Microsatelliet DNA genotypering en flow Cytometrie ploidy analyses van Formalin-vaste paraffine-ingesloten Hydatidiforme molaire weefsels

Samenvatting

Hydatidiforme mollen zijn abnormale humane zwangerschappen met heterogene etiologieën die kunnen worden geclassificeerd op basis van hun morfologische kenmerken en de ouderlijke bijdrage aan de molaire Genomes. Hier worden protocollen van multiplex microsatelliet DNA-genotypering en Flowcytometrie van formalin-Fixed paraffine-ingesloten molaire weefsels gedetailleerd beschreven, samen met de interpretatie en integratie van resultaten.

Samenvatting

Hydatidiform Mole (HM) is een abnormale menselijke zwangerschap gekenmerkt door overmatige trophoblastische proliferatie en abnormale embryonale ontwikkeling. Er zijn twee soorten HM gebaseerd op microscopische morfologische evaluatie, complete HM (CHM) en gedeeltelijke HM (PHM). Deze kunnen verder worden onderverdeeld op basis van de ouderlijke bijdrage aan de molaire Genomes. Een dergelijke karakterisering van HM, door morfologie en genotype analyse, is cruciaal voor patiëntenbeheer en voor het fundamenteel begrip van deze intrigerende pathologie. Het is goed gedocumenteerd dat morfologische analyse van HM onderhevig is aan brede interobserver variabiliteit en niet voldoende is om HM nauwkeurig te classificeren in CHM en PHM en ze te onderscheiden van hydropic niet-molaire abortussen. Genotyping analyse wordt meestal uitgevoerd op DNA en weefsels van formalin-Fixed paraffine-embedded (FFPE)-producten van conceptie, die minder dan optimale kwaliteit hebben en bijgevolg tot verkeerde conclusies kunnen leiden. In dit artikel, gedetailleerde protocollen voor multiplex genotypering en flow cytometrie analyses van FFPE molaire weefsels worden verstrekt, samen met de interpretatie van de resultaten van deze methoden, hun probleemoplossing, en de integratie met de morfologische evaluatie , p57^KIP2 immunohistochemie en fluorescentie in situ hybridisatie (Fish) om een correcte en robuuste diagnose te bereiken. Hier, de auteurs delen de methoden en lessen geleerd in de afgelopen 10 jaar van de analyse van ongeveer 400 producten van conceptie.

Inleiding

Een Mola Mole (HM) is een abnormale menselijke zwangerschap gekenmerkt door abnormale embryonale ontwikkeling, Hyper proliferatie van de trofoblast, en hydropic degeneratie van chorion Villi (CV). In het verleden werd HM gebruikt om te worden onderverdeeld in twee typen, complete HM (CHM) en gedeeltelijke HM (PHM) alleen op basis van morfologische evaluatie¹. Er is echter aangetoond dat morfologische evaluatie alleen niet volstaat om HM in de twee subtypen (chm en PHM) te classificeren en ze te onderscheiden van niet-molaire miskramen^2,3,4.

Omdat CHM en PHM verschillende neiging hebben tot maligniteiten, is het daarom belangrijk om het genotypische type HM nauwkeurig te bepalen om de juiste follow-up en het beheer aan de patiënten te bieden. Bijgevolg zijn in de afgelopen decennia verschillende methodologieën ontwikkeld en geëvolueerd om de ouderlijke bijdrage aan de molaire weefsels te identificeren en een correcte classificatie van HM te bereiken. Deze omvatten karyotype analyse, chromosomale banding polymorfisme, humaan leukocyten antigeen (HLA) serologische typering, restrictie fragment lengte polymorfisme, variabel aantal tandem herhalingen, microsatelliet genotypering, flow cytometrie, en p57 ^KIP2 immunohistochemie. Dit heeft toegestaan nauwkeurige onderverdeling van HM-concepties op basis van de ouderlijke bijdrage aan hun genomes, als volgt: CHM, die diploïde Androgenetische monospermic of diploïde Androgenetische dispermic, en PHM, die zijn triploid, dispermic in 99% en monospermic in 1% van de gevallen^5,6,7,8. Bovendien, er is een ander genotypische type HM dat ontstond in de afgelopen twee decennia, dat is diploïde biparentale. Deze laatste is meestal terugkerend en kan van invloed zijn op één gezinslid (simplex gevallen) of ten minste twee familieleden (familiaire gevallen). Deze diploïde biouderlijke mollen worden voornamelijk veroorzaakt door recessieve mutaties in NLRP7 of KHDC3L bij de patiënten^9,10,11,12. Diploïde biparental HM bij patiënten met recessieve mutaties in NLRP7 kan worden gediagnosticeerd als chm of PHM door morfologische analyse en dit lijkt te zijn geassocieerd met de ernst van de mutaties bij de patiënten^13,14. In aanvulling op de classificatie van HM volgens hun genotypes, de invoering en het gebruik van verschillende genotypering methoden toegestaan het onderscheid van de verschillende molaire entiteiten uit niet-molaire miskramen, zoals aneuploïde diploïde biouderlijke concepties en andere vormen van concepties^5,15. Dergelijke opvattingen kunnen sommige trofoblast proliferatie en abnormale villus morfologie die, tot op zekere hoogte, sommige morfologische kenmerken van HM nabootsen.

Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen te bieden voor multiplex genotypering en flow cytometrie van formalin-Fixed paraffine-ingesloten (FFPE) weefsels, en uitgebreide analyses van de resultaten van deze methoden en hun integratie met andere methoden voor juiste en afdoende diagnose van molaire weefsels.

Protocol

Dit onderzoek werd goedgekeurd door de McGill institutioneel Review Board. Alle patiënten hebben schriftelijke toestemming gegeven om deel te nemen aan de studie en hun FFPE-producten van conceptie (Poc's) te laten ophalen uit verschillende pathologie-afdelingen.

Opmerking: Hoewel er verschillende methoden voor genotypering en ploïdie bepaling doorstroming cytometrie, de protocollen die hier worden beschreven beschrijven één methode van analyse met behulp van één platform voor elk.

1. genotypering

1. Selectie van het beste FFPE-blok
   1. Bereid voor elk FFPE-product van conceptie (POC) 4 μm-dik hematoxyline en eosine (H & E) bevlekt secties zoals beschreven in de paragrafen 1,2 en 1,3, één voor elk beschikbaar blok, voor morfologische evaluatie door microscopie.
   2. Gebruik de H & E-dia's en een lichtmicroscoop, selecteer het FFPE-blok met de grootste hoeveelheid chorion Villi (CV), en indien mogelijk, het blok dat CV heeft gescheiden van, en niet vermengd met, maternale weefsels.
2. Snij
   1. Plaats het gekozen blok op ijs gedurende 15 minuten om het snijden te vergemakkelijken.
   2. Pas de microtoom aan om secties te snijden die 4 μm dik zijn voor microscopische morfologische evaluatie en 10 μm dik voor DNA-extractie.
   3. Plaats het koude blok in de microtoom en snijd één deel van elk blok voor H & E kleuring en 10 − 30 secties van het gekozen blok, afhankelijk van de hoeveelheid CV in het blok, voor DNA-extractie.
      Opmerking: Voor blokken die vol CV zijn, zijn 10 secties voldoende voor DNA-extractie. Als slechts ongeveer 10% van het blok CV bevat terwijl de rest moeder weefsels zijn, dan zijn 20 − 30 secties nodig om voldoende hoeveelheden DNA te garanderen.
   4. Gebruik de Tang en breng elke sectie over naar een waterbad van 45 °C. Pak het gedeelte van het waterbad met een positief geladen glijbaan (tabel met materialen) die eerder is geëtiketteerd met het monster identificatienummer met behulp van een potlood.
   5. Plaats de dia's met de secties in een oven bij 65 °C, zodat de secties aan de dia's kunnen voldoen. Houd de glaasjes voor H & E in de oven gedurende 25 min. Houd de glaasjes voor DNA-extractie in de oven gedurende 20 min.
      Opmerking: De kortere incubatietijd maakt de weefsels iets minder hecht aan de glijbanen en vergemakkelijkt daardoor het verwijderen van de maternale weefsels.
3. H & E kleuring
   1. Laat de dia's afkoelen tot kamertemperatuur (10 min).
   2. Bereiding van het reagens
      1. Eosin Y werkoplossing voorbereiden (0,25%) volgens tabel 1. Meng goed en bewaar bij kamertemperatuur.
      2. Bereid werken hematoxyline-oplossing door verdunning van de stamoplossing van HEMA oxylin 5x in water (d.w.z. Meng 80 mL water met 20 mL hematoxyline).
         Opmerking: Wikkel stockoplossing van hematoxyline in folie voor opslag.
   3. Bereid de kleurings potten met de juiste reagentia onder een rook afzuigkap volgens tabel 2.
   4. Voer de H & E-kleuring uit door de dia's in de juiste kleurings potten voor de juiste periode volgens tabel 2in te voegen.
   5. Monteer de 4 μm-secties voor morfologische analyse met afdekmedium en dekglaasje met glazen dekstroken (tabel met materialen).
      Opmerking: De 10 μm-secties voor genotypering mogen niet worden afgedekt.
   6. Laat de 10 μm-delen onder de damp afzuigkap minimaal 3 uur staan, zodat de giftige xyleen-geurtjes kunnen verdrijven.
      Let op: Alle kleurings stappen moeten worden uitgevoerd onder een rook afzuigkap. Xyleen producten moeten te allen tijde onder de motorkap worden gehouden omdat xyleen geurtjes giftig zijn. Bovendien moeten xyleen en hematoxyline in speciale containers worden weggegooid. Zodra deze containers vol zijn, moeten ze worden weggegooid zoals aanbevolen door de veiligheidsorganisatie van het laboratorium.

