Dit protocol werd gegenereerd als een middel om hersenorganoïden te produceren in een vereenvoudigde, goedkope manier zonder exogene groeifactoren of kelder membraan matrix met behoud van de diversiteit van de hersenen cel types en vele kenmerken van cellulaire organisatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een statische zelfsturende methode voor het genereren van hersenorganoïden uit menselijke embryonale stamcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Menselijke hersenorganoïden onderscheiden van embryonale stamcellen bieden de unieke kans om ingewikkelde interacties van meerdere celtypen in een driedimensionaal systeem te bestuderen. Hier presenteren we een relatief eenvoudige en goedkope methode die hersenorganoïden oplevert. In dit protocol worden menselijke pluripotente stamcellen opgesplitst in kleine clusters in plaats van enkele cellen en gekweekt in basismedia zonder een heterologe keldermembraanmatrix of exogene groeifactoren, waardoor de intrinsieke ontwikkelingssignalen de vorm kunnen geven aan de de groei van organoïde. Dit eenvoudige systeem produceert een diversiteit aan hersenceltypes, waaronder glia- en microgliale cellen, stamcellen en neuronen van de voorhersenen, midhersenen en achterhersenen. Organoïden gegenereerd uit dit protocol tonen ook kenmerken van de juiste temporele en ruimtelijke organisatie aangetoond door brightfield beelden, histologie, immunofluorescentie en real-time kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie ( qRT-PCR). Omdat deze organoïden celtypen uit verschillende delen van de hersenen bevatten, kunnen ze worden gebruikt voor het bestuderen van een veelheid aan ziekten. Bijvoorbeeld, in een recent document toonden we het gebruik van organoïden gegenereerd uit dit protocol voor het bestuderen van de effecten van hypoxie op het menselijk brein. Deze aanpak kan worden gebruikt om een scala van anders moeilijk te bestuderen aandoeningen zoals neurodevelopmental handicaps, genetische aandoeningen, en neurologische ziekten te onderzoeken.
Inleiding
Als gevolg van talloze praktische en ethische beperkingen, is er een groot deel van de moeite bij het bestuderen van het menselijk brein. Terwijl studies met behulp van knaagdieren zijn van cruciaal belang voor ons begrip van het menselijk brein, de muis hersenen heeft veel verschillen1,2. Interessant is dat muizen een neuronale dichtheid hebben die minstens 7 keer minder is dan de primatenhersenen3,4. Hoewel primaten zijn dichter bij de mens dan knaagdieren vanuit een evolutionair oogpunt, is het niet praktisch voor de meeste onderzoekers om te werken met hen. Het doel van dit protocol was om vele belangrijke kenmerken van het menselijk brein samen te vatten met behulp van een vereenvoudigde en minder dure methode zonder de noodzaak van een heterologe kelder membraan matrix of exogene groeifactoren met behoud van de hersenen cel diversiteit en cellulaire organisatie.
Formatief werk van het Sasai-lab gebruikte de serumvrije kweek van embryoïde lichamen (SFEBq) methode om twee- en driedimensionale neuronale celtypen te genereren uit gesignaleerde embryonale stamcellen (EsCs)5,6. Veel menselijke hersenorganoïde methoden hebben een relatief vergelijkbaar pad gevolgd van gesignaleerde SER's7,8. In tegenstelling, dit protocol begint met clusters van vrijstaande menselijke EsCS (hESCs), vergelijkbaar met de eerste stappen van het baanbrekende werk van de Thomson en Zhang laboratoria voorafgaand aan de beplating stappen9,10 evenals de eerste stap van de hersenen organoïde protocol van het Pasca laboratorium vóór de toevoeging van exogene groeifactoren11. Kelder membraan matrices (bijvoorbeeld matrigel) zijn gebruikt in vele hersenen organoïde protocollen en het is aangetoond dat een effectieve steiger8. Echter, meest gebruikte kelder membraan matrices komen niet zonder complicaties als ze co-zuiveren met onbekende hoeveelheden groeifactoren met batch tot batch variabiliteit tijdens de productie12. Bovendien kunnen deze matrices beeldvorming bemoeilijken en het risico op besmetting en kosten verhogen.
