met geschikte embryo's te identificeren, voert u elke put een pre-scan uit met een 10x 0,4 NA objectief en geschikte beeldvormings software. De meest optimale velden zullen meer dan één embryo in de vroege fase bevatten, dat zich in hetzelfde brandvlak bevindt als andere embryo's en idealiter een minimaal contact tussen de aangrenzende embryo's zal hebben. Markeer posities van geschikte gebieden.
  9. Om Imaging velden te selecteren, schakelt u over naar de 60x-doelstelling en past u het brandvlak bij elk punt bezoek aan op de juiste sectie van de embryo's. 1 – 4 velden per put worden afgebeeld, voor een totaal van 50 velden in 14 Wells, en elk veld kan bevatten tussen één en vijf embryo's. In totaal worden 4 tot 15 embryo's geselecteerd uit elke voorwaarde voorbeeld vorming met hoge resolutie.
    Opmerking: Een belangrijke variabele bij deze stap is het gebruik van voldoende olie; plaats olie op het doel, bezoek punten in elk putje om de olie rond het oppervlak van alle putjes te verspreiden en breng vervolgens een extra druppel olie aan op de doelstelling voorafgaand aan de selectie van velden.
  10. Beeld de geselecteerde velden met behulp van een 60x 1,35 NA doelstelling om 18 z secties te verwerven bij 2 μm intervallen elke 20 min voor 10 h. De beeldvormende condities met behulp van de kiemen-laag en morfogenesis reporter stammen zijn als volgt: brightfield, 90% vermogen, 25 MS, 20% Gain; 488 nm, 100% vermogen, 200 MS, 60% winst; 568 nm, 45% vermogen, 150 MS, 60% Gain.
  11. Nadat de beeldvorming is voltooid, evalueer dan de embryonale letaliteit door een lage vergroting (10x 0,4 NA objectief) hele put brightfield-scan ~ 20 – 24 h na het begin van de nachtelijke beeldvorming.

2. embryonale letaliteit scoren

  1. Gebruik de na-run 10x gescande velden, evalueer embryonale letaliteit en larvale defecten door het tellen van gearceerde wormen en niet-uitgekomen embryo's voor elke put.
  2. Scoor ongehatste embryo's als embryonaal dodelijk. Uitsluiten van aangehouden één-op-vier-celfase embryo's van letaliteitstelling, aangezien jonge ontleed embryo's soms niet in de eierschaal vorming (als meiose II nog niet compleet is) en permeabiliteit defecten kunnen leiden tot osmotische complicaties tijdens de eerste twee Divisies.
  3. Partituur gedeeltelijk uitgekomen of volledig gearceerde wormen met lichaams morfologie of gedrags gebreken, zoals Dumpy of verlamd, als ' abnormale larve '.

3. geautomatiseerd bijsnijden (Figuur 3A)

Opmerking: De software is ondergebracht op twee locaties: (1) Zenodo herbergt een gebruiksvriendelijke versie van de software12 die geen programmeerkennis vereist. (2) github bevat de broncode voor onze embryoCropUI.py en screenCrop.py software13, die vaardigheid met python vereisen. Gedetailleerde instructies voor het downloaden en het bedienen van beide versies van het programma u hieronder vinden.