Reagens	Hoeveelheid
Eosin Y stamoplossing (1%)	250 mL
80% ethanol	750 mL
Ijsazijn (geconcentreerd)	5 mL

Tabel 1: Eosin Y werkoplossing (0,25%) Voorbereiding.

Gebruikte reagens (100 mL per bak)	Duur
1) xyleen	5 min.
2) xyleen	5 min.
3) 100% ethanol	2 min.
4) 95% ethanol	2 min.
5) 70% ethanol	2 min.
6) 50% ethanol	2 min.
7) gedistilleerd water	5 min.
8) hematoxyline	4 min.
9) gedistilleerd water	5 min.
10) eosine	1 min
11) 95% ethanol	5 min.
12) 100% ethanol	5 min.
13) xyleen	5 min.
14) xyleen	5 min.

Tabel 2: reagentia en duur voor het H & E-kleurings protocol.

4. Isolatie van CV
   1. Onder een lichte stereomicroscoop, gebruik de Tang en kleine stukjes water-bevochtigde papieren doekjes (tabel van materialen) om ongewenste maternale weefsels van H & E-gekleurd 10 μm dikke delen af te scheen.
      Opmerking: Het uiteindelijke doel is om alleen CV of foetale membranen (indien aanwezig) op de dia's te houden en dus alle andere weefsels te verwijderen. Deze stap kan veel tijd en geduld nodig hebben, afhankelijk van het blok, omdat het zorgvuldige aandacht voor details vereist.
   2. Heb een tweede persoon Controleer de glaasjes na de reiniging om ervoor te zorgen dat ze vrij zijn van maternale weefsels.
   3. Maak foto's van de gereinigde dia's of Documenteer het volgende om te helpen met gegevens interpretatie: 1) of het weefsel moeilijk was schoon te maken, hemorragische, of zeer schoon, 2) het aantal gebruikte secties, en 3) de geschatte hoeveelheid gereinigde weefsels.
      Opmerking: afbeelding 1 geeft een voorbeeld van een dia die gemakkelijk te reinigen is. Voor een blok dat ruwweg deze hoeveelheid CV bevat, zijn 10 secties voldoende voor DNA-extractie. De Slide in Figuur 2 heeft zeer weinig CV die vermengd zijn met maternale weefsels, waardoor het erg moeilijk en tijdrovend is om schoon te maken. Voor een blok dat ruwweg deze hoeveelheid CV bevat, zijn 30 secties nodig voor DNA-extractie.
   4. Verzamel het CV met kleine bevochtigde stukjes papieren doekjes. Met behulp van de pincet, scheur een klein stukje uit de vochtige papieren doekjes en gebruik het om het CV te verzamelen.
   5. Plaats de stukjes papieren doekjes met hun bijgevoegde CV in een gelabelde 1,5 mL Tube.
   6. Minimaliseer de hoeveelheid papieren doekjes die in deze stap worden gebruikt omdat te veel de DNA-extractie kolom kan verstoppen en daardoor de uiteindelijke hoeveelheid verzameld DNA vermindert. Gemiddeld, streven naar minder dan zeven kleine stukjes papieren doekjes per monster te gebruiken. Als dat niet mogelijk is vanwege de aanwezigheid van grote hoeveelheden CV, splitst u het monster tussen twee buizen om de extractie te vergemakkelijken.