Terwijl menselijke hersenorganoïden kunnen worden gebruikt om veel vragen te beantwoorden, zijn er bepaalde beperkingen om in gedachten te houden. Voor een, uitgaande van embryonale stamcellen, organoïden lijken meer op onrijpe hersenen dan oude hersenen en als zodanig misschien niet ideale modellen voor ziekten die zich voordoen op oudere leeftijd, zoals de ziekte van Alzheimer. Ten tweede, terwijl ons protocol markers van voorhersenen, midbrain en hindbrain ontwikkeling gevonden die nuttig zijn om het effect van een behandeling of ziekte op cellen uit meerdere hersengebieden in overleg te bestuderen, andere protocollen kunnen worden gevolgd om zich te concentreren op specifieke hersengebieden13,14. Ten slotte is een andere beperking van organoïde modellen die van grootte, terwijl de gemiddelde lengte van een menselijk brein ongeveer 167 mm, hersenorganoïden gemaakt met het gebruik van agitatie groeien tot 4 mm8 en de organoïden gevormd door dit protocol groeien tot 1-2 mm door 10 weken. Niettemin, dit protocol biedt een belangrijk instrument om menselijk hersenweefsel en de interactie van meerdere celtypes te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Stamcelonderhoud
- Handhaven H9 hESCs op een laag van groeifactor verminderde kelder membraan matrix (zie de Tabel van materialen, voortaan gewoon aangeduid als matrix) volgens de instructies van de fabrikant.
- Om een 6-goedplaat of één schotel van 10 cm te coaten, combineert u 100 μL matrix met 5,9 mL ijskoud Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM)/F12 media. Wikkel platen in paraffinefilm en bewaar 's nachts op 4 °C. Gebruik ze op de volgende dag voor het doorgeven van cellen na de overtollige matrix / media is aangezogen.
- Cultuur de cellen week tot week op ongeveer een 1:12 split ratio om de 7 dagen. Houd de cellen met behulp van mTESR-1 media in een 37 °C, lage zuurstof incubator (5% O2, 5% CO2). Ververs media dagelijks. Onkruid uit onderscheiden cellen van de cultuur tussen passages met behulp van glas gereedschap.
- H9-cellen moeten vier tot zes dagen voordat ze worden gebruikt om organoïden te produceren, worden doorgepassaged. De cellen moeten worden doorgestroomd bij ongeveer een verhouding van 1:8 celclusters. Om dit te doen, beginnen met het spoelen van de cellen met DMEM F12 media en scheiden van de cellen met een neutrale protease (bijvoorbeeld dispase, voortaan aangeduid als simpelweg protease), spoelen met DMEM / F-12, en plaat als 30-60 cel clusters over 4 platen (6-goed of 10 cm) op ~ 20% samenvloeiing. Breng ze twee dagen voor de oogst over naar een reguliere couveuse (21% O2, 5% CO2). Platen moeten ~ 80% samenvloeiing bereiken bij het starten van organoïde vorming.
2. Dissociatie van de hESCs voor organoïde cultuur
- Aliquot de protease stock oplossing (5 U/mL).
LET OP: We bevriezen meestal 1 mL aliquots bij -20 °C voor gebruik gedurende enkele maanden. - Verdun de proteasestockoplossing tot de werkconcentratie door 1 mL van de voorraadoplossing plus 5 mL DMEM/F12 toe te voegen voor elke 6-well of 10 cm plaat hESCs.
- Aanzuigen en verwijderen celkweek media, bedek dan de hESCs met de protease oplossing. Plaats platen in de couveuse voor 10-15 min of totdat de randen van de kolonies rond en beginnen te scheiden van de matrix.
- Kantel de plaat, aanzuig de protease-oplossing en was de cellen voorzichtig drie keer met DMEM/F12. Gebruik 2 mL/put voor elke wasbeurt bij gebruik van een 6-put plaat en 6 mL bij gebruik van een 10 cm plaat. Zorg ervoor dat kolonies blijven verbonden aan de matrix bij het uitvoeren van deze stap.
- Voeg ongeveer 1,5 mL verse mTESR-media toe aan elke put (of 5 mL voor een plaat van 10 cm) en spoel de cellen van de plaat met behulp van zachte pipetters.
- Met behulp van een 10 mL pipet, voorzichtig aanzuigen en afzien hESC binnen de plaat totdat ze ongeveer 1/30e van hun oorspronkelijke grootte te bereiken. Kolonieclusters moeten lijken op ~250-350 μm grote vierkanten bij de voltooiing van deze stappen.
3. Generatie organoïden
- Breng cellen over in één ultra-lage bevestigingskolf t75-kolf met 30 mL mL mTESR-media zonder basisfibroblastgroeifactor (bFGF).
