Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform

5.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60383

⸱

6 oktober 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol bevat instructies voor het implementeren van multiphoton-lithografie om driedimensionale arrays van fluorescerende fiducial markers te fabriceren die zijn ingebed in op poly (ethyleenglycol) gebaseerde hydrogels voor gebruik als referentie vrij, tractiekracht microscopie platforms. Door deze instructies te gebruiken, wordt het meten van de 3D-materiaal stam en de berekening van cellulaire tracties vereenvoudigd om de tractiekracht van hoge doorvoer te bevorderen.

Samenvatting

Kwantificerende cel-geïnduceerde materiaal vervorming biedt nuttige informatie over hoe cellen voelen en reageren op de fysieke eigenschappen van hun micro-omgeving. Hoewel er veel benaderingen bestaan voor het meten van de cel-geïnduceerde materiaal belasting, hier bieden we een methodologie voor het bewaken van stam met sub-micron resolutie in een referentie vrije manier. Met behulp van een geactiveerd fotolithografisch patronen-proces met twee fotonen laten we zien hoe mechanisch en biologisch actieve afstembaar synthetische substraten met ingesloten arrays van fluorescerende fiducial markers kunnen worden gegenereerd om eenvoudig driedimensionaal te meten ( 3D) materiaal vervormings profielen in reactie op oppervlakte tracties. Met behulp van deze substraten kunnen celspanningprofielen worden toegewezen met behulp van een enkele 3D-afbeeldingsstapel van een cel van belang. Ons doel met deze methodologie is om tractiekracht microscopie een toegankelijker en gemakkelijker te implementeren instrument voor onderzoekers die cellulaire mechanotransductie processen bestuderen, vooral nieuwkomers op het gebied te maken.

Inleiding

Traction Force microscopie (TFM) is het proces van het benaderingen van cellulaire tracties met behulp van geïntermuleerde verplaatsings velden van fiducial markers gegenereerd door een aanhanger en contractiele cel. Met behulp van tfm, de invloed van mechanische aanwijzingen in de extracellulaire omgeving op belangrijke cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie, en migratie kan worden onderzocht1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Helaas, veel bestaande benaderingen kunnen moeilijk te implementeren of vereisen vertrouwdheid met zeer gespecialiseerde analytische en computationele instrumenten waardoor TFM moeilijk voor onervaren onderzoekers om te gebruiken. We beschrijven een methodologie om een TFM-platform te genereren dat een deel van de moeilijkheidsgraad elimineert, terwijl het ook gegevensverzameling met hoge doorvoer oplevert.

Van de bestaande TFM-benaderingen omvat de meest gebruikte voor het kwantificeren van materiaal stam het opnemen van kleine fluorescerende markers (meestal nano-of micrometer-sized fluorescerende kralen) in een vervormbare hydrogel, zoals Polyacrylamide (PAA) of poly (ethyleenglycol) diacrylaat (pegda)13,14,15. Deze kraal-gebaseerde benaderingen bieden de mogelijkheid om dicht cluster fiducial markers rond een cel van belang voor het maximaliseren van de verplaatsing steekproeven. Helaas kan de verdeling van de parels in de hydrogel niet direct worden geregeld, zodat de ruimtelijke ordening willekeurig is. Deze willekeurige plaatsing leidt tot problemen zoals kralen die te dicht bij elkaar zijn om nauwkeurig op te lossen, of zo verspreid dat patches van de ondergrond lage kwaliteitsgegevens opleveren. Het onvermogen om te voorspellen waar fiducial markers liggen in de afwezigheid van cellen creëert ook een beperking dat, voor elke verzamelde set van cel tractie gegevens, ook een extra referentiebeeld van de onderliggende markeringen in een ontspannen toestand moet worden vastgelegd. De referentieafbeelding is vereist, zodat verplaatsing in het beklemtoonde beeld kan worden benaderd als het verschil tussen de gestreste en onbeklemtoonde beelden. Om een ontspannen toestand te bereiken, zijn de cellen die worden gemeten ofwel chemisch ontspannen ofwel volledig verwijderd. Dit proces voorkomt vaak de verwerving van verdere experimentele metingen, remt de lange termijn celstudies, en beperkt de doorvoer. Een referentiebeeld vereist ook beeldregistratie technieken om tegemoet te komen aan drift die kan hebben plaatsgevonden tijdens experimenten, vaak leidend tot omslachtige Handmatige afstemming van stress State beelden om te verwijzen naar afbeeldingen.