Figuur 1: representatieve dia voor genotypering. Top: een dia die moet worden "gereinigd" om vrij van maternale weefsels te worden. Onder: dezelfde dia die wordt weergegeven nadat deze is gereinigd en bevat nu niets anders dan CV voor DNA-extractie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: representatieve dia voor genotypering. Top: een dia die moet worden "gereinigd" om vrij van maternale weefsels te worden. Onder: dezelfde dia die wordt weergegeven nadat deze is gereinigd en bevat nu niets anders dan CV voor DNA-extractie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

5. Volg het Protocol van de DNA-extractie van FFPE Kit (tabel met materialen) om DNA-extractie uit te voeren.
   Opmerking: Sommige kits adviseren het gebruik van 15 − 20 μL elutie buffer voor de uiteindelijke elutie. Uit ervaring werkt elutie met 15 μL elutie buffer goed voor de meeste monsters. Verdunningen kunnen indien nodig uit het stam DNA worden bereid.

6. DNA-kwantificering
   1. Gebruik een Lab-spectrofotometer om 1 μL DNA te laden en meet de extinctie bij 260 nm voor kwantificering.
   2. Plaats 1 μL DNA op een 2% agarose gel en voer gel elektroforese uit bij een spanning van 80 − 100 V voor kwalitatieve evaluatie.
   3. Op basis van de resultaten van de stappen 1.6.1 en 1.6.2, kies het volume van het DNA te gebruiken in de multiplex Short tandem repeat (STR) polymerase kettingreactie (PCR) versterking. Streef ernaar om minimaal 1000 ng DNA te gebruiken in de PCR-amplificatie die volgt.
      Opmerking: Figuur 3 toont representatieve voorbeelden van gels samen met de concentraties van het DNA (gebaseerd op de resultaten van de spectrofotometer) en het volume van de DNA-oplossing dat wordt aanbevolen voor de volgende multiplex Str.

Figuur 3: representatieve gel voor DNA-kwantificering. Inbegrepen zijn de concentraties van elk DNA, gemeten met behulp van een spectrofotometer, en de hoeveelheden die worden gebruikt voor de multiplex PCR. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

7. PCR-versterking
   1. Uitvoeren van fluorescerende microsatelliet genotypering met behulp van een multiplex STR systeem (tabel van de materialen).
   2. Gebruik de PCR-voorwaarden in Figuur 4 voor de PCR-versterking met behulp van het multiplex Str-systeem (tabel met materialen).
      Opmerking: De volgende primers worden gebruikt in dit multiplex STR-systeem: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818 en Penta D.

Figuur 4: PCR-cyclus voorwaarden voor het MULTIPLEX Str-systeem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

8. Het oplossen van de PCR-producten door capillaire elektroforese.
   1. Onderbreek 1 μL van elk versterkt monster in 0,5 μL van de interne standaard rijstrook van het multiplex systeem en 9,5 μL sterk gedeïoniseerd formamide (tabel met materialen).
   2. Voer monsters uit via een capillaire elektroforese-instrument (tabel met materialen) met behulp van een geschikte scheidings matrix (Inhoudsopgave) voor het instrument en de kleurenset van het multiplex systeem.