- De volgende dag, kantel de kolf (s) zodanig dat de levende cellen pool in de hoek (dit kan 5-10 min op de eerste dag, maar zal sneller als de clusters groter).
OPMERKING: Als er een groot aantal cellen zijn die zich bij deze stap aan de bodem van de kolf hebben gehecht of eventuele volgende stappen, breng de cellen dan over naar een nieuwe kolf. Het is normaal om een hoge populatie van dode cellen voor de eerste twee dagen. Bij het uitvoeren van veranderingen in de media, moet u verwijderen zo veel van de cel puin mogelijk. - Zodra de cellen zich vestigen, aanzuigen uit de media en dode cellen verlaten ongeveer 10 mL van de media met de levende cellen.
- Voeg ~20 mL lage bFGF-media (DMEM/F12 aangevuld met 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamine, 1x NEAA, 0,05% runderserumalbumine (BSA) en 0,1 mM monothioglycerol (MTG) aangevuld met 30 ng/mL bFGF).
- Controleer de cellen op dag 2. Als de meeste cellen er gezond en helder uitzien, is er geen noodzaak om iets te doen. Echter, als meer dan een derde van de cellen donker lijken, vervang de media (met behulp van dezelfde kanteltechniek als in stap 3.2) met ~ 20 mL van lage bFGF media aangevuld met 20 ng / mL bFGF.
- Vervang op dag 3 de helft van de media (met behulp van de kanteltechniek in stap 3.2) door 20 mL lage bFGF-media aangevuld met 10 ng/mL bFGF.
- Vervang op dag 5 de helft van het medium (met behulp van de kanteltechniek in stap 3.2) door 20 mL neurale inductiemedia (NIM: DMEM/F12, 1x N2 supplement, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparine).
OPMERKING: Als er grote clusters van cellen of organoïden zijn die veel groter zijn dan de andere, moeten ze uit de cultuur worden verwijderd. Grootte wordt geschat door uiterlijk onder de microscoop; bijvoorbeeld met behulp van een oculair met reticle. De meerderheid van de organoïden zijn op dezelfde manier formaat (ongeveer 100 ± 20 μm). We verwijderden organoïden die ongeveer 2x kleiner of groter waren dan de andere. - Vervang de helft van het medium (~ 15 mL) (met behulp van de kanteltechniek) door NIM om de andere dag.
- Voeg na 3 weken in de cultuur 100x penicilline/streptomycine toe aan de media (NIM: DMEM/F12, 1x N2 supplement, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparine) bij een eindconcentratie van 1x indien gewenst. Ververs de media om de andere dag.
LET OP: Op deze manier hebben we de organoïden tot 6 maanden in cultuur onderhouden.
4. RNA Extractie en Bereiding
- Haal voorzichtig ongeveer 15 organoïden (afhankelijk van de grootte) uit de kolf met behulp van een 10 mL pipet en plaats in een buis van 1,5 mL.
- Pellet de organoïden voorzichtig in de centrifuge (200 x g voor 1 min) en spoel drie keer met 1x Dulbecco's PBS (DPBS).
- Extract RNA met behulp van gevalideerd systeem of protocol (bijvoorbeeld, RNeasy kit).
- Meet de optische dichtheidswaarde van elk monster op 260 en 280 nm.
- Bereid cDNA voor met behulp van een gevalideerd systeem of protocol (bijvoorbeeld iScript cDNA-synthesekit).
- Voer qRT-PCR uit met behulp van vooraf gevalideerde primers(tabel 1)inclusief ten minste één huishoudingsgen.
5. Immunohistochemie
- Fixatie
- Bereid een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing en plaats deze op 4 °C.
- Met behulp van een steriel scheermes, snijd de punt af van een steriele overdracht pipet.
- Haal organoïden voorzichtig uit met behulp van de gesneden overdrachtpipet, omdat ze gemakkelijk uit elkaar kunnen worden gebroken, vooral wanneer ze groot worden, en leg ze in een 6-put plaat met extra media of DPBS.
- Kantel de plaat, aanzuig de media en vervang door 1x DPBS. Spoel de cellen nog twee keer af met 1x DPBS.
- Vervang de DPBS door 4% PFA-oplossing en plaats op een shaker bij 4 °C.
OPMERKING: Hoewel we 2 dagen (voor kleine organoïden) tot 7 dagen (voor organoïden >3 maanden) hebben vastgesteld, kunnen kortere tijden (bijvoorbeeld 16-24 uur) ook mogelijk zijn. - Bereid 30%, 20% en 10% sacharose oplossingen voor in DPBS.