  1. Geautomatiseerd bijsnijden met behulp van de uitvoerbare versie van embryoCropUI (gebruiksvriendelijke versie)
    1. Om het embryoCropUI programma te gebruiken, downloadt u eerst het programma van Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
      1. Download de MacOS-of Windows-versie van het programma (Houd er rekening mee dat MacOS X 10.11 of hoger vereist is voor de MacOS-versie).
      2. Download het instructiebestand (GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx), dat stapsgewijze instructies biedt voor het testen en gebruiken van het embryoCropUI-programma.
      3. Download de test_files. zip om te testen of het programma goed functioneert op het platform (zie instructies).
    2. Eenmaal gedownload, unzip en navigeer naar de embryoCropUI uitvoerbaar (... \Embryocropui\_windows\embryocropui\embryocropui.exe) of (... \Embryocropui\_macos\embryocropui\embryocropui.exe). Dubbelklik om te starten (of kies ' openen met '-Terminal) en voer het uitvoerbare bestand van de embryoCropUI uit.
    3. De GUI executable gewassen één 4D gezichtsveld op een moment. Selecteer in de linkerbovenhoek de knop openen om het specifieke veld te laden om te bijsnijden (multi-TIFF). Als u een TIFF-serie bijsnijd met meerdere dimensies (d.w.z. z, time, Channel), laadt u alleen de eerste afbeelding in de reeks in de map (één TIFF-serie per map).
    4. Nadat de afbeeldingen zijn geladen, geeft u de volgende informatie op: aantal z-slices, (Z), aantal tijdpunten (T), aantal kanalen (C), het kanaal dat overeenkomt met DIC of brightfield (eerste = 1, tweede = 2, enz.).
    5. Selecteer extra verwerking om uit te voeren op de afbeeldingen. Het programma biedt drift correctie, achtergrond aftrek, en demping correctie.
    6. Geef parameters op voor achtergrond aftrek en demping correctie om de verwerkings inspanningen in de GUI-prompt te begeleiden. Definieer voor achtergrond aftrekken de grootste functie grootte om de grootte van een betekenisvol signaal weer te geven; deze functie grootte moet niet worden beschouwd als achtergrond en moet een oneven getal waarde zijn. Voer een waarde van 0-1 voor demping correctie. De waarde van de dempings correctie weerspiegelt het percentage van de oorspronkelijke intensiteit dat blijft op de verste diepte van het object dat wordt afgebeeld.
      Opmerking: Achtergrond aftrekken en demping correctie moeten samen worden uitgevoerd.
    7. Geef de volgorde van de installatiekopie verzameling op (d.w.z. Channel-z-time (czt) of z-Channel-time (zct)).
    8. Specificeer de micron per pixel voor de afbeeldingen op basis van de camera die wordt gebruikt.
      Opmerking: Er wordt een slechte afbeelding bijgesneden als de pixelgrootte niet correct is gedefinieerd.
    9. Selecteer uitvoeren in de linkerbenedenhoek. In hetzelfde pad als de niet-bijgesneden map wordt een nieuwe submap met het label bijsnijden gemaakt. bijgesneden versies worden opgeslagen op deze locatie. Afhankelijk van de bestandsgrootte, moet bijsnijden binnen enkele seconden tot minuten worden voltooid.
  2. Geautomatiseerd bijsnijden met behulp van screenCrop.py (batch versie alternatief voor embryoCrop GUI hierboven beschreven;Alleen python-savvy-gebruikers)10,13
    1. Voor het gebruik van screenCrop.py, de python-softwareversie voor het bijsnijden van grotere gegevenssets in een batch-indeling, kloon of download de broncode van github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
    2. Lees de instructies voor het configureren van een juiste virtuele omgeving en volg het bestands naamgevingssysteem dat wordt beschreven; beide zijn gedetailleerd in het Leesmij -bestand in de GitHub-repository: https://github.com/renatkh/embryo_crop/BLOB/Master/README.MD.
