Methodenartikel

Oprichting en analyse van driedimensionale (3D) organoïden afgeleid van patiënt prostaatkanker Bot metastase Specimens en hun Xenografts

DOI:

10.3791/60367

⸱

3 februari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, University of California, San Diego, 2Moores Cancer Center, University of California, San Diego, 3Department of Medicine, University of California, San Diego, 4Department of Radiation Oncology, University of California, Los Angeles, 5Department of Orthopedic Surgery, University of California, San Diego

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Driedimensionale culturen van patiënt BMPC-specimens en xenografts van botgemetastaseerde prostaatkanker behouden de functionele heterogeniteit van hun oorspronkelijke tumoren, wat resulteert in cysten, sferoïden en complexe, tumorachtige organoïden. Dit manuscript biedt een optimalisatiestrategie en protocol voor de 3D-cultuur van heterogene patiëntafgeleide monsters en hun analyse met behulp van IFC.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Driedimensionale (3D) cultuur van organoïden uit tumorspecimens van menselijke patiënten en door patiënten afgeleide xenograft (PDX) modellen van prostaatkanker, aangeduid als patiënt-afgeleide organoïden (BOB), zijn een onschatbare bron voor het bestuderen van het mechanisme van tumorigenese en metastase van prostaatkanker. Hun belangrijkste voordeel is dat ze de kenmerkende genomische en functionele heterogeniteit van het oorspronkelijke weefsel behouden in vergelijking met conventionele cellijnen die dat niet doen. Bovendien kunnen 3D-culturen van BOB worden gebruikt om de effecten van medicamenteuze behandeling op individuele patiënten te voorspellen en zijn een stap in de richting van gepersonaliseerde geneeskunde. Ondanks deze voordelen, weinig groepen routinematig gebruik maken van deze methode voor een deel vanwege de uitgebreide optimalisatie van BOB cultuur voorwaarden die nodig kunnen zijn voor verschillende patiënt monsters. We hebben eerder aangetoond dat ons BOT-metastase PDX-model voor prostaatkanker, PCSD1, de resistentie van de botmetastase van de donorpatiënt tegen anti-androgeentherapie recapituleerde. We gebruikten PCSD1 3D-organoïden om de mechanismen van anti-androgeenweerstand verder te karakteriseren. Naar aanleiding van een overzicht van de momenteel gepubliceerde studies van PDX- en BOB-modellen beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de 3D-cultuur van BOB met behulp van koepelvormige of zwevende keldermembraan (bijvoorbeeld Matrigel) bollen in geoptimaliseerde kweekomstandigheden. In vivo worden ook steekbeeldvorming en celverwerking voor histologie beschreven. Dit protocol kan verder worden geoptimaliseerd voor andere toepassingen, waaronder westerse vlek, co-cultuur, enz.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Driedimensionale gekweekte organoïden hebben de aandacht gevestigd op hun potentieel om de in vivo architectuur, cellulaire functionaliteit en genetische signatuur van hun oorspronkelijke weefsels1,2,3,4,5, te recapituleren. Het belangrijkste is dat 3D-organoïden die zijn vastgesteld uit tumorweefsels van patiënten tumoren of door de patiënt afgeleide xenograft (PDX)-modellen onschatbare mogelijkheden bieden om mechanismen van cellulaire signalering bij tumorigenese te begrijpen en de effecten van medicamenteuze behandeling op elke celpopulatie te bepalen6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 ontwikkelden een standaardprotocol voor de oprichting van menselijke en muizenprostaatorganoïden, dat op grote schaal is aangenomen op het gebied van urologie. Daarnaast is aanzienlijke inspanning besteed aan verdere karakterisering van 3D-organoïden en om de gedetailleerde mechanismen van tumorigenese en metastasetebegrijpen 4,12,14,15. Naast het eerder vastgestelde en algemeen aanvaarde protocol voor 3D-organoïdenculturen, beschrijven we hier een stapsgewijs protocol voor de 3D-cultuur van bobdo met behulp van drie verschillende domingmethoden in geoptimaliseerde cultuuromstandigheden.