Andere tfm-methoden die als referentie vrij worden beschouwd, implementeren enige vorm van controle over de distributie van fiducial markers, hetzij door middel van hoge resolutie lithografie, micro contactafdrukken, of micro molding16,17,18 ,19,20. Referentie vrije TFM wordt bereikt door de veronderstelling dat de ontspannen toestand voor elke fiducial marker kan worden voorspeld op basis van hoe markerings posities werden voorgeschreven tijdens het fabricageproces. Deze methoden maken het mogelijk om de spanningstoestand van een cel volledig vast te leggen binnen één beeldopname waarbij fiducial-markerings verplaatsingen worden gemeten in vergelijking met een impliciete verwijzing dan kan worden afgeleid uit de fiducial marker geometrie. Hoewel consistentie in marker plaatsing meestal wordt bereikt met behulp van deze platforms, hebben ze over het algemeen te kampen met hun eigen tekortkomingen ten opzichte van de veelgebruikte op kraal gebaseerde benaderingen, waaronder: 1) verminderde tractie resolutie; 2) verminderde nauwkeurigheid van verplaatsingen buiten het vliegtuig (in sommige gevallen een volledig onvermogen om te meten); en 3) verminderde aanpasbaarheid van platform substraten en materialen (bijv. ligand presentatie, mechanische eigenschappen).

Om deze tekortkomingen aan te pakken, hebben we een nieuw referentie vrij TFM-platform ontworpen. Het platform gebruikt multiphoton geactiveerde chemie om een klein volume van een de te crosslinken naar specifieke 3D-locaties binnen de hydrogel die dienen als fiducial markers om materiaal belasting te meten. Op deze manier hebben we een platform ontworpen dat vergelijkbaar is met kraal-gebaseerde benaderingen, maar met het aanzienlijke voordeel dat fiducial markers zijn georganiseerd in gerafeld arrays, waardoor referentie vrije materiaal strain tracking mogelijk is. Deze referentie vrije woning biedt vele voordelen. Eerst en vooral, het zorgt voor niet-opdringerige monitoring van cellulaire tractie toestanden (d.w.z., omzeilt de noodzaak om te ontspannen of cellen te verwijderen om referentie posities van ontheemde fiducial markers verwerven). Dit was ons primaire doel bij het ontwerpen van dit systeem, omdat we van plan waren om andere downstream analytische methoden in combinatie met TFM op te nemen, wat moeilijk kan zijn met destructieve end-point TFM-benaderingen. Ten tweede maakt het gebruik van een impliciete verwijzing op basis van gerafeerd arrays een near-complete automatisering van verplaatsings analyse mogelijk. De regelmatigheid van de arrays creëert een voorspelbare workflow waarbij het optreden van uitzonderlijke gevallen (d.w.z. voorbeeld celgegevens met onverwachte artefacten zoals suboptimale markerings afstand of registratie-mismatches) minimaal kan worden gehandhaafd. Ten derde biedt het afzien van de noodzaak om een referentiebeeld te verwerven de vrijheid om veel cellen op een enkel monster gedurende langere tijd te bewaken. Dit contrasteert met traditionele op kraal gebaseerde benaderingen, waarbij, afhankelijk van de betrouwbaarheid van de geautomatiseerde fase bewegingen van de Microscoop, fouten in positionering zich kunnen ophopen en de moeilijkheid van het correct registreren van referentiebeelden naar celspanning vergroten Afbeeldingen. Over het algemeen vergemakkelijkt dit platform een hogere doorvoer bij het verzamelen van cellulaire spanningsgegevens.

Met dit protocol hopen we de lezers vertrouwd te maken met de Two-photon, laser scanning lithografie techniek die we hebben geïmplementeerd om dit referentie vrije TFM-platform te genereren voor het meten van in-plane en out-of-Plane tractie componenten gegenereerd door cellen die zijn geseerd op het oppervlak. Niet gedekt in dit protocol is de synthese van enkele van de monomere componenten. In het algemeen, deze reacties omvatten bijna identieke "One-pot" synthese reactieschema's beschreven eerder21, en alternatieven voor deze producten kunnen ook worden gekocht. We streven er ook naar om lezers vertrouwd te maken met de softwaregebaseerde hulpmiddelen die we hebben gegenereerd om het gebruik van commercieel verkrijgbare laserscanmicroscopen als 3D-afdruk hulpmiddelen te bevorderen en om de analyse van fiducial-markerings verplaatsingen te vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. photopolymerizing een PEGDA base hydrogel