    3. Zodra omgevingsvariabelen en naamgevingsconventies goed zijn vastgesteld, opent u parameters.py en screenCrop.py in een editor naar keuze.
    4. Als u instelbare parameters wilt wijzigen zonder de broncode aan te raken, bewerkt u het bestand parameters.py .
      Opmerking: het is ook mogelijk om de parameters direct te wijzigen in de header van screenCrop.py.
      1. Als u het parameters.py-configuratiebestand gebruikt, wijzigt u de instelling use_configure in True. Als u direct bewerken binnen screenCrop.py, laat u de use_configure instelling op false.
      2. Zoek de volgende informatie in het bestand parameters.py en breng wijzigingen aan in de gewenste imaging parameters en bestandsstructuur:
        1. loadFolder (lijn 9): Ga naar het station waarop de bestanden zijn opgeslagen (bijv. Z:/, D://, enz.)
        2. datum (regel 7): Ga naar de map met bestanden voor de Imaging-sessie. Dit wordt ' naam van de experiment-map ' genoemd in het CSV-traceringsbestand (zie instructies).
        3. trackingFile (regel 11): Ga naar het pad naar het CSV-bestand waarin de informatie over het experiment is opgeslagen.
        4. z (lijn 13): instellen als het aantal z-vlakken.
        5. nT (line14): instellen als het aantal tijdspunten.
        6. nWells (lijn 19): instellen als het aantal gebruikte putten.
        7. Pointbezoeken (lijn 20): instellen als het maximum aantal punt bezoeken (per put).
        8. In regel 10 Zoek de locatie die momenteel bezet is door ' CV1000/' en voer de buitenste map in die wordt gebruikt in het bestandspad. Om problemen te voorkomen, gebruikt u de volgende Conventie: ' XXXXXXX/'.
        9. Voer in regel 12 een geldig bestandspad in voor het opslaan van gegevens over de hoogte-breedte verhouding voor bijgesneden gegevens.
        10. In de regels 15, 16, 17 en 18 invoer waar/onwaar voor of de afbeeldingen gaan door de volgende verwerking:
          1. Voer True of False in voor drift correctie op regel 15.
          2. Invoer waar of ONWAAR voor achtergrond aftrekken op regel 16. De grootte van de functie moet empirisch worden bepaald voor verschillende markerings stammen en pixel groottes. In de configuratie hier, de grootte van de functie werd gedefinieerd als 41 voor de kiem-Layer stam en 201 voor de morfogenese stam. Achtergrond aftrekken moet worden gedaan in combinatie met demping correctie.
          3. Invoer waar of ONWAAR voor demping correctie op regel 17.
          4. Invoer waar of ONWAAR voor de anterieure posterieure rotatie op lijn 18.
    5. Als alle wijzigingen zijn doorgevoerd, kan het bijsnijden beginnen. Ga hiervoor naar screenCrop.py en selecteer het pictogram afspelen in de werkbalk, selecteer uitvoeren als > python runin het vervolgkeuzemenu.
    6. Als bijsnijden kan enkele uren in beslag nemen voor een grote gegevensset (50 punt bezoeken 18 z stappen, 3 kanalen, 31 tijdpunten), bijhouden van de voortgang van bijsnijden in het consolevenster. Zodra het bijsnijden is voltooid, zal een klein venster voorvertoningen van de bijgesneden afbeeldingen weergeven voordat het wordt opgeslagen. Voor elke afbeelding zijn er 3 opties:
      1. Opslaan: Druk op de SPATIEBALK om de afbeelding op te slaan als de afbeelding goed wordt bijgesneden zonder dat er interessegebieden worden afgesneden.
      2. X: Druk op X als het beeld interessegebieden lijkt te hebben afgesneden; de afbeelding wordt opgeslagen met een X voor de naam om deze van de andere afbeeldingen te scheiden.
      3. Verwijderen: druk op D om de bijgesneden afbeelding te verwijderen als de afbeelding niet goed wordt bijgesneden of als het embryo niet bevredigend is.
        Opmerking: de afbeeldingen worden opgeslagen in een submap met de naam "bijgesneden" in de map laden (gedefinieerd in regel 9 van het programma).