In dit manuscript werden 3D-organoïden opgericht als een ex vivo model van botgemetastase prostaatkanker (BMPC). De cellen die voor deze culturen worden gebruikt, kwamen uit de Prostate Cancer San Diego (PCSD) serie en werden rechtstreeks afgeleid van botuitgezaaide tumorweefsels van patiënten (PCSD18 en PCSD22) of tumormodellen van patiënt afgeleide xenograft (PDX) (monsters genaamd PCSD1, PCSD13 en PCSD17). Omdat spontane botmetastase van prostaatkankercellen zeldzaam is in genetisch gemanipuleerde muismodellen16, gebruikten we directe intra-femorale (IF) injectie van menselijke tumorcellen in mannelijke Rag2-/-γc-/- muizen om de PDX-modellen van botgemetastase prostaatkanker vast te stellen17.

Zodra 3D-organoïden zijn gevestigd uit heterogene tumorcellen van patiënten of door de patiënt afgeleide xenografts, is het essentieel om hun identiteit als prostaattumorcellen te bevestigen en hun fenotypes in de 3D-organoïde culturen te bepalen. Immunofluorescentiechemie (IFC) maakt de visualisatie van eiwitexpressie in situ in elke cel mogelijk, waarbij vaak de potentiële functies voor specifieke celpopulaties2,4worden aangegeven. In het algemeen zijn IFC-protocollen voor een overgrote meerderheid van de monsters, waaronder weefsels en cellen, eenvoudig en volledig geoptimaliseerd. De celdichtheid en het aantal organoïden kunnen echter aanzienlijk lager zijn dan die van de conventionele cultuur. Daarom vereist het IFC-protocol voor organoïden extra stappen om te zorgen voor een goede verwerking en inbedding in paraffine voor alle organoïden in de monsters. We beschrijven extra stappen voor een agarose pre-inbedding proces en tips om de locatie van gesectioneerde organoïden label op de dia die het slagingspercentage van IFC op organoïden verhoogt vooral wanneer de monsters van organoïden hebben een lagere celdichtheid dan gewenst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Universiteit van Californië San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). IRB #090401 Goedkeuring werd ontvangen van de UCSD Institutional Review Board (IRB) om chirurgische specimens te verzamelen van patiënten voor onderzoeksdoeleinden. Een geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt en een chirurgische bot prostaatkanker metastase specimen werd verkregen uit orthopedischherstel van een pathologische fractuur in het dijbeen. Dier protocollen werden uitgevoerd onder de Universiteit van Californië San Diego (UCSD) dierenwelzijn en institutionele animal care and use committee (IACUC) goedgekeurd protocol #S10298. Cellen van mechanisch en enzymatisch gescheiden tumorweefsel van de patiënt werden intra-femmoreel geïnjecteerd in 6 tot 8 weken oude mannelijke Rag2-/-;γc-/- muizen zoals eerder beschreven17. Xenograft tumor volume werd bepaald met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem en remklauw metingen. Bij tumorgroei tot 2,0 cm (de maximaal toegestane grootte goedgekeurd door IACUC), werd de tumor geoogst voor 3D organoïden vestiging.

OPMERKING: Figuur 1 toont de workflow voor het vaststellen van 3D-organoïden en een protocolnummer voor elke stap van de experimentele procedures.

1. Verwerking van tumorweefsels van patiëntafgeleide xenograft (PDX)

OPMERKING: Dit is een eerste stap voor organoïde vestiging voor een tumor afgeleid van een xenograft muis model. Dit protocol is aangepast van een eerdere publicatie van Drost et al.5 en we hebben de mediavoorwaarden aangepast om serumsuppletie op organoïde media op te nemen.

