Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Summary

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Abstract

C. elegans is het belangrijkste systeem voor de systematische analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen tijdens de embryonale ontwikkeling. Een uitdaging is dat embryogenese dynamisch zich ontvouwt over een periode van ongeveer 13 uur; deze tijdschaal van een halve dag heeft de reikwijdte van experimenten beperkt door het aantal embryo's dat kan worden gefotografeerd te beperken. Hier beschrijven we een semi-High-throughput-protocol dat de gelijktijdige 3D-time-lapse-beeldvorming van ontwikkeling mogelijk maakt in 80 – 100 embryo's bij matige tijdresolutie, van maximaal 14 verschillende omstandigheden, in een enkele nachtelijke run. Het protocol is eenvoudig en kan worden geïmplementeerd door elk laboratorium met toegang tot een microscoop met punt bezoek capaciteit. Het nut van dit protocol wordt aangetoond door het te gebruiken om beeld twee op maat gebouwde stammen uitdrukken fluorescerende markers geoptimaliseerd voor het visualiseren van belangrijke aspecten van de kiem-laag specificatie en morfogenese. Om de gegevens te analyseren, is een aangepast programma dat individuele embryo's uit een breder gezichtsveld in alle kanalen, z-stappen en tijdpunten snijdt en de sequenties voor elk embryo opslaat in een aparte TIFF-stapel gebouwd. Het programma, dat een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI) bevat, stroomlijnt de gegevensverwerking door afzonderlijke embryo's te isoleren, vooraf te verwerken en uniform te oriënteren in voorbereiding op visualisatie of geautomatiseerde analyse. Ook meegeleverd is een ImageJ-macro die individuele embryo gegevens compileert in een bestand met meerdere panelen dat de maximale intensiteit fluorescentie projectie en brightfield-afbeeldingen voor elk embryo op elk tijdstip weergeeft. De protocollen en hulpmiddelen die hierin worden beschreven, werden gevalideerd door ze te gebruiken om embryonale ontwikkeling te karakteriseren na een knock-down van 40 eerder beschreven ontwikkelings genen; deze analyse visualiseerde eerder geannoleerde ontwikkelings fenotypes en onthulde nieuwe. Kortom, dit werk Details een semi-hoge doorvoer imaging methode in combinatie met een bijsnijden programma en ImageJ visualisatietool die, in combinatie met stammen uitdrukken informatieve fluorescerende markers, sterk versnelt experimenten te analyseren embryonale ontwikkeling.

Introduction

De C. elegans embryo is een belangrijk modelsysteem voor mechanistische celbiologie en analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen die embryonale ontwikkeling stimuleren^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Tot op heden is veel van de karakterisering van zowel gebeurtenissen op cellulair niveau als de specificatie van het lot van cellen ....

Protocol

1. voorbereiding van C. elegans embryo's voorbeeld vorming met semi-hoge doorvoer

Opmerking: Het doel van dit deel van het protocol is het laden van een populatie van semi-gesynchroniseerde (2 tot 8-cel stage) C. elegans embryo's, ontleed uit geschikte marker stammen (Figuur 2), in een glazen bodem 384-well plate voor Imaging. Andere plaat formaten kunnen ook werken, maar de 384 well Plates hebben de voorkeur omdat de kleine put de verspreiding van embryo's beperkt tot een relatief klein gebied, wat de identificatie van velden met meerdere embryo's voor timelapse-beeldvorming ve....

Results

Een belangrijke uitdaging bij het karakteriseren van het effect van moleculaire perturbaties op C. elegans embryonale ontwikkeling is dat het ongeveer 10 uur duurt voordat embryo's van het eerste decolleté tot het einde van de rek op 20 °¹⁶worden uitgevoerd. Een semi-High-throughput methode waarbij grote cohorten van embryo's tegelijkertijd kunnen worden afgebeeld, is handig voor gebeurtenissen op deze tijdschaal, omdat het beeldvorming van meerdere voorwaarden parallel met een voldoende .......

Discussion

Dit werk beschrijft een reeks instrumenten en methoden die zijn ontwikkeld om grotere inspanningen mogelijk te maken om de functie van genen in embryonale ontwikkeling in C. eleganste profile eren. Onze semi-High-throughput methode maakt het mogelijk om 3D-timelapse-beeldvorming van embryonale ontwikkeling met 20 minuten resolutie voor 80 – 100 embryo's in één experiment. Hoewel dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met elke gewenste marker stam (en), demonstreert dit werk het potentieel van de methode .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832