  1. Reagentia verzamelen
    1. Verzamel Lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylfosforaat (LAP), 3,4 kDa poly (ethyleen) glycol diacrylaat (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 gelabeld PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 gelabeld PEGDA (PEG-633), en Gepegyleerd RGDS peptide ( PEG-RGDS) uit hun respectieve vriezers en breng elk op kamertemperatuur.
    2. In afzonderlijke Amber micro centrifugebuizen, maatregel 3 mg van de schoot, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633, en 6 mg RGDS peptide.
  2. Bereiding van de pre-polymeeroplossing
    1. Los de ronde op in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4). Gebruik 200 μL van de opgeloste RONDEOPLOSSING om de PEGDA op te lossen. Gebruik vervolgens 200 μL van de PEGDA-oplossing om de PEG-RGDS op te lossen.
      Opmerking: als het bepalen van de celvorm gewenst is, u het oplossen van PEG-RGD'S in de base hydrogel pre-polymeeroplossing weglaten, omdat deze wordt toegevoegd via Two-photon, laser scanning lithografie verderop in het protocol.
    2. Gebruik 80 μL PBS om de PEG-488 op te lossen. Voeg 2,5 μL van deze oplossing toe aan de pre-polymeeroplossing.
      Opmerking: de PEG-488 geeft de uiteindelijke hydrogel een fluorescerende signaal dat kan worden gebruikt om te navigeren tijdens het patroon en de concentratie kan worden aangepast om de signaalintensiteit te wijzigen.
    3. Filtreer de volledige pre-polymeeroplossing door een 0,2 μm polytetrafluorethyleen (PTFE) filter om eventuele deeltjes te verwijderen die in de oplossing aanwezig kunnen zijn. Als de reactanten correct worden gesynthetiseerd, moet het filter niet verstopt raken.
  3. Photopolymerizing van de base hydrogel
    1. Plaats 3 μL van de pre-polymeeroplossing op een dun plat vel perfluoroalkoxy alkanen (PFA). Plaats platte 150 μm dikke Polydimethylsiloxaan (PDMS) stroken rond, maar niet in contact met, de druppel van pre-polymeeroplossing. Plaats een acrylaat-silanized afdek21,22,23,24 op de pdm's — met de pre-polymeer druppel gecentreerd onder de dekslip — om de pre-polymeer druppel plat te maken tot de dikte van de PDMS spacers.
    2. Stel de ingeklemd pre-polymeeroplossing bloot aan UV-licht totdat een hydrogel volledig is gevormd (ongeveer 1 minuut bij 14 mW/cm2 van 370-400nm licht).
    3. Scheid de dekslip voorzichtig van de PDMS spacers en bevestig deze aan een Petri schaaltje met een open bodem met hoogwaardige, dubbelzijdige acryl lijm. Druk op het klevende contactoppervlak om een volledige afdichting tussen de afdekplaat, lijm en Petri schaal te creëren — met zorg om het glas niet te kraken.
    4. Spoel de hydrogel in de Petri schaal met behulp van steriel gefilterd PBS om biologische en deeltjes verontreinigingen te minimaliseren.
    5. Herhaal stap 1.3.1-1.3.4 zo nodig om het gewenste aantal hydrogels te maken.
    6. Voeg 8 μL NVP toe aan de resterende 800 μL van de RONDEOPLOSSING en houd deze oplossing evenals de onopgeloste PEG-633 tot het patroon klaar is.
      Opmerking: de RONDEOPLOSSING met NVP is zeer gevoelig voor licht en zal polymeriseren als het niet in het donker wordt gehouden. Het verpakken van de buis in aluminiumfolie kan helpen de houdbaarheid te verbeteren.