  1. Verwerk het tumormonster zoals hieronder beschreven.
    1. Hak tumormonsters tot stukken van 1-3 mm3-formaat en vertreer de monsters met 10 mL celdissociatieoplossing voor 45 min bij kamertemperatuur.
    2. Om de spijsvertering te beëindigen, voeg je 20 mL DMEM complete media toe aan de samples.
    3. Filter de suspensie door een 70 μm celzeef. Gebruik een steriele zuigerflens om overgebleven weefsel op de bovenkant van 70 μm celzeef te duwen.
    4. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
    5. Was de celpellet drie keer met verse adDMEM complete media. Overeenkomen met het volume van de media voor wassen en opnieuw suspensie met het in tabel 3voorgestelde mediavolume . Bijvoorbeeld, voor een 24 goed plaat cultuur voorwaarde, het volume voor de was moet 500 μL.
      OPMERKING: Zoals in tabel 3wordt weergegeven, is het protocol van toepassing op verschillende cultuurvoorwaarden.
    6. Bepaal de uiteindelijke celtellingen met behulp van Trypan blauwe kleurstof en een hemocytometer.
    7. Na het verkrijgen van celtellingen, opnieuw opschorten celpellet in 80 μL van 2% FBS in PBS per 2 x 106 tumorcellen.
    8. Voeg 20 μL Muisceluitputtingcocktail toe per 2 x 106 tumorcellen. Meng goed en incubeer gedurende 15 min bij 2-8 °C.
    9. Pas het volume aan op 500 μL met 2% FBS in PBS-buffer per 2 x 106 tumorcellen.
      OPMERKING: Tot 1 x 107 tumorcellen in 2,5 mL celsuspensie kunnen worden verwerkt op één LS-kolom.
    10. Laad de LS-kolommen op de magnetische kolomafscheider en plaats een conische buis van 15 mL op een rek eronder om de doorstroming te verzamelen.
    11. Spoel elke kolom af met 3 mL van 2% FBS in PBS-buffer. Gooi de conische buis weg met de wasstroom-door en vervang door een nieuwe, steriele conische buis van 15 mL.
    12. Voeg de celsuspensie (tot 2,5 mL van 1 x 107 tumorcellen) toe aan de kolom. Verzamel flow-through dat zal de verrijkt met menselijke tumorcellen.
    13. Was de kolom twee maal met 1 mL van 2% FBS in PBS-buffer.
      OPMERKING: Het is belangrijk om wasstappen uit te voeren zodra de kolom leeg is. Probeer ook te voorkomen dat de vorming van luchtbellen.
  2. Aliquot het juiste volume van celvering aan een 1.5 mL buis voor de gewenste opgezette cultuur (Tabel 3).
  3. Centrifugeer de 1,5 mL buis bij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
  4. Verwijder en gooi de supernatant zorgvuldig weg.

2. Verwerking van primaire tumorweefsels van de patiënt

LET OP: Dit is een eerste stap voor organoïde vestiging.

  1. Volg alle stap 1, behalve het uitputtingsproces van de muiscel, wat niet nodig is voor de verwerking van primaire tumorweefsels van de patiënt.

3. Het vormen van een bijgevoegde ronde koepel op de plaat

OPMERKING: Dit manuscript beschrijft drie manieren om een koepel te maken van een mengsel van de celpellet en het keldermembraan (bijvoorbeeld Matrigel) zoals afgebeeld in figuur 1 en figuur 2. In stap 2-4 moeten de cellen en het keldermembraan op ijs worden gehouden om stolling van het keldermembraan te voorkomen.

  1. Zet de celpellet opnieuw op in het juiste volume van het keldermembraan (bijvoorbeeld 40 μL) voor een 24-putplaat(tabel 3).
  2. Pipetteer voorzichtig op en neer om ervoor te zorgen dat de cellen opnieuw goed worden opgehangen in de kelder membraan.
  3. Pipeter het juiste volume(tabel 3) van het membraanmengsel cel-kelder (en optioneel 10 μL adDMEM complete media) in het midden van de voorverwarmde weefselkweekplaat.
  4. Keer de plaat om en plaats de plaat meteen ondersteboven in de CO 2-celkweekincubator op 5% CO2, 37 °C gedurende 15 min. Dit voorkomt dat cellen zich vestigen en vasthouden aan de bodem van de plaat, terwijl het keldermembraan stollen.
  5. Pipeter het juiste volume (tabel 3) van voorverwarmd medium met 10 μM Y-27632 dihydrochloride in elke put.
  6. Plaats de plaat rechts omhoog in de CO 2-celkweekincubator (5% CO2, 37 °C).
  7. Verander de media elke 3-4 dagen. Gebruik na 5-7 dagen kweekmedium zonder 10 μM Y-27632 dihydrochloride om de culturen te behouden.