9. Data-analyse
   1. Analyseer de gegevens met een DNA-fragment analyse software en vergelijk de POC allelen met de ouderlijke allelen om hun oorsprong te bepalen.
   2. Stel een maat standaard in.
      Opmerking: Hierdoor kan de software de ladder die wordt gebruikt in het multiplex STR systeem herkennen en baseren paren toewijzen aan de amplicons op basis van de ladder. De volgende stappen zijn voor één specifieke software (tabel met materialen), maar kunnen ook helpen bij het instellen van andere soorten software.
      1. Open de software. Klik op Nieuw project starten en vervolgens op nieuwe maat standaard.
      2. Geef de maat standaard een naam (bijv. ABI_600).
      3. Voer in het vak naam nieuwe standaarddefinitie invoeren: Voer het volgende in: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. Klik vervolgens op grootte (s) toevoegen.
         Opmerking: de ingevoerde getallen worden weergegeven onder het vak rechts, met de naam huidige standaarddefinitie (Zie Figuur 5).
      4. Klik op Opslaan.
   3. Als u een bestand wilt importeren en analyseren, klikt u op bestanden toevoegenen kiest u het FSA-bestand dat moet worden geanalyseerd. Klik op geselecteerde bestanden toevoegen en vervolgens op OK. Voer vervolgens de volgende stappen uit:
      1. Zoek de kolom grootte standaard en kies ABI_600 (of welke naam dan is gegeven aan de maat standaard).
      2. Onder analysemethode, klik op formaat standaard-NPP en klik vervolgens op de groene analyseren knop.
      3. Het bestand is nu gereed voor weergave. Pas de weergaveopties aan om de gegevens naar wens te bekijken.
   4. Problemen oplossen-analysemethode
      Opmerking: De software kan soms niet pieken identificeren en correct uitlijnen. Dit gebeurt wanneer de pieken ofwel te laag of te hoog zijn. De volgende twee analysemethoden kunnen hiervoor worden gecorrigeerd en moeten worden beproefd voordat een monster opnieuw wordt getest.
      1. Analysemethode 1 voor hoge pieken:
         1. Klik op Nieuwe analysemethode en noem het hoge pieken (of een andere naam als per persoonlijke voorkeur).
         2. Klik op bereik en vervolgens op gedeeltelijke bereik voor de analyse en grootte. Typ vervolgens 100 voor het beginpunt en de Begingrootte.
         3. Voer voor het Stop punt10.000 in. Voer voor de Stop grootte1000 in.
         4. Klik vervolgens op minimale piekhoogten en verander de getallen zodanig dat de piek drempelwaarde voor de kleuren als volgt is: blauw: 50; Groen: 50; Geel: 20; Rood: 100; Oranje: 5000.
         5. Sla de nieuwe analysemethode op.
      2. Analysemethode 2 voor lage pieken:
         1. Klik op Nieuwe analysemethode en noem het lage pieken (of een andere naam als per persoonlijke voorkeur).
         2. Klik op bereik en vervolgens op gedeeltelijke bereik voor de analyse en grootte. Typ vervolgens 100 voor het beginpunt en de Begingrootte.
         3. Voer voor het Stop punt10.000 in. Voer voor de Stop grootte1000 in.
         4. Klik vervolgens op kwaliteits vlaggen en verander het Pass bereik zodanig dat het van 0,5 naar 1leest. Wijzig het bereik van lage kwaliteit zodanig dat het van 0,0 tot 0,0wordt gelezen. Wijziging veronderstellen lineariteit naar de volgende: van (BP) 100,0 naar (BP) 800,0.
         5. Sla de nieuwe analysemethode op.
            Opmerking: Het is nu mogelijk om een bestand opnieuw te analyseren door lage pieken of hoge pieken onder de analysemethode te kiezen en vervolgens op de groene analyze -knop te klikken.

Afbeelding 5: screenshot met de grootte standaard editor. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. stroom Cytometrie

1. Het ideale FFPE-blok kiezen
   1. Gebruik H & E-dia's en een lichte Microscoop om een FFPE-blok te selecteren dat ongeveer 50 − 70% van zijn weefsels bestaat uit CV.
      Opmerking: Figuur 6 is een representatief voorbeeld van een geschikt blok voor Flowcytometrie analyse, omdat het bestaat uit RUWWEG 50% CV (rechter helft van de sectie) en 50% maternale weefsels (linkerhelft). De aanwezigheid van maternale weefsels is belangrijk omdat ze dienen als een interne controle voor de diploïde piek.
   2. Voor blokken die niet de ideale hoeveelheid CV hebben, verrijken voor CV als het snijden wordt uitgevoerd. Om dit te doen, identificeren welke kant van de vers uitgesneden secties bevat meer CV volgens de bijbehorende H & E dia. Op basis van dat, gebruik een Blade om de andere helft die moet worden weggegooid te snijden om te verrijken voor CV.
      Opmerking: afbeelding 7 toont een blok dat niet voldoende CV heeft voor Flowcytometrie analyse. Voor blokken zoals deze moeten de secties zodanig worden gesneden dat de helft met minder CV wordt weggegooid om de hoeveelheid CV met betrekking tot maternale weefsels te verhogen, zoals aangegeven in de figuur. Zorg ervoor dat u meer secties snijdt om te compenseren voor wat wordt weggegooid.