2. het creëren van patronen instructies

  1. Een binaire afbeelding ontwerpen
    1. Als u een virtueel masker wilt maken voor het voorschrijven van fiducial marker arrays, gebruikt u beeldverwerkings-of tekensoftware om een afbeelding te maken met een hoogte-breedte verhouding van 100:1 (bijv. 2000 pixels lang x 20 pixels breed).
    2. Maak een rij van 100 gelijkmatig verdeelde witte pixels op een zwarte achtergrond gecentreerd langs de lange as van de afbeelding.
    3. Sla deze afbeelding op als *. TIF-bestandstype.
      Notes: als het bepalen van de celvorm gewenst is21,25,26,27,28, maak een extra virtueel masker. Gebruik een vierkant gevormd beeld canvas en Maak positieve witte functies op een zwarte achtergrond. Voor een benadering van een geschikte grootte voor de witte functies (die uiteindelijk de celadhesie zal ondersteunen) wordt ervan uitgegaan dat de totale grootte van de afbeelding gelijk is aan de grootte van het ViewField van de Microscoop die wordt gebruikt voor laser scanning-lithografie.
  2. Een binaire afbeelding converteren naar een digitaal masker
    1. Download de LSM-ROI-Generator functies gratis beschikbaar bij de software repository29.
    2. Open MATLAB en zoek de map van de gedownloade functie bestanden. Eenmaal in de map, open de run_script. m MATLAB script en voer het script.
    3. Selecteer het binaire *. TIF-bestand voor conversie. Selecteer vervolgens een map om regio's bestanden op te slaan.
    4. Voer de gewenste Eindgrootte in microns van de geselecteerde afbeelding in. De invoerafbeelding wordt geschaald en gedimensioneerd zodat deze overeenkomt met deze parameters. Om de gehele afbeelding in het zichtveld van de Microscoop te laten passen, moet de totale grootte van de afbeelding kleiner zijn dan of gelijk zijn aan de grootte van het ViewField van de Microscoop.
    5. Als u één pixel array maakt, moet u in de opties voor ROI-generator het vinkje verwijderen uit het selectievakje Verwijder aankruisvak onder kleine regio's/enkele pixels, om het aankruisvak met het label Squareste controleren en om het vinkje te gebruiken onder Horizontale breuklijnen. Klik vervolgens op OK.
      Opmerking: als u een regiobestand maakt om eencellige patronen te maken, zijn de standaardopties geschikt.
    6. Zoek het resulterende *. ovl-bestand in de eerder opgegeven map. Dit bestand moet naar de Microscoop worden gebracht om de gewenste gebieden te laden die de laser sluiter bedienen tijdens twee-Photon Laser Scanning-lithografie.