4. Het vormen van een drijvende koepel van een bijgevoegde ronde koepel op de plaat

  1. Na stap 3.7, los de koepel met behulp van een cel schraper.

5. Vorming van drijvende kralen

OPMERKING: Dit protocol wordt genoemd als drijvende kralen, omdat het mengsel van kelder membraan, media, en organoïden eruit kralen.

  1. Snijd een 2 inch x 4 inch stuk paraffine film.
  2. Plaats de paraffinefilm op de bovenkant van de divots van een leeg kantelrek uit een 1000 μL plastic pipettipbox.
  3. Druk voorzichtig op de paraffinefilm om de divots te traceren met behulp van een gehandschoende wijsvinger, maar zonder de paraffinefilm te doorbreken.
  4. Spray de paraffinefilm met 70% ethanol en zet de UV-lamp in de celkweekkap aan om de voorbereide paraffinefilm minstens 30 min te steriliseren.
  5. Bereid een mengsel van cellen en 20 μL keldermembraan. Zaaidichtheid kan 50.000 - 250.000 cellen per koepel zijn.
  6. Pipeter het mengsel van cellen verwerkt vanaf stap 1 of 2, en 20 μL keldermembraan in de mal van de divot gevormd in de voorbereide paraffinefilm.
  7. Resuspend de cel pellet in kelder membraan en pipet de cel vering in de voorbereide paraffine gefilmd divots.
  8. Plaats de gestold kralen en paraffine film in een 6-goed plaat. Een goed in een 6-put plaat kan passen tot 5 kralen.
  9. Pipetteer 3-5 mL voorverwarmd medium met 10 μM Y-27632 dihydrochloride in elke put terwijl ze kralen voorzichtig van de paraffinefilm borstelen.
    LET OP: Als minimum volume wordt 3 mL aanbevolen. Voor een maximum aantal kralen (N=5) per put wordt 5 mL medium aanbevolen.
  10. Plaats de plaat in een CO2-incubator (5% CO2, 37 °C).
  11. Verander de organoïde media om de 3-4 dagen. Gebruik na 5-7 dagen kweekmedium zonder 10 μM Y-27632 dihydrochloride om de culturen te behouden.

6. In vivo organoïden beeld stiksels met behulp van microscoop8

OPMERKING: Bepaalde microscopen zijn niet in staat om de buitenste omtrek van de celplaat (randwand) te bereiken; daarom raden we aan om de putten dicht bij de omtrek van de celplaat te gebruiken wanneer het beeld wordt gestikt.

  1. Plaats de celkweekplaat in een opwaartse positie in de plaathouder in de Keyence microscoop.
  2. Plaats de lens op het midden van de doelkoepel.
  3. Stel het automatische stikproces in door het aantal frames te selecteren. Voor voorbeelden kan 3 x 3 of 5 x 5 worden gekozen om in totaal 9 afbeeldingen of 25 afbeeldingen te genereren.
  4. Druk op de opnameknop om het beeldvormingsproces te starten.
  5. Open de software voor de beeldviewer en laad een groep foto's die zijn gemaakt door stap 4.
  6. Klik op Afbeeldingsstiksels om een gestikte afbeelding met hoge resolutie te maken.
    OPMERKING: Het vastleggen van seriële 9- of 25-afbeeldingen kan handmatig of automatisch worden uitgevoerd om de cellen te scherpstellen.

7. Organoïde verwerking voor histologie: de agarose spin down methode

OPMERKING: Dit protocol is aangepast van een eerdere publicatie door Vlachogiannis et al.7. We hebben een stap toegevoegd met agarose inbedding om alle populaties organoïden succesvol in te bedden.