Figuur 6: H &Amp; E-sectie die een POC-blok vertegenwoordigt dat ideaal is voor Flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: H &Amp; E-sectie die een moeilijker blok voor Flowcytometrie vertegenwoordigt. Deze representatieve H & E sectie laat zien dat alleen de onderste helft van deze sectie moet worden gebruikt voor Flowcytometrie analyse, met als doel het verrijken van het CV. Het omlijnde gebied, "CV", is meestal opgebouwd uit CV. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Snij
   1. Laat de blokken 15 minuten op ijs staan om het snijden te vergemakkelijken.
   2. Gebruik het best mogelijke FFPE-blok, snijd vier secties van 50 μm dik (of 2 100 μm dikke secties) met behulp van een microtoom.
      Opmerking: Voor flow cytometrie is het beter om dikkere secties te hebben.
   3. In het geval dat een ideale FFPE blok is niet beschikbaar, streven ernaar om de verhouding van CV naar maternale weefsel niettemin te behouden. Bijvoorbeeld, als slechts 30% van het blok bestaat uit CV terwijl de rest maternale weefsels heeft, verwijder dan ten minste de helft van het gedeelte dat de maternale weefsels bevat en gebruik meer secties om te compenseren (Zie Figuur 7).
   4. Plaats de delen in gelabelde buisjes van 15 mL.
      Opmerking: Zorg ervoor dat u tape over de labels, omdat de organische reagentia gebruikt in de volgende stap kunnen oplossen en verwijderen van inkt.
3. Flow cytometrie Protocol van FFPE weefsels
   1. Deparaffinisatie en rehydratatie
      1. Voer de volgende wast (tabel 3) uit onder een rook afzuigkap.
      2. Vul de buis van 15 mL met 6 mL van het juiste reagens, volg de in tabel 3 aangegeven bestelling, laat de secties in de reagentia voor de respectieve duur staan en verwijder vervolgens het reagens met behulp van vacuüm afzuiging en een glazen Pasteur-pipet.
      3. Dompel de Pasteur-pipet tussen elke stap eerst in 70% ethanol, vervolgens in gedistilleerd water, en ga vervolgens verder met de volgende stap.
      4. Wees zeer voorzichtig niet te verwijderen stukjes weefsel samen met het reagens. Kantel de 15 mL buis naar een hoek van 60 graden om de zuigkracht van het vloeistof reagens te vergemakkelijken zonder het tekenen van weefsels.
         Let op: De afgedankte vloeistoffen bevatten xyleen en moeten worden afgevoerd in recipiënten voor xyleen afval.
   2. Voorbereiding van de oplossing
      1. Bereid citraat oplossing door 2 g citroenzuur op te lossen in 1 L dubbel gedestilleerd water. Breng de pH naar 6. Bewaren bij 4 °C.
      2. Bereid pepsine oplossing door het oplossen van 0,01 g pepsine in 2 mL 9 delen per duizend NaCl, pH 1,64. Dit is voor één monster.
         Let op: Pepsin is giftig en kan gemakkelijk dispergeren en in de lucht worden. Draag een masker bij het hanteren van pepsine in poedervorm en veeg het werkgebied na gebruik af.
      3. Propidium jodide (PI)-ribonuclease een oplossing voorbereiding van één monster.
         1. Meng 50 μL PI met 450 μL PBS (om 10x te verdunnen).
         2. Voeg 50 μL ribonuclease A (1 mg/mL) toe aan het mengsel. Blijf te allen tijde verpakt in folie.
   3. Spijsvertering en kleuring
      1. Voeg 4 °C citraat oplossing toe aan de 15 mL buizen en plaats vervolgens in een waterbad van 80 °C voor 2 uur.
      2. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur (15 min). Verwijder de citraat oplossing.
      3. Voeg 6 mL 1x PBS, Vortex, en wacht 1 − 2 min zodat de weefsels te vestigen op de bodem. Verwijder de 1x PBS met behulp van vacuüm afzuiging en een glazen Pasteur pipet.
      4. Voeg 1 mL pepsine oplossing (voorverwarmd tot 37 °C) toe en plaats in een droogbad van 37 °C gedurende 30 min. Vortex elke 10 min. bereid de PI-ribonuclease een oplossing voor in de laatste 10 minuten van deze incubatie.
      5. Voeg 6 mL 1x PBS, Vortex, en wacht 1 − 2 min zodat de weefsels te vestigen op de bodem. Verwijder de 1x PBS met behulp van vacuüm afzuiging en een glazen Pasteur pipet.
      6. Voeg 550 μL van de PI-ribonuclease een oplossing toe en plaats de monsters gedurende 30 minuten in een droogbad van 37 °C.
         Opmerking: Op dit punt kunnen de monsters worden verpakt in folie en 's nachts bij 4 °C tot de volgende ochtend.
      7. Filtreer de oplossing door een 48-μm filtratie-gaas. Vang het filtraat op in polystyreen buizen met ronde bodem, die kunnen worden gebruikt met de flow-cytometer. Gebruik de tang om een 5 cm x 5 cm stukje filtratie gaas in het bovenste deel van de buis te plaatsen, zodat de vloeistof door het gaas en in de buis kan worden gepipeterd.
         Opmerking: De samples zijn nu klaar om te worden uitgevoerd met de flow cytometer. Houd ze verpakt in folie totdat ze klaar zijn om te worden uitgevoerd.
   4. Voer samples uit met een flow cytometer met behulp van de flow flowcytometrieonderzoeken platform technicus van de organisatie.
      Opmerking: Het PE-kanaal wordt gebruikt om het door PI gekleurd DNA te detecteren en de stroomsnelheid moet tijdens de overname worden ingesteld op langzaam . Zorg ervoor dat de spanning zodanig is gekozen dat de diploïde piek ruwweg op 200 ligt langs de PE-A x-as om analyse en interpretatie te vergemakkelijken. Streef ernaar om minimaal 20.000 gebeurtenissen per sample op te nemen.