3. fabriceren fiducial marker arrays

  1. De basis hydrogel inweken
    1. Bij weinig licht voegt u 200 μL van de LAP/NVP-oplossing toe aan de AF633 (beide voorbereid in stap 1). Meng grondig terwijl u beschermt tegen licht.
    2. Verwijder alle PBS-oplossing uit de Petri schaal met een PEGDA-hydrogel uit stap 1.
    3. Voeg de opgeloste PEG-633 toe aan de hydrogel om een druppel te vormen die de basis hydrogel volledig omvat.
      Opmerking: als het gat in de Petri schaal slechts iets groter is dan de hydrogel, kan het dienen als een goed om de patroon oplossing vast te houden. Zorg er anders voor dat de Afdeklijst volledig droog is voordat u een patronen oplossing toevoegt of het kan de hydrogel aflopen waardoor de hydrogel tijdens het patroon onthydrateert.
    4. Laad de petrischaal op de monsterhouder op de Microscoop en plaats het deksel op de petrischaal. Laat de patroon oplossing minstens 30 min in het donker in de hydrogel weken.
      Opmerking: de microscoop kan tijdens deze week tijd worden ingeschakeld en geconfigureerd. Met behulp van de 488 nm laser om de hydrogel te beelden tijdens het weken is prima.
  2. De Microscoop configureren
    1. Met behulp van een 488 nm Laser lijn en filters geschikt voor de afbeelding AlexaFluor 488, zoek de hydrogel met behulp van de PEG-488 signaal. Blok verzameling van langere emissie golflengten van de detector als deze zal worden verzadigd met signaal van de PEG-633.
    2. Zoek het midden van de hydrogel in het XY-vlak met behulp van verticale en horizontale tegel scans en nul de positie van het podium hier.
    3. Zoek het oppervlak van de hydrogel met behulp van lijn scans en de z-stack functie. Nul de focus positie hier. Het niveau van de hydrogel door het herhalen van deze lijn scans weg van het XY Center om de oppervlakte positie te identificeren en het aanpassen van de set schroeven voor de Microscoop fase.
    4. In de Microscoop-software werkruimte maakt u een afzonderlijk experiment bestand voor photopatterning. Stel de multiphoton-voeding in op 1,8% (15,5 mW bij 740 nm, gemeten aan de achterzijde van het objectief) en de scansnelheid tot 6 (0,1 μm/μs). Pas de grootte van het afbeeldingskader aan in pixels om een pixelgrootte van 0,1 μm per pixel en een hoogte-breedte verhouding van 100:1 te bereiken.
    5. Laad het bestand Regions (*. ovl) gemaakt in stap 2,2 in het tabblad regio's. gebruik een macro om alle regio's in te stellen op acquisitie.
    6. Schakel de z-stack functie in en stel de afstand in op 3,5 μm voor een totale diepte van 28 μm en het totale aantal z-segmenten van 9.
    7. Gebruik de functie posities om specifieke locaties in te stellen op de hydrogel waar de fiducial marker arrays zullen worden gefoopatterned.
      Opmerking: de z-locatie van deze posities dicteert de middelste positie van elke z-stack; Zorg er bij het plaatsen van posities voor dat elke positie garandeert dat het patroon volume zal overlappen met de hydrogel op alle oppervlakte locaties.
    8. Gebruik de tegel functie om extra rijen en kolommen op elke positie op te geven. Wees voorzichtig om overlappende patroon gebieden te vermijden. Zorg er in het ideale geval voor dat de patroon gebieden dicht genoeg zijn om lege en onbruik te plaatsen tussen posities te verwijderen.
  3. Photopatterning de fiducial marker arrays
    1. Als Soak tijd nadert de 30 min Mark, neem opeenvolgende z-stack lijn scans van het oppervlak van de hydrogel elke 5 min om te controleren op zwelling op basis van veranderingen in de locatie van het oppervlak ten opzichte van de nulpunt focus positie.
    2. Als er gedurende een interval van 5 minuten geen verandering in de oppervlakte positie optreedt, laadt u de in stap 3.2.4 gemaakte patronen en voert u deze uit.
    3. Zodra het patroon is voltooid, gebruikt u de 488 nm laser om te controleren of het oppervlak van de hydrogel niet beweegt tijdens het patroon.
      Opmerking: als het oppervlak van de hydrogel zich niet in dezelfde positie bevindt als vóór het patroon, bestaan er verschillende scenario's. De hydrogel had niet bereikt zwelling evenwicht voorafgaand aan patronen, de hydrogel begon te drogen tijdens het patroon, of de Microscoop ervaren z-drift. De bron van deze oppervlakte vertaling moet worden geïdentificeerd en gecorrigeerd in latere patroon uitvoeringen.
    4. Verwijder de hydrogel uit de Microscoop en aspireren de PEG-633 oplossing uit de Petri schaal.
      Let op: de hydrogel is nog steeds extreem gevoelig voor licht. Het is erg belangrijk om de hydrogel in het donker te houden totdat alle spoelen is voltooid.
    5. Spoel de hydrogel 3 keer af met steriel gefilterd PBS, en zorg ervoor dat u het rinsaat volledig verwijdert tussen elke opeenvolgende spoeling. Herhaal deze drievoudige spoeling elke 15 min gedurende 1 uur.
    6. Laat de hydrogel 's nachts in PBS spoelen.
      Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.
    7. Triple spoel de hydrogel af met PBS. Spoel vervolgens snel de hydrogel af met een 200-proof ethanol oplossing, gevolgd door een andere drievoudige spoeling met PBS. Laat de hydrogel niet gedurende langere tijd in 200 proof ethanol zitten.
      Opmerking: sommige onderdelen van de patroon oplossing kunnen uit de oplossing crashen en op het oppervlak van de hydrogel storten en verschijnen als een effen laag fluorescentie (~ 1-5 micron dik) onder 633 nm verlichting. Spoelen met 200 proof ethanol moet deze ongewenste componenten te verwijderen.
  4. Opeenvolgende photopatterning gebruiken om eencellige patronen te genereren (optioneel)
    Opmerking: als de controle over het celspreidings gebied en de vorm gewenst is, kunnen meerdere patronen worden uitgevoerd. De basis gel moet PEG-RGDS hebben weggelaten uit de oorspronkelijke formulering. Het wordt aanbevolen om het patroon van de fiducial marker arrays als laatste te laten uitvoeren om het bleken van de fluorescerende fiducial markers te voorkomen.
    1. Los 20 mg PEG-RGDS op in de LAP/NVP-oplossing die in stap 1 is bereid.
    2. Herhaal de stappen 3,1 – 3,3 met behulp van de PEG-RGDS-oplossing in plaats van de PEG-633-oplossing. Gebruik het juiste regiobestand dat de patronen van één cel definieert (zie stap 2 voor instructies).
      Opmerking: om de arrays van PEG-RGDS patronen te visualiseren, zijn er verschillende opties. Een fluorescerende variant van Peg-Rgds kan worden gebruikt21,30 of de Peg-Rgds kan worden gedoteerd met fluorescerende peg. Aanbevolen: als alternatief kan de 488 nm Laser lijn worden uitgevoerd in tandem met de multiphoton patronen laser naar Bleach Peg-488 signaal in de base hydrogel, het creëren van niet-fluorescerende gebieden die samenvallen met Rgds incorporatie.