  1. Verwijder bestaande media uit de put. Wees voorzichtig niet te zuigen de kelder membraan koepels.
  2. Voeg een gelijke (gelijk aan het volume van de media verwijderd uit stap 1) volume van cel herstel oplossing en uitbroeden voor 60 min bij 4 °C.
  3. Verbreek de kelder membraan koepel met behulp van een pipet en verpletteren de kelder membraan koepel met behulp van een pipet tip. Verzamel de gescheiden koepel- en celhersteloplossing in een buis van 1,5 mL.
  4. Centrifugebij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
  5. Verwijder de supernatant (celhersteloplossing). Sla alle supernatants in afzonderlijke buizen tot het einde wanneer de aanwezigheid van organoïden wordt bevestigd in de laatste pelleting stap.
  6. Voeg het gewenste volume(tabel 3) van koude PBS toe en tpijp voorzichtig op en neer om de pellet mechanisch te storen.
  7. Centrifugebij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
  8. Verwijder de supernatant (PBS).
  9. Bevestig de pellet in een afgestemd volume (bijvoorbeeld 500 μL voor één pellet uit de 24 putplaatkweekconditie, tabel 3) van 4% PFA voor 60 min bij kamertemperatuur.
  10. Centrifugebij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
  11. Verwijder de supernatant (PFA).
  12. Was met afgestemd volume (bijvoorbeeld 500 μL voor één pellet uit de 24 putplaatkweekconditie, tabel 3) van PBS en centrifuge bij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
  13. Bereid warme agarose (2% agarose in PBS).
    OPMERKING: Hier kunnen celpellets voor bevroren secties direct opnieuw worden opgehangen in 200 μL OCT-verbinding zonder verdere stappen in Protocol 7.
  14. De celpellet opnieuw opschorten in 200 μL agarose (2% in PBS).
    1. Onmiddellijk na het toevoegen van agarose, voorzichtig los de cel pellet van de muur van de 1,5 mL buis met behulp van de 25 G naald bevestigd aan 1 mL spuit. Zoals blijkt uit figuur 3, als de celpellet niet fysiek losstaat van de wand van de 1,5 mL-buis, bestaat het risico dat de celpellet geheel of gedeeltelijk verloren gaat tijdens het inbeddingsproces van agarose.
  15. Wacht tot de 2% agarose in PBS volledig gestold is.
  16. Maak het gestolde agaroseblok los van de 1,5 mL buis met behulp van een 25 G naald aan de 1 mL spuit.
  17. Breng het vrijstaande agaroseblok met de celpellet over op een nieuwe 1,5 mL-buis.
  18. Vul de buis met 70% EtOH en ga verder met behulp van het conventionele protocol voor weefseluitdroging en paraffine inbedding.

8. Histologie en immunofluorescerende cytochemie (IFC) van organoïden

  1. Selecteer de dia(s) voor histologie of IFC.
  2. Voordat u het kleuringsproces initieert, zoekt u uit waar de cellen zich op de dia bevinden en teken u met een markering een cirkel rond de cellen op de dia.
  3. Teken de omtrek rond de rand of boarder van de dia en waar cirkels zich op de dia bevinden in een laboratoriumnotitieblok om hun locaties vast te leggen.
  4. Voer de gewenste kleuring uit.
    OPMERKING: Tijdens dit proces verdwijnen gemarkeerde cirkels omdat de reguliere maker niet bestand is tegen de chemicaliën. Zelfs sommige histologie permanente markers kunnen worden gewist tijdens kleuring proces.
  5. Plaats na het kleuringsproces de dia over de tekening in het laboratoriumnotitieblok om de locaties van cellen op de dia te vinden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D-organoïden werden met succes vastgesteld van een patiënt afgeleid xenograft (PDX) model van botgemetastaseerde prostaatkanker (BMPC) evenals rechtstreeks uit de patiënt botuitgezaaide prostaatkanker weefsel(figuur 4). Kortom, onze PDX-modellen van BMPC werden vastgesteld door intra-femur (IF) injectie van tumorcellen in mannelijke Rag2-/- c-/- muizen en vervolgens PDX tumoren werden geoogst en verwerkt zoals beschreven in dit manuscript. Zoals blijkt uit