4. visualisatie (Figuur 4)

Opmerking: OpenandCombine_embsV2. IJM10,12 is een imagej-macro die een eenvoudig te bekijken TIFF-bestand van alle afbeeldingen voor een specifieke stam en conditie zal construeren. Installatie van Fiji/imagej14,15 is vereist. Deze macro wordt uitgevoerd volgens onze bestandsstructuur; het zal moeten worden aangepast om te werken met andere bestandsstructuren. Een handleiding voor de juiste bestandsstructuur en gedetailleerde beschrijving van belangrijke overwegingen vindt u aan het einde van het bestand GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx op de zenodo-repository. Lees deze instructies volledig door voordat u Imaging naar behoren naam en structuur bestanden naar de interface het beste met deze macro. Ter referentie, onze bestandslocatie structuur ziet er als volgt uit:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb # \Target_Emb # _15 Digit unieke id _W # #F # _T # #_Z # #_C #. TIF
dat wil zeggen Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

  1. Download OpenandCombine_embsV2 en GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx van zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
  2. Bereid de volgende informatie voor:
    -De locatie waar de afbeeldingsmappen worden opgeslagen (na bijsnijden).
    -De naam (namen) van de afbeeldingsmap voor de specifieke voorwaarde (n) die moet worden verwerkt (d.w.z. EMBD0002). Dit wordt ' target ' genoemd in het bovenstaande voorbeeld
    -Een 15-cijferige alfanumerieke unieke id die specifiek is voor een bepaald overnight-experiment-deze id is de naam van de map voor gegevens acquisitie (d.w.z. 20140402T140154) en de unieke id is ingebed in de afzonderlijke TIFF-bestandsnaam (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) voor elk embryo dat op die dag is afgebeeld. De macro gebruikt deze id om te controleren op embryo's die op dezelfde datum zijn verworven en kan herhaalde voorwaarden, met afzonderlijke datums, in afzonderlijke ImageJ-bestanden assembleren.
  3. Open ImageJ en sleep het macro bestand OpenandCombine_embsV2. IJMnaar de imagej-balk of open de macro rechtstreeks.
  4. Nadat de macro is geopend, zoekt u de regels 3 en 4. Voer de gegevens die zijn verzameld in (punt 4,2) in volgens de volgende stappen:
    1. Voer in regel 3 (RNAL) de doelnaam in voor de afbeeldingen die moeten worden verwerkt. Invoer van elk doel in de volgende structuur newArray ("XXXXXXXX/"); offertes opnemen. Als u meerdere voorwaarden tegelijk wilt uitvoeren, scheidt u deze met een komma en houdt u alle doelnamen binnen de haakjes (d.w.z. Newarray ("EMBD0000/", "EMBD0001/", "EMBD0002/").
    2. Voer in regel 4 (datum) de 15-cijferige alfanumerieke unieke id in offertes in, bijvoorbeeld Newarray ("20140402t140154").
  5. Druk op uitvoeren linksonder in het macrovenster. Er verschijnt een venster waarin wordt gevraagd naar de buitenste map met de bijgesneden afbeeldingsmappen (opgegeven in 4.4.1) te navigeren.
  6. Als deze optie is geselecteerd, wordt er een ander venster weergegeven waarin de imaging parameters kunnen worden gespecificeerd.
    1. Voer het aantal kanalen in, het aantal Z-segmenten, de tekengrootte voor de tekst die wordt gebruikt bij het labelen van de gecompileerde afbeeldingen en de kleur voor elk van de kanalen.
    2. In-en uitschakel auto in alle kanalen.
  7. Zodra alle parameters zijn opgegeven, klikt u op OK onder in het venster. Het samengestelde bestand zal beginnen te monteren; Dit duurt enkele minuten, per conditie, om te voltooien.
  8. Als u klaar bent, controleert u de bestanden die desgewenst open blijven. Ze kunnen worden gesloten zonder op te slaan, als de macro heeft al de bestanden opgeslagen in een nieuw gecreëerde map met de naam op de volgende manier: naam van de buitenste map (opgegeven in de prompt van sectie 4,5) + "-Fiji-verwerkte-uitvoer" (dat wil zeggen, Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een belangrijke uitdaging bij het karakteriseren van het effect van moleculaire perturbaties op C. elegans embryonale ontwikkeling is dat het ongeveer 10 uur duurt voordat embryo's van het eerste decolleté tot het einde van de rek op 20 °16worden uitgevoerd. Een semi-High-throughput methode waarbij grote cohorten van embryo's tegelijkertijd kunnen worden afgebeeld, is handig voor gebeurtenissen op deze tijdschaal, omdat het beeldvorming van meerdere voorwaarden parallel met een voldoende ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit werk beschrijft een reeks instrumenten en methoden die zijn ontwikkeld om grotere inspanningen mogelijk te maken om de functie van genen in embryonale ontwikkeling in C. eleganste profile eren. Onze semi-High-throughput methode maakt het mogelijk om 3D-timelapse-beeldvorming van embryonale ontwikkeling met 20 minuten resolutie voor 80 – 100 embryo's in één experiment. Hoewel dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met elke gewenste marker stam (en), demonstreert dit werk het potentieel van de methode ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

S.D.O. werd gesteund door het National Institute of General Medical Sciences-gesponsord University of California San Diego Institutional Research en Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. en K.O. werden gesteund door het Ludwig Institute for Cancer Research, dat hen ook onderzoeksmiddelen verschafte om dit werk te ondersteunen. We zijn Andrew Chisholm dankbaar voor zijn advies in de vroege fases van dit project, Ronald Biggs voor bijdragen aan dit project na de initiële methode ontwikkelingsfase, en Dave Jenkins en Andy Shiau voor ondersteuning en toegang tot de Small molecule Discovery beeld systeem met hoge inhoud van de groep.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aspirator Tube AssemblyDrummond Scientific2-000-000
Gekalibreerd Pipet (25 mL)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager SoftwareYokogawa Electric CorpInbegrepen bij CV1000
Conische buis (15 mL)USA Scientific1475-0501
CV1000 MicroscoopYokogawa Electric CorpCV1000
Depressieschuif (3-wel)Erie Scientific1520-006
DissectiemicroscoopNikonSMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJIOpen Sourcehttps://imagej.net/Fiji
M9 BufferLab Preparedhttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifugebuis (1,5 mL)USA Scientific1615-5500
Microseal F-folieverbindingBio-RadMSF1001
NGM PlatenLab Preparedhttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Schaar #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bodem, Glazen BodemGreiner Bio-One781855
Tetramisol HydrochlorideSigma AldirchT1512-10G
Pincet, Dumont #3Electron Microscopy Sciences0109-3-PO
U-PlanApo objectief (10× 0,4 NA)Olympus1-U2B823
U-PlanApo objectief (60× 1,35 NA)Olympus1-U2B832

Referenties

  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
  3. Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948(2012).
  4. Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
  5. Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
  6. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
  7. Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
  8. Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
  9. Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
  10. Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
  11. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Dryad Digital Repository. , (2019).
  12. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Zenodo. , (2018).
  13. Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  16. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
  17. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
  18. Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
  19. Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848(2010).
  20. Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
  21. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
  22. Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
  23. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
  24. Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
  25. Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

3D-time-lapse-beeldvormingembryo-croppingprogrammaImageJ-visualisatiekitfluorescente markerstammenconfocale microscopiegeautomatiseerde data-analyseRNAi-gebaseerde screeningembryo-preparatieprotocol
Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.