4. visualisering van fiducial marker arrays

  1. Het verwerven van een z-stack afbeelding van de gefabriceerde array
    1. Vervang PBS in de Petri schaal met de celmedia die worden gebruikt voor celkweek.
      Opmerking: fenolrood vrije media wordt aanbevolen voor gebruik tijdens beeld verwerving om fototoxiciteit te voorkomen.
    2. Gebruik na 1 uur weken lang een Widefield fluorescentiemicroscoop met een gestructureerde verlichtings module en een objectief lens met een hoge vergrotingsfactor om de hydrogels te visualiseren met behulp van een Filterset die geschikt is voor de fluorescerende fiducial markers.
    3. Verzamel een high-resolution z-stack van beelden (verdeeld 0,4 μm in Z) die ten minste 20 μm diepte van het oppervlak van de hydrogel in de hydrogel in het patroongebied omvat, en zorg ervoor dat de bovengrens van de z-stack ten minste 1-2 beelden bevat die fysiek boven de patroongebied (d.w.z. waar de fluorescerende fiducial markers niet meer zichtbaar zijn en alleen ruis aanwezig is).
      Opmerking: acquisitie van deze afbeeldings stack is nodig om te controleren of alle patronen parameters juist zijn en kunnen worden geanalyseerd naast celgegevens in stap 5,3.

5. uitvoeren van TFM met fotomopatterned hydrogels

  1. Seeding van cellen
    Let op: om de steriliteit te handhaven, volg alle standaard weefselkweek praktijken.
    1. Voorafgaand aan het zaaien van cellen, volgt u de standaardprotocollen voor de respectieve cellijn voor celcultuur en-onderhoud.
    2. Optionele Als de steriliteit van de hydrogel een punt van zorg is, inbroed de hydrogel voor 24 h in de media met antibiotica, gevolgd doorspoelen met normale media.
    3. Voor zaadcellen, moet u eerst de trypsinoïgecellen in het uiteindelijke volume van de in de hydrogel Petri schaal te gebruiken media opnieuw opschorten.
    4. Verwijder alle oplossingen uit de hydrogel schaal en vervang deze door de cel geladen media.
    5. Laat de hydrogel gedurende 10 minuten ongestoord in cel beladen media zitten.
    6. Verplaats de Petri schaal voorzichtig naar een incubator. Houd de cellen in de incubator gedurende 4 uur of totdat de cellen zichtbaar worden vastgehouden.
    7. Vervang de cel geladen media door cel-vrije media om niet-vastgehouden cellen te verwijderen.
  2. Het verwerven van beelden van cellen en de fiducial markers
    1. Stel de temperatuur voor de incubatie kamer op de Microscoop in op 37 °C en CO2 tot 5% en laat de kamer de ingestelde punten bereiken.
    2. Plaats de Petri schaal op de monsterhouder en zoek de patroon gebieden.
    3. Lokaliseer een cel van belang (COI) en verkrijg een verzonden of fluorescerende afbeelding van de COI.
      Notes: deze afbeelding wordt gebruikt om de celgrens te segmenteren tijdens de analyse, zodat de afbeelding de celboarders duidelijk moet visualiseren.
    4. Verkrijg een z-stack van de patroon array onder de COI zoals in stap 4.1.4.
    5. Verkrijg een tweede set van verzonden of fluorescerende beelden van de cel.
      Opmerking: Vergelijk de tweede afbeelding die is ingesteld op de eerste om te bepalen of celbeschadiging als gevolg van fototoxiciteit wordt waargenomen en of de instellingen voorbeeld verwerving moeten worden aangepast. Cellen die na blootstelling krimpen, hebben waarschijnlijk aanzienlijke fototoxische effecten gehad, wat de resultaten kan beïnvloeden.
    6. Herhaal stap 5.2.3-5.2.5 voor elke COI.