Gebruikt reagens (6 mL per stuk)	Duur
1) xyleen	2 x 10 min
2) 100% ethanol	2 x 10 min
3) 95% ethanol	10 min.
4) 70% ethanol	10 min.
5) 50% ethanol	10 min.
6) gedistilleerd water	2 x 10 min

Tabel 3: reagentia en duringen voor deparaffinisatie en rehydratatie.

4. Flow cytometrie gegevensanalyse
   1. Analyseer gegevens met een flowcytometry-analyse software (tabel met materialen).
      Opmerking: De volgende stappen zijn voor één specifieke software (tabel met materialen), maar kunnen ook helpen bij het instellen van andere soorten software.
      1. Nadat u de voorbeelden op een flow cytometer hebt uitgevoerd, downloadt u FCS 2,0-bestanden voor analyse.
      2. Open de flow flowcytometrieonderzoeken analyse software, klik op bestand | Nieuw document.
      3. Klik op het histogram pictogram () en sleep de aanwijzer om een rechthoek te maken.
      4. Blader naar het FCS-bestand en klik vervolgens op openen. Klik langs de x-as op FCS-a en selecteer PE-a.
      5. Klik op het pictogram stip plot () en sleep de aanwijzer om een andere rechthoek onder de histogramgrafiek te maken. Blader vervolgens naar het FCS-bestand dat voor het histogram is geselecteerd.
      6. Verander de x-as van de puntplot in PE-A en de y-as naar PE-W.
         Opmerking: afbeelding 8A toont het uiterlijk van de waarnemingspunten op dit punt.
      7. Klik op het regio pictogram () en teken een vak op de puntplot dat begint vóór de diploïde piek (rond 100 op de x-as in Figuur 8B) en die rond 700 op de x-as eindigt, zoals getoond in de stip plot in afbeelding 8 B.
         Opmerking: De diploïde piek in Figuur 8 is ongeveer 200 op de x-as. Dit wordt willekeurig gekozen als de monsters worden opgenomen via de flow-cytometer, gewoon om de analyse en interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken.
      8. Klik op plot | Bewerk regio's/Gatesen typ R0 in de cel naast de cel G0 onder strategie. Klik vervolgens op sluiten.
      9. Klik ergens in het histogram, dan op plot | Plot/overlay opmaken. Selecteer onder Gate G0 = R0 en klik vervolgens op OK.
         Opmerking: Dit is de gating-stap waarmee men de ploïdie-pieken beter kan visualiseren. Het histogram moet er nu uitzien als het histogram in figuur 8b. Het is mogelijk om te spelen met de poort gemaakt (door het verplaatsen van de doos getrokken in stap 2.4.1.7) om zich te concentreren op specifieke gebieden van de stip plot.
      10. Als u de waarnemingspunten wilt labelen, klikt u op het pictogram tekstgebied () en sleept u de aanwijzer om een vak boven aan het document te maken en typt u vervolgens de volgende informatie: patiënt-id, poc-id en het gebruikte blok (omdat er meerdere blokken voor één POC kunnen zijn) , percentage CV aanwezig op het blok, voltage gebruikt voor het uitvoeren van het monster, en de datum.

