Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform

Summary

Dit protocol bevat instructies voor het implementeren van multiphoton-lithografie om driedimensionale arrays van fluorescerende fiducial markers te fabriceren die zijn ingebed in op poly (ethyleenglycol) gebaseerde hydrogels voor gebruik als referentie vrij, tractiekracht microscopie platforms. Door deze instructies te gebruiken, wordt het meten van de 3D-materiaal stam en de berekening van cellulaire tracties vereenvoudigd om de tractiekracht van hoge doorvoer te bevorderen.

Abstract

Kwantificerende cel-geïnduceerde materiaal vervorming biedt nuttige informatie over hoe cellen voelen en reageren op de fysieke eigenschappen van hun micro-omgeving. Hoewel er veel benaderingen bestaan voor het meten van de cel-geïnduceerde materiaal belasting, hier bieden we een methodologie voor het bewaken van stam met sub-micron resolutie in een referentie vrije manier. Met behulp van een geactiveerd fotolithografisch patronen-proces met twee fotonen laten we zien hoe mechanisch en biologisch actieve afstembaar synthetische substraten met ingesloten arrays van fluorescerende fiducial markers kunnen worden gegenereerd om eenvoudig driedimensionaal te meten ( 3D) materiaal vervormings profielen in reactie op oppervlakte tracties. Met behulp van deze substraten kunnen celspanningprofielen worden toegewezen met behulp van een enkele 3D-afbeeldingsstapel van een cel van belang. Ons doel met deze methodologie is om tractiekracht microscopie een toegankelijker en gemakkelijker te implementeren instrument voor onderzoekers die cellulaire mechanotransductie processen bestuderen, vooral nieuwkomers op het gebied te maken.

Introduction

Traction Force microscopie (TFM) is het proces van het benaderingen van cellulaire tracties met behulp van geïntermuleerde verplaatsings velden van fiducial markers gegenereerd door een aanhanger en contractiele cel. Met behulp van tfm, de invloed van mechanische aanwijzingen in de extracellulaire omgeving op belangrijke cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie, en migratie kan worden onderzocht^{1,2,3,4 ,5,6,7,}

Protocol

1. photopolymerizing een PEGDA base hydrogel

1. Reagentia verzamelen
   1. Verzamel Lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylfosforaat (LAP), 3,4 kDa poly (ethyleen) glycol diacrylaat (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 gelabeld PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 gelabeld PEGDA (PEG-633), en Gepegyleerd RGDS peptide ( PEG-RGDS) uit hun respectieve vriezers en breng elk op kamertemperatuur.
   2. In afzonderlijke Amber micro centrifugebuizen, maatregel 3 mg van de schoot, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633, en 6 mg RGDS peptide.
2. Bereiding van de pre-polymeeroplossing
   1. Los....

Results

Gedurende het hele protocol zijn er een aantal controlepunten die feedback geven om de kwaliteit van de patroon procedure te beoordelen. Om inzicht te geven in het beoordelen van de voortgang bij elk van deze controlepunten, bieden we representatieve resultaten van een daadwerkelijk experiment. De resultaten accentueren de toepassing van dit protocol uitgevoerd op een photopatterned hydrogel bereid voor tfm-analyse van humane navelstreng ader endotheliale cellen (huvecs). De resultaten omvatten onbewerkte afbeeldingsgege.......

Discussion

Het doel van dit protocol is om een workflow te bieden die veel van de problemen die gepaard gaan met het genereren en analyseren van TFM-gegevens verlicht. Eenmaal voorbereid zijn de photopatterned hydrogels eenvoudig te gebruiken, waarbij alleen kennis van standaard weefselkweek praktijken en fluorescentiemicroscopie vereist is. Het referentie vrije aspect maakt onbezorgd navigeren op hydrogels met cel beladen mogelijk en elimineert omslachtige beeldverwerkings stappen zoals beeldregistratie tussen referentie-en vervor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.