6. het analyseren van de beelden

  1. Voorbereiding van de afbeeldingsbestanden voor analyse
    1. Gebruik de gegevens die zijn verzameld in stap 5,2 en bereid een bijgesneden afbeeldingsstapel van het gebied rond een COI voor, zodat de onderste afbeelding (eerste afbeelding) van de stapel het eerste frame vertegenwoordigt waar: (1) > 80% van de patroon markerings kolommen zichtbaar zijn, (2) de bovenste afbeelding (laatste afbeelding) in de stapel bevat niet meer zichtbare fiducial markers (d.w.z. boven het hydrogel oppervlak), en (3) er is ten minste 20 μm niet-gestreste fiducial markers rond de COI.
      Opmerking: het bijsnijden van de afbeeldingen vermindert de rekentijd aanzienlijk tijdens de analyse. De analyse code in latere stappen kan worden uitgevoerd zonder de afbeeldingen te bijsnijden, maar dit wordt niet aanbevolen.
    2. Maak een bijgesneden afbeelding van de verzonden en/of fluorescerende afbeelding zodat deze overeenkomt met de XY-bijsnijden van de stapel in de vorige stap.
    3. Gebruik de bijgesneden verzonden of fluorescerende afbeelding (afhankelijk van wat meer representatief is voor de celvorm) om de afbeelding met de hand te segmenteren (de celrand te traceren) of via beeldverwerkings hulpmiddelen.
    4. Zet deze afbeelding om in een binaire afbeelding waarin het binnenste van de cel zwart is (d.w.z. intensiteit = 0) en het gebied rondom de cel wit is (d.w.z. intensiteit ≠ 0). Sla deze afbeelding op als binair masker. TIF.
    5. Verzamel voor elke COI het afbeeldings stack bestand, het verzonden afbeeldingsbestand en het binaire masker bestand in één map.
  2. Analyse scripts uitvoeren op de afbeeldingen
    1. Kloon of download de TFM-analysefuncties die gratis beschikbaar zijn bij de software repository29. De volledige opslagplaats moet worden gedownload omdat er een groot aantal afhankelijkheden in de submappen.
    2. Open MATLAB en voeg de map en alle submappen van de lokale kloon van de codeopslagplaats toe aan het pad.
    3. Stel de map in de MATLAB-werkruimte in op de maplocatie waar de voorbereide afbeeldingen in stap 6,1 zijn opgeslagen.
    4. Open het script Tracking. m en voer het uit. Wanneer u hierom wordt gevraagd, volgt u de instructies voor het laden van de juiste installatiekopieën, voert u de eerste stappen voor verwerking uit en fout-Controleer het object tracerings algoritme.
    5. Zodra het script is voltooid, opent en voert u de functie Dispshear. m uit. Voor dit script is geen invoer van de gebruiker vereist.
    6. Zodra het Dispshear. m -script is voltooid, opent en voert u disp3D. muit. Volg de instructies als u wordt gevraagd om afbeeldingen te openen.
      Opmerking: tijdens runtime kan het script de gebruiker vragen een lijn te tekenen op een afbeelding van de array met patronen. Deze lijn moet de primaire bewegings-as van de scan Laser weergeven tijdens het patroon en moet worden opgesteld met een rij met gedessineerde fiducial markers. Dit proces instrueert de code welke richting (dat wil zeggen, rijen of kolommen van fiducial markers) waarschijnlijk de meest uitgelijnde rijen van fiducial markers oplevert.
    7. Zodra de Dispshear. m code is voltooid, voert u de code dispsurface. m gevolgd door de code interpFinal3D_2. m . Deze scripts moeten geen invoer van de gebruiker vereist.
      Opmerking: het script interpFinal3D_2. m converteert verplaatsingsgegevens naar oppervlakte tractie met software die extern is verkregen en die eerder is beschreven in31. Om deze externe functies toe te passen, interpoleert de interpFinal3D_2. m verplaatsingsgegevens in uniforme rasters om te fungeren als invoer voor de conversiefuncties. Als u een andere conversiemethode gebruikt of als tractie niet nodig zijn, kan deze stap worden overgeslagen.
    8. Zodra alle scripts zijn uitgevoerd, zorg ervoor dat alle gegevens en uitvoer kunnen worden gevonden in de eerste map.
    9. Herhaal stap 6.2.3 – 6.2.8 voor elke COI.
      Notes: binnen de code repository is er een map met scripts die automatische batchuitvoering van elk van de scripts in een lijst met mappen mogelijk maken. Raadpleeg de automatiseringsscripts zelf (d.w.z. opmerkingen binnen de code) voor instructies over het gebruik ervan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gedurende het hele protocol zijn er een aantal controlepunten die feedback geven om de kwaliteit van de patroon procedure te beoordelen. Om inzicht te geven in het beoordelen van de voortgang bij elk van deze controlepunten, bieden we representatieve resultaten van een daadwerkelijk experiment. De resultaten accentueren de toepassing van dit protocol uitgevoerd op een photopatterned hydrogel bereid voor tfm-analyse van humane navelstreng ader endotheliale cellen (huvecs). De resultaten omvatten onbewerkte afbeeldingsgege...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het doel van dit protocol is om een workflow te bieden die veel van de problemen die gepaard gaan met het genereren en analyseren van TFM-gegevens verlicht. Eenmaal voorbereid zijn de photopatterned hydrogels eenvoudig te gebruiken, waarbij alleen kennis van standaard weefselkweek praktijken en fluorescentiemicroscopie vereist is. Het referentie vrije aspect maakt onbezorgd navigeren op hydrogels met cel beladen mogelijk en elimineert omslachtige beeldverwerkings stappen zoals beeldregistratie tussen referentie-en vervor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