- Vervang na fixatie in PFA de 10% sacharoseoplossing en plaats op een shaker bij 4 °C gedurende 24 uur.
- Vervang de 10% sacharose door 20% sacharose en plaats op een shaker bij 4 °C gedurende 24 uur.
- Vervang de 20% sacharose door 30% sacharose en plaats op een shaker bij 4 °C gedurende 24 uur.
- Bevroren secties
- Bereid een vlakke laag droogijs en plaats een gelabelde plastic mal op de top van het.
- Giet een dunne laag van optimale snijtemperatuur medium (OCT) in de mal en laat het beginnen te uitharden (binnen een paar seconden).
- Plaats een paar organoïden op de top van de OCT in de mal met behulp van een overdracht pipet met de tip afgesneden en veel aandacht besteden aan de locatie van de organoïden.
- Langzaam toe te voegen in OCT totdat de mal vol is en de organoïden zijn bedekt. Laat het volledig uitharden voor een extra 10 min.
OPMERKING: Hoewel het bevriezen van meer dan 10 min zorgt voor een ideale relatieve plaatsing van meerdere organoïden voor het delen, is het mogelijk om een ethanoldroogijsmengsel of vloeibare stikstof te gebruiken om sneller te bevriezen. - Markeer de relatieve locatie van de organoïden met een marker om het gemakkelijker te maken om ze te vinden bij het snijden.
- Plaats de mallen in een zak of doos en bewaar op -80 °C tot ze klaar zijn om de secties te snijden.
- Snijd met behulp van een cryostat secties van 10 μm en plaats het weefsel op gelabelde, positief geladen dia's.
- Kleuring
- Bereid een blokkeringsoplossing voor (0,3% Triton X-100, 4% normaal ezelserum in PBS).
- Gebruik een hydrofobe pap pen te trekken rond de omtrek van het weefsel.
- Spoel de glijbanen 3 keer af met PBS gedurende elk 5 min.
- Vervang PBS door een blokkeringsoplossing van 1 uur bij kamertemperatuur.
- Vervang de blokkeringsoplossing door antilichaamoplossing (antilichaam bij de juiste concentratie, 0,1% Triton X-100, 4% normaal ezelserum in PBS) bij 4 °C 's nachts.
- Op de volgende dag, was de dia 3 keer met PBS voor 10 min elk.
- Vervang PBS door het juiste secundaire antilichaam (bij de juiste concentratie) verdund in antilichaamoplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Spoel 3 keer gedurende 10 min elke keer met 1x PBS.
- Breng de 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) vlek aan en spoel drie keer gedurende 10 min elk met 1x PBS.
- Breng af hoezen aan de voorzijde van de glijbanen met montageoplossing, laat drogen bij kamertemperatuur in het donker en bewaar in het donker bij 4 °C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont representatieve brightfield beelden van verschillende tijdpunten om aan te tonen hoe de cellen / organoïden eruit zien in de verschillende stadia van het protocol. De hESCs werden verwijderd uit het weefsel cultuur plaat, gebroken in kleine stukjes, en geplaatst in een T75 ultra-lage bevestiging kolf waar ze gevormd bollen. Het is belangrijk op te merken dat de cellen er helder en vergelijkbaar uitzien in grootte, zonder donkere, stervende cellen in de centra van deze clusters...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Net als bij andere organoïde modellen, dit is een kunstmatig systeem dat wordt geleverd met verschillende kanttekeningen. Hoewel er weinig batch aan partijvariatie in termen van algemene uitdrukkingsniveaus was, stelden de individuele organoïden verschillen tentoon. Zo was de locatie van Sox-2 positieve gebieden niet identiek in elke organoïde (figuur 3). Terwijl qPCR is geschikt om te zoeken naar algemene veranderingen in batches van cellen, extra technieken zoals eencellige RNAseq zal worden gebruikt i...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
S.G.K. is lid van SAB voor Dansar IT en Gene-in-Cell.
Dankbetuigingen
Wij danken de Yale Stem Cell Core (YSCC), en het Yale Cancer Center (YCC) voor hulp. We danken Dr. Jung Kim voor zijn neuropathologie beoordeling. Dit werk werd ondersteund door Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, en NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), het Yale Cancer Center en het Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) en een royale onbeperkte gift van Joseph en Lucille Madri.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
Referenties
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31(2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325(2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