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D-organoïden afkomstig van patiënt botmetastase prostaatkankercellen zijn nog relatief zeldzaam. Hier beschrijven we strategieën en verder geoptimaliseerd protocol om met succes gevestigde seriële 3D-patiënt afgeleide organoïden (PDOs) van BMPC. Daarnaast worden protocollen beschreven om de organoïden te beveiligen in monsters met een lagere celdichtheid voor IFC- en IHC-analyse. Differentiële fenotypes in de vorm van cyste, sferoïden en complexere organoïden geven aan dat dit protocol kweekcondities biedt die het mogel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sanghee Lee en Christina A.M. Jamieson zijn de gastredacteuren van JoVE Methods Collection.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de Leo en Anne Albert Charitable Foundation en JM Foundation. Wij danken de Universiteit van Californië San Diego Moores Cancer Center leden, Dr Jing Yang en Dr Kay T. Yeung voor het toestaan van ons het gebruik van hun microtoom en Randall Frans, Department of Surgery voor technische expertise.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL PipettmanGilsonF123602
1 mL SyringeBD Syringe329654
1.5 mL tubeSpectrum Lab Products941-11326-ATP083
25G NeedleBD PrecisionGlide Needle305122
4% Paraformaldehyde (PFA)Alfa AesarJ61899
70% Ethanol (EtOH)VWRBDH1164-4LP
A83-01Tocris Bioscience2939
AccumaxInnovative Cell Technologies, Inc.AM105
adDMEMLife Technologies12634010
AgaroseLonza50000
Antibody -for Cytokeratin 5Biolegend905901
Antibody for Cytokeratin 8Biolegend904801
B27Life Technologies17504044
Bioluminescence imaging system, IVIS 200Perkin Elmer IncIVIS 200
Cell Culture Plate - 24 wellCostar3524
Cell Culture Plate - 48 wellCostar3548
Cell Culture Plate - 6 wellCostar3516
Cell Dissociation Solution, AccumaxInnovative Cell Technologies, Inc.AM105
Cell Recovery SolutionCorning354253
Cell ScraperSarstedt83.180
Cell StrainerFalcon (Corning)352350
CO2 incubatorFisher Scientific3546
DAPIVector VectashieldH-1200
DHTSigma-AldrichD-073-1ML
dPBSCorning/Cellgro21-031-CV
EGFPeproTechAF-100-15
FBSGemini Bio-Products100-106
FGF10PeproTech100-26
FGF2PeproTech100-18B
ForcepsDenville ScientificS728696
GlutamaxGibco35050-061
HEPESGibco15630-080
LS ColumnsMiltenyi130-0420401
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS SeparatorMiltenyi130-090-976
MarkerVWR52877-355
Matrigel (Growth Factor Reduced)Mediatech Inc. (Corning)356231
Matrigel (High Concentration)BD (Fisher Scientific)CB354248
Microscope Imaging Software, KeyenceBZ-X800 (nieuwste software) BZ-X700 (oude software)
Microscope, KeyenceBZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)
Mouse Cell Depletion KitMiltenyi130-104-694
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C
OCT CompoundTissue-Tek4583
ParafilmAmerican National CanN/A
Pen-StrepMediatech Inc. (Corning)30-002-CI-1
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)Fisherbrand Redi-Tip21-197-85
Plunger (from 3 mL syringe)BD Syringe309657
Prostaglandin E2Tocris Bioscience2296
R-Spondin 1Trevigen3710-001-01
SB2021190Sigma-AldrichS7076-25MG
Small Table Top CentrifugeThermoFisher Scientific75002426
Water BathFisher Sci2320
Y-27632 DihydrochlorideAbmole BioscienceM1817

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  2. Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051(2019).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  8. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  9. Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
  10. Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
  11. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  12. Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  13. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).
  14. Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
  15. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  16. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  17. Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275(2014).
  18. Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Prostate Cancer Organoids3D Organoid CulturePatient Derived OrganoidsBone Metastasis ModelsDoming TechniqueBasement Membrane CultureOrganoid Histology ProcessingImmunofluorescent CytochemistryDrug Resistance TestingWestern Blot Applications

Gerelateerde artikelen