O. A. Banda werd gesteund door de financiering van een NSF IGERT SBE2 Fellowship (1144726), opstart fondsen van de Universiteit van Delaware en het National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299). JHS wordt ondersteund door de financiering van het National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) en het National Science Foundation CAREER Award Program (1751797). De toegang tot microscopie werd ondersteund door subsidies van de NIH-NIGMS (P20 GM103446), de NSF (IIA-1301765) en de staat Delaware. De gestructureerde verlichtings Microscoop werd verworven met fondsen van de staat van Delaware Federal Research and Development subsidieprogramma (16A00471). De LSM880 confocale Microscoop gebruikt voor Two-photon laser scanning lithografie werd verworven met een gedeelde instrumentatie subsidie (S10 OD016361).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein BindingPallPN 4602Maakt het mogelijk om macromeeroplossingen te filteren voorafgaand aan de synthese van de basisgel en daaropvolgende litografiestappen.
Acrylate-Silaan Gefunctionaliseerde #1.5 Dekglasjesin-housein-houseAcrylaten maken binding van de basishydrogel met het glazen oppervlak mogelijk om de hydrogels te immobiliseren. Zie referentie: 21-24
Axio-Observer Z1 met ApotomeZeissWidefield microscoop met gestructureerde verlichtingsmodule die wordt gebruikt om beelden voor TFM vast te leggen.
Chameleon Vision iiCoherent Inc.Uitgerust op laser-scanning microscoop die wordt gebruikt voor multifoton litografie.
Dubbel Gecoat Plakband, 9500PC, 6.0 mil3MBindt acrylaat-silaan gefunctionaliseerde dekglasjes aan petrischalen.
Flexmark90 PFW LijnerFLEXconFLX000620Maakt het mogelijk om dubbel gecoat plakband te lijnen, waardoor het mogelijk is om het plakband in de plotter te voeren.
LSM-880ZeissLaser-scanning microscoop die wordt gebruikt voor multifoton litografie.
MATLABMathworksR2018aVoert aangepaste scripts uit om litografie-instructies voor microscoop en voor analyse van TFM-gegevens te genereren.
Model SC PlotterUSCutterSC631ESnijdt dubbel gecoat plakband in ringen om dekglasjes aan petrischalen te binden.
Objectief C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27ZeissUitgerust op zowel widefield microscoop als laser-scanning microscoop voor zowel litografie als TFM.
PEG-AF633in-housein-houseFluorophore-gelabelde acrylaat PEG-variant voor het maken van fiducial markers. Zie referentie: 21
PEG-DAin-housein-houseBasismateriaal voor hydrogels. Zie referentie: 21
PEG-RGDSin-housein-houseRGDS peptide-gelabelde mono-acrylaat PEG-variant voor het bevorderen van cel-adhesie. Zie referentie: 21
PetrischalenCELLTREAT2296388 mm gaten worden in het midden van elke schaal gesneden met behulp van een boren om basishydrogels te passen.
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning3097358-1004Voor het maken van spatiërs om de dikte van de basishydrogel te regelen (ook bekend als PDMS).
Spuit, Leur-Lok, 1 mLBD309628Maakt het mogelijk om macromeeroplossingen te filteren voorafgaand aan de synthese van de basisgel en daaropvolgende litografiestappen.
UV-LampUVPBlak-Ray® B-100APPolymerisatie van de basishydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinon (NVP)Sigma-AldrichV3409-5GRadicaalversneller en co-monomeer. Verbetert de opname van gepegyleerde fluoroforen tijdens litografie.

Referenties

  1. Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
  2. Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).
  3. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
  4. Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).
  5. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
  6. Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).
  7. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).
  8. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  9. Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).
  10. Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103(2015).
  11. Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).
  12. Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).
  13. Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).
  14. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
  15. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  16. Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
  17. Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
  18. Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).
  19. Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  20. Desai, R. a, Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. (0), 1-5 (2007).
  21. Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).
  22. Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).
  23. Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
  24. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).
  25. Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).
  26. Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
  27. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).
  28. Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).
  29. Banda, O. A., Slater, J. H. Slater Lab Code Repositories. , Available from: https://github.com/SlaterLab (2019).
  30. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).
  31. Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).
  32. Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).
  33. Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Referentievrij platformmultifotonlithografiehydrogelbereidingfluorescente referentiemarkers3D materiaalvervormingcelspanningsmappingtweefotonpatroneringZ stack beeldvormingverplaatsingsanalyse
Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.