Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

Samenvatting

Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.

Samenvatting

Het menselijk endometrium is een van de meest hormonaal responsieve weefsels in het lichaam en is essentieel voor de vaststelling van de zwangerschap. Dit weefsel kan ook ziek worden en morbiditeit en zelfs de dood veroorzaken. Model systemen om menselijke endometrium biologie te bestuderen zijn beperkt tot in vitro cultuur systemen van enkele celtypen. Bovendien, de epitheelcellen, een van de belangrijkste celtypen van het endometrium, niet goed propageren of behouden van hun fysiologische eigenschappen in de cultuur, en dus ons begrip van endometriale biologie blijft beperkt. We hebben voor de eerste keer endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit zowel epitheliale als stromale cellen van het menselijk endometrium. Deze organoïden vereisen geen exogene steiger materialen en organiseren specifiek zodat epitheelcellen de spheroid-achtige structuur omvatten en gepolariseerd worden met stromale cellen in het midden die collageen produceren en afscheiden. Oestrogeen, progesteron en androgeen receptoren worden uitgedrukt in de epitheliale en stromale cellen en behandeling met fysiologische niveaus van oestrogeen en testosteron bevorderen de organisatie van de organoïden. Dit nieuwe modelsysteem kan worden gebruikt om normale endometriale biologie en ziekte te bestuderen op manieren die voorheen niet mogelijk waren.

Inleiding

Het menselijk endometrium lijnen de baarmoederholte en fungeert als het eerste contact voor het embryo tijdens de implantatie. Het endometrium bestaat uit Luminale en klier Epitheelcellen, ondersteunende stromale fibroblasten, endotheel cellen en immuuncellen. Samen vormen deze celtypen het endometrium weefsel dat een van de meest responsieve weefsels is voor geslachts steroïdhormonen¹. De veranderingen die optreden tijdens elke menstruatiecyclus zijn opvallend. Er is een adequate groei en herinrichting van het endometrium nodig om de implantatie van embryo's mogelijk te maken. Afwijkende reactie op oestrogeen en progesteron kan resulteren in een refractair endometrium dat geen succesvolle instelling van de zwangerschap toestaat en zelfs kan resulteren in ziekten zoals endometriale neoplasie.

Om de hormoon responsen en essentiële veranderingen die zich voordoen in het endometrium te bestuderen, zijn cellen uit het baarmoederslijmvlies die uit de patiënten tijdens een operatie of endometriale biopsie zijn gepropageerd, in de celcultuur gekweekt. Endometrium stromale cellen vermenigvuldigen zich bij voorkeur gemakkelijk en propageren, en het proces van differentiatie geïnduceerd door progesteron kan in vitro worden samengevat. Als gevolg hiervan is veel geleerd tijdens dit differentiatieproces, genaamd decidualisatie^2,3. Het andere belangrijke celtype in het endometrium, de Luminale en klier Epitheelcellen, echter niet groeien goed als traditionele monolagen, het verliezen van polariteit, steeds senescentie, en met beperkte proliferatieve potentieel. Als gevolg daarvan is er minder bekend van hun biologie en hun rol in het menselijk endometrium. Aangezien veel neoplasie afkomstig is van de epitheelcellen, blijven de mechanismen die gepaard gaan met hyperplasie of transformatie naar kankercellen volledig gedefinieerd. Bovendien, studies hebben vastgesteld dat hormoon respons impliceert de intieme paracrine acties tussen de epitheliale en stromale cellen van het endometrium^4,5.

