Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad

7.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60401

⸱

4 maart 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een transplantatiemethode om donorrattenborstepitheelcellen te transplanteren in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende dieren. Deze methode kan worden gebruikt om gastheer- en/of donoreffecten op de ontwikkeling van borstepitheel te onderzoeken en elimineert de noodzaak van pre-clearing, waardoor het nut van deze techniek wordt uitgebreid.

Samenvatting

Al in de jaren 1970 hebben onderzoekers met succes getransplanteerde borstepitheelcellen in de interscapulaire witte vet pad van ratten. Enten van borstepitheel met behulp van transplantatietechnieken maakt gebruik van de hormonale omgeving die wordt geboden door de adolescente knaagdiergastheer. Deze studies zijn bij uitstek geschikt om de impact van verschillende biologische manipulaties op de ontwikkeling van de borstklier te onderzoeken en vele aspecten van de borstklierbiologie te ontleden. Een gemeenschappelijk, maar beperkend kenmerk is dat getransplanteerde epitheelcellen sterk worden beïnvloed door de omringende stroma en worden overconcurreerd door endogene epitheel; om inheemse borstweefsel te gebruiken, moet het buik-inguinale witte vetpad worden gewist om gastheer borstepitheel voorafgaand aan de transplantatie te verwijderen. Een belangrijk obstakel bij het gebruik van het rattenmodel organisme is dat het opruimen van de zich ontwikkelende borstboom in post-gesaneerde ratten niet efficiënt is. Wanneer getransplanteerd in kliervrije vetpads, donor epitheliale cellen kunnen herbevolken de gewiste gastheer vet pad en vormen een functionele borstklier. De interscapulaire vet pad is een alternatieve locatie voor deze grafts. Een groot voordeel is dat het geen ductalstructuren heeft, maar de normale stroma biedt die nodig is om epitheeluitgroei te bevorderen en gemakkelijk toegankelijk is in de rat. Een ander groot voordeel van deze techniek is dat het minimaal invasief is, omdat het de noodzaak elimineert om de groeiende endogene borstboom te cauteriseren en te verwijderen. Bovendien bevat de interscapulaire vetpad een mediale bloedvat dat kan worden gebruikt om plaatsen voor enting te scheiden. Omdat de endogene klieren intact blijven, kan deze techniek ook worden gebruikt voor studies die de endogene borstklier vergelijken met de getransplanteerde klier. Dit document beschrijft de methode van borstepitheelceltransplantatie in het interscapulaire witte vetstootkussen van ratten.

Inleiding

Postnatale borstklier ontwikkeling en ductalmorfogenese zijn processen grotendeels beïnvloed door hormonale signalering aan het begin van de puberteit. Bij muizen en ratten, veelgebruikte modelorganismen van de borstklierbiologie, begint dit proces rond 3 weken oud, waar snelle proliferatie en differentiatie resulteren in de vorming van de volwassen parenchyma. De rijpe borstklier kan ondergaan talrijke rondes van expansie en involutie, een eigenschap die is onderzocht sinds het begin van de20e eeuw. In het kader van hyperproliferatie en kankerontwikkeling werden in de jaren vijftig1transplantatietechnieken voor de borstklier ontwikkeld en versterkt door de kwantitatieve methodologie die Gould et al. in 19772,3,4heeft bijgedragen . Verfijning van de transplantatie techniek bij knaagdieren heeft bijgedragen aan grote vooruitgang in het begrijpen van de normale borstklier biologie die nog steeds op grote schaal worden gebruikt om het effect van verschillende behandelingen en genetische manipulatie op de normale borstklier ontwikkeling en ziekte staten te bestuderen.

Veel hypothesen zijn gegenereerd en vervolgens getest met behulp van borstkliertransplantