Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het menselijk endometrium is een van de meest hormonaal responsieve weefsels in het lichaam en is essentieel voor de vaststelling van de zwangerschap. Dit weefsel kan ook ziek worden en morbiditeit en zelfs de dood veroorzaken. Model systemen om menselijke endometrium biologie te bestuderen zijn beperkt tot in vitro cultuur systemen van enkele celtypen. Bovendien, de epitheelcellen, een van de belangrijkste celtypen van het endometrium, niet goed propageren of behouden van hun fysiologische eigenschappen in de cultuur, en dus ons begrip van endometriale biologie blijft beperkt. We hebben voor de eerste keer endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit zowel epitheliale als stromale cellen van het menselijk endometrium. Deze organoïden vereisen geen exogene steiger materialen en organiseren specifiek zodat epitheelcellen de spheroid-achtige structuur omvatten en gepolariseerd worden met stromale cellen in het midden die collageen produceren en afscheiden. Oestrogeen, progesteron en androgeen receptoren worden uitgedrukt in de epitheliale en stromale cellen en behandeling met fysiologische niveaus van oestrogeen en testosteron bevorderen de organisatie van de organoïden. Dit nieuwe modelsysteem kan worden gebruikt om normale endometriale biologie en ziekte te bestuderen op manieren die voorheen niet mogelijk waren.
Inleiding
Het menselijk endometrium lijnen de baarmoederholte en fungeert als het eerste contact voor het embryo tijdens de implantatie. Het endometrium bestaat uit Luminale en klier Epitheelcellen, ondersteunende stromale fibroblasten, endotheel cellen en immuuncellen. Samen vormen deze celtypen het endometrium weefsel dat een van de meest responsieve weefsels is voor geslachts steroïdhormonen1. De veranderingen die optreden tijdens elke menstruatiecyclus zijn opvallend. Er is een adequate groei en herinrichting van het endometrium nodig om de implantatie van embryo's mogelijk te maken. Afwijkende reactie op oestrogeen en progesteron kan resulteren in e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Endometrium monsters werden verzameld van premenopauzale vrouwen die routine hysterectomie ondergaan voor goedaardige baarmoeder condities bij het Northwestern University Prentice Women's Hospital, volgens een institutioneel Review Board-goedgekeurd protocol. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle vrouwen die in de studie waren opgenomen.
1. bereiding van agarose-mallen
- Voorafgaand aan het begin van de celisolatie, gegoten en equilibraten 1,5% agarose micro mallen (tabel van materialen) om de organoïden te huis heren volgens de instructies van de fabrikant.
2. generatie v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een schematische voorstelling van het protocol is afgebeeld in Figuur 1. Baarmoeder weefsel werd verkregen uit een operatie nadat het werd onderzocht door pathologen. Het baarmoederslijmvlies werd van het myometrium gescheiden door schrapen en het endometriale weefsel werd enzymatisch verteerd naar cellen zoals beschreven in het protocol. Epitheliale en stromale cellen werden toegevoegd in micro putten in de agarose mallen. Na 7 dagen in de cultuur werden organoïden behandeld met E en T gedu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben menselijke endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit epitheliale en stromale cellen van het endometrium zonder het gebruik van exogene steiger materialen. Hoewel het al is aangetoond dat primaire endometrium epitheelcellen organoïden6,7, deze cellen werden ingebed in een gelatineuze matrix van eiwitten uitgescheiden door muis Sarcoom cellen (Zie tabel van materialen) om te helpen vormen spheroid-achtige structuren. Bovendien, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) en Northwestern Feinberg school of Medicine Bridge Fund (JJK). Wij willen de noordwestelijke pathologie kern faciliteit voor de verwerking van de vaste organoïden voor paraffine insluiten erkennen. We willen het hele UG3 team erkennen, inclusief de Labs Woodruff, Burdette en Urbanek, voor de inzichtelijke discussies en samenwerkingen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose HS, moleculair biologie kwaliteit | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose vormen | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammoniumchloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, poeder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosine Kleurstof | VWR | 95057-848 | |
| Oestrogeen Receptor (SP1), konijnen monoklonaal antilichaam | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield met DAPI, histologie montage medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x zonder calcium, magnesium en fenol rood |
| Hematoxyline Kleurstof Oplossing | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Gemodificeerde Harris formulering, kwikvrij |
| Heparine oplossing | STEMCELL Technologies | 07980 | toegevoegd aan MammoCult media |
| Hydrocortison stockoplossing | STEMCELL Technologies | 07925 | toegevoegd aan MammoCult media |
| Organoïde media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | aangevuld met 2 µL/mL heparine en 5 µL/mL hydrocortison |
| Paraformaldehyd, 16% oplossing | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilline-Streptomycine | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesteron Receptor, PgR 1294, ongeconjugeerd, cultuur supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| Eiwit matrix - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Gezuiverd muis anti-E-cadherine antilichaam | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antilichaam [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysering en isolatie kit | Zymo Research | R2060 | |
| Natriumbicarbonaat (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosteron | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Kleurstof | Abcam | ab150686 | |
| Wax film - Parafilm | VWR | 52858-000 |
Referenties
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualizati....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