Afbeelding 8: screenshot met een histogram en een puntplot van een representatief monster dat is onbewaakte (a) en gated (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Resultaten

De complexiteit van molaire weefsels en het feit dat zij verschillende genotypen kunnen hebben, vereisen een strenge analyse en het gebruik van verschillende methoden, zoals morfologische evaluatie, p57 immunohistochemie, microsatelliet genoom, Flowcytometrie en vis. Bijvoorbeeld, één patiënt (1790) werd verwezen met twee PHM die bleken te zijn Triploïde door microarray analyse van de POCs alleen. De patiënt werd daarom gediagnosticeerd met terugkerende PHM. Microsatelliet genoom van haar...

Discussie

HM zijn abnormale menselijke zwangerschappen met heterogene etiologieën en hebben verschillende histologische en genotypische soorten, wat hun nauwkeurige classificatie en diagnose uitdagend maakt. Histopathologische morfologische evaluatie werd vaak onnauwkeurig bevonden en is daarom onbetrouwbaar om HM in CHM en PHM te classificeren en te onderscheiden van niet-molaire miskramen. Daarom, een nauwkeurige diagnose van HM vereist het gebruik van andere methoden, zoals multiplex microsatelliet DNA genotypering, ploïdie ana...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BD FACS Canto II	BD BioSciences	338960
Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer	Applied biosystems	313001R	Service aangeboden door het Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)
Citroenzuur	Sigma	251275
Cytoseal 60, histopathologisch montagemedium	Fisher	23244257
Eosine Y-stockoplossing (1%)	Fisher	SE23-500D
FCSalyzer - software voor flowcytometrie-analyse	SourceForge	-	https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen kit	Qiagen	80234
Pincetten	Fine Science Tools	11295-51	Voor het snijden en de reinigingsprocessen
Glazuur Azijnzuur (geconcentreerd)	Sigma	A6283-500mL
Glasdeksels: Dekglas	Fisher	12-541a
Hematoxylinen	Fisher	CS401-1D
Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide	Thermofisher	4311320
IHC platform: Benchmark Ultra	Roche	-
Kimwipes	Ultident	30-34120
Microtoom	Leica	RM2135
Microtoombladen	Fisher	12-634-1C
Nitex-filternet, 48 μm	Filmar	74011	http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; elke andere filter is geschikt, maar dit is een goedkope en effectieve optie van een niet-onderzoeksbedrijf
p57 antilichaam	Cell Marque	457M
Pasteurpipet	VWR	53499-632
PCR-machine	Perkin Elmer, Applied Biosystems	GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0	Applied Biosystems	4381867	Software voor genotypeanalyse.
Pepsine uit varkensgastrische mucosa	Sigma	P7012
Polystyreen buisjes met ronde bodem	BD Falcon	352058
Positief geladen slides: Superfrost Plus 25x75mm	Fisher	1255015
PowerPlex 16 HS System	Promega Corporation	DC2102
Propidium Jodide	Sigma	P4864
Ribonuclease A uit runderpancreas	Sigma	R4875
Separatiematrix: POP-7 Polymeer	Thermofisher	4352759
UltraPure Agarose	Fisher	16500-500
XYleen	Fisher	X3P1GAL