Onlangs werd een driedimensionale (3D) organoïde cultuur van endometrium epitheelcellen vastgesteld door twee onafhankelijke groepen van^6,7, die de eerste rapporten zijn van organogeniden gevormd uit endometrium weefsel. Deze organoïden bestonden uit endometrium epitheelcellen ingebed in een eiwit matrix (tabel van materialen) en bevatte geen belangrijk hormonaal responsief compartiment van het baarmoederslijmvlies, de stromale fibroblasten. Aangezien de matrix eiwitten van lot tot lot kunnen variëren en signalering trajecten kunnen activeren die niet noodzakelijkerwijs in het weefsel voorkomen, zou het ideaal zijn om de matrix eiwitten te vervangen door componenten van het endometrium. In de huidige studie, een protocol voor het genereren van steigers-vrije menselijke endometriale organoïden van epitheliale en stromale cellen van het menselijk endometrium wordt gepresenteerd. De aanwezigheid van stromale cellen biedt niet alleen ondersteuning voor Epitheelcellen, maar biedt ook de noodzakelijke paracrine-acties die zijn vastgesteld om belangrijk te zijn voor de respons van het endometrium hormoon^4,8,9 .

De nieuwe multicellulaire endometriale organoïde biedt een modelsysteem van het endometrium dat eenvoudig te genereren is en dat zowel epitheliale als stromale cellen bevat. Deze organoïden kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van hormonale veranderingen op de lange termijn en vroege gebeurtenissen van ziekte zoals tumorvorming als gevolg van hormonale onbalans of exogene insulten. De complexiteit van deze organoïden kan uiteindelijk worden uitgebreid met andere celtypen, waaronder endotheel-en immuuncellen met mogelijk myometriale cellen om de Fysiologie van het menselijk weefsel echt te nabootsen.

Protocol

Endometrium monsters werden verzameld van premenopauzale vrouwen die routine hysterectomie ondergaan voor goedaardige baarmoeder condities bij het Northwestern University Prentice Women's Hospital, volgens een institutioneel Review Board-goedgekeurd protocol. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle vrouwen die in de studie waren opgenomen.

1. bereiding van agarose-mallen

1. Voorafgaand aan het begin van de celisolatie, gegoten en equilibraten 1,5% agarose micro mallen (tabel van materialen) om de organoïden te huis heren volgens de instructies van de fabrikant.

2. generatie van endometrium Organoïden

1. Oogst primaire stromale en epitheelcellen
   1. Bereid in een bioveiligheidskast met aseptische techniek enzym oplossing (2,5 mg/mL Collagenase type I + 0,1 mg/mL DNase I in 10 mL dispase [500 eenheden]) bij 37 °C, en steriel-Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 μm spuit filter in een conische buis van 15 mL.
   2. In een bioveiligheid Cabinet met een aseptische techniek, schraap het endometrium van de baarmoeder biopsieën en het gehakt weefsel onder de motorkap in zeer kleine stukjes met een scalpel.
      Opmerking: Endometrium weefsel dat ten minste 20 mm x 10 mm x 1 mm is vereist om voldoende aantal organoïden te genereren.
   3. Zet vers gehakt weefsel in de enzym oplossing in een conische buis van 15 mL. Sluit de dop en wikkel de top met een Wax Film (tabel met materialen) om besmetting te voorkomen.
   4. Zet de buis met weefsel in een waterbad of een incubator bij 37 °C gedurende 30 minuten met zacht schudden (80 − 100 rpm).
   5. Stapel een 100 μm celzeef bovenop een celzeef van 20 μm op een conische buis van 50 mL. Filtreer de oplossing door de twee zeven en spoel de conische buis van 15 mL af met 10 mL van de gebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS; Tabel met materialen) en zet de wassing door de zeef om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld.
      Opmerking: De doorstroom vloeistof bevat stromale cellen en rode bloedcellen (~ 20 mL totaal). Epitheliale cellen worden verzameld op de 20 μm zeef. Stukjes onverteerd weefsel blijven bovenop de 100 μm zeef. Gooi onverteerd weefsel in een Biohazard afvalbak.
   6. Inverteer de 20 μm celzeef van stap 2.1.5 op een nieuwe conische buis van 50 ml en was de epitheelcellen van de zeef met 20 ml organoïde media (tabel met materialen) aangevuld met 1% pen/STREP.
   7. Centrifugeer de conische buizen van de stappen 2.1.5 en 2.1.6 bij 500 x g gedurende 5 minuten.
   8. Met de verzamelde stromale cellen verwijdert u het supernatant en rebrengt u de pellet met 10 mL rode bloedcel lysisbuffer.  Inbroed bij 37 °c gedurende 10 − 15 min. Centrifugeer de conische buis bij 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en laat de pellet remengen met 200 − 300 μL organoïde media (zie stap 2.2.2 voor verdere instructies).
   9. Met de verzamelde epitheliale cellen, verwijder de supernatant en opnieuw op te schorten met 100 μL organoïde media (zie stap 2.2.2 voor verdere instructies).
2. Seeding van cellen
   1. Na het equilibreren van de 1,5% agarose mallen in Wells (1 mal per putje) van een 24-Wells plaat, verwijder organoïde media aan de buitenkant van de agarose mallen en kantel de weefselkweek plaat zodat het medium uit de cel zaaien kamer van de agarose gerechten ook kan worden voorzichtig verwijderd.
   2. Bekijk epitheliale (vanaf stap 2.1.9) en stromale (uit stap 2.1.8) cel suspensies onder de Microscoop.  Voeg meer organoïde media toe aan zowel de epitheliale als de stromale cel suspensies 100 μL tegelijk, zodat de suspensies ruwweg gelijk zijn aan de dichtheid.
      Opmerking: Epitheliale cellen zullen samen klonteren, en het is niet aan te raden om epitheelcellen in te verwerken/trypsinoiseren in eencellige suspensies.
   3. Combineer 1 deel van stromale cellen met 3 delen epitheelcellen per volume.
   4. Pipetteer 50 μL (60.000 cellen) van de gecombineerde celsuspensie in de cel zaaien kamer van de agarose-mal.
   5. Voeg, zodra de agarose-mallen gevuld zijn met cellen, voorzichtig 400 μL verse organoïde-media toe aan de put van de 24-Well plaat.
      Opmerking: Het medium bereikt net onder het oppervlak van de agarose gerechten en zal niet leiden tot de cellen te zweven uit de mallen. Na 2 − 3 dagen zullen de cellen zich vestigen en organoïden beginnen te vormen.
   6. Verander het medium elke tweede dag met 500 μL organoïde media.
   7. Na 2-3 dagen, verander medium naar een die wordt aangevuld met 0,1 nM Estradiol (E) en 0,8 nM testosteron (T) ter bevordering van de organisatie van epitheliale en stromale cellen.
      Opmerking: Hoewel de organisatie van epitheliale en stromale cellen kan optreden met of zonder hormonen, meer organoïden zal organiseren in de aanwezigheid van hormonen.

3. het oogsten van endometrium Organoïden voor experimenten

Opmerking: Nadat het experiment is uitgevoerd, kunnen endometrium organoïden worden verwerkt voor histologie of RNA-analyse. In de volgende stappen wordt beschreven hoe u de organoïden verwerkt.

1. Histologie
   1. Los 1,5% agarose op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door te koken. Laat de vloeistof agarose afkoelen tot ongeveer 50 °C.
   2. Kantel de 24-pits plaat onder een ontleed Microscoop en Pipetteer voorzichtig het medium van de buitenkant van de agarose mal. Pipetteer voorzichtig het medium uit het binnenste van de agarose mal om te voorkomen dat de organoïden worden verstoord.
   3. Pipetteer met een ontleed Microscoop voorzichtig 70-75 μL warm (50 °C) 1,5% agarose in de kamer van het agarose-schaaltje. Zorg ervoor dat u de organoïden niet verstoort.
   4. Laat afkoelen bij 4 °C gedurende 5 minuten.
   5. Voeg 4% Paraformaldehyde (PFA) toe aan elke put van de 24 goed plaat en bevestig de volledige verzegelde agarose mal die organoïden 's nachts bij 4 °C bevat. Bewaar vervolgens in 70% ethanol bij 4 °C tot het proces klaar is voor het insluiten van paraffine.
2. RNA-isolatie
   1. Kantel de 24-Well plaat onder een ontleed Microscoop en Pipetteer voorzichtig het medium uit de kamer van de agarose mal.
   2. Pipetteer 1 ml vers organoïde medium met kracht rechtstreeks in de agarose mal zodat de organoïden uit de micro putten worden gespoeld. Wees voorzichtig om niet te veel bubbels te maken.
   3. Herhaal de Pipetteer opnieuw met hetzelfde medium uit stap 3.2.2.
   4. Verzamel alle medium met de organoïden. Centrifugeer bij maximale snelheid om de organoïden te verzamelen en door te gaan naar RNA-extractie.

Resultaten

Een schematische voorstelling van het protocol is afgebeeld in Figuur 1. Baarmoeder weefsel werd verkregen uit een operatie nadat het werd onderzocht door pathologen. Het baarmoederslijmvlies werd van het myometrium gescheiden door schrapen en het endometriale weefsel werd enzymatisch verteerd naar cellen zoals beschreven in het protocol. Epitheliale en stromale cellen werden toegevoegd in micro putten in de agarose mallen. Na 7 dagen in de cultuur werden organoïden behandeld met E en T gedu...

Discussie

We hebben menselijke endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit epitheliale en stromale cellen van het endometrium zonder het gebruik van exogene steiger materialen. Hoewel het al is aangetoond dat primaire endometrium epitheelcellen organoïden^6,7, deze cellen werden ingebed in een gelatineuze matrix van eiwitten uitgescheiden door muis Sarcoom cellen (Zie tabel van materialen) om te helpen vormen spheroid-achtige structuren. Bovendien, ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose HS, moleculair biologie kwaliteit	Denville Scientific	CA3510-6
Agarose vormen	Sigma-Aldrich	Z764043	(https://www.microtissues.com/)
Ammoniumchloride (NH4Cl)	Amresco	0621
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2257
Collagenase, Type II, poeder	Thermo Fisher Scientific	17101015
Dispase	Corning	354235
DNase I	Sigma-Aldrich	D4513
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Eosine Kleurstof	VWR	95057-848
Oestrogeen Receptor (SP1), konijnen monoklonaal antilichaam	Thermo Fisher Scientific	RM-9101-S
Fluoroshield met DAPI, histologie montage medium	Sigma-Aldrich	F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1x zonder calcium, magnesium en fenol rood
Hematoxyline Kleurstof Oplossing	Thermo Fisher Scientific	3530-32	Gemodificeerde Harris formulering, kwikvrij
Heparine oplossing	STEMCELL Technologies	07980	toegevoegd aan MammoCult media
Hydrocortison stockoplossing	STEMCELL Technologies	07925	toegevoegd aan MammoCult media
Organoïde media - Mammocult	STEMCELL Technologies	05620	aangevuld met 2 µL/mL heparine en 5 µL/mL hydrocortison
Paraformaldehyd, 16% oplossing	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicilline-Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122
Fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4	Sigma-Aldrich	P3813
Progesteron Receptor, PgR 1294, ongeconjugeerd, cultuur supernatant	Agilent Technologies	M356801-2
Eiwit matrix - Matrigel	BD Biosciences	356231
Gezuiverd muis anti-E-cadherine antilichaam	BD Biociences	610181	Clone 36
Recombinant anti-vimentin antilichaam [EPR3776]	Abcam	ab92547
RNA lysering en isolatie kit	Zymo Research	R2060
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Testosteron	Sigma-Aldrich	86500
Trichrome Kleurstof	Abcam	ab150686
Wax film - Parafilm	VWR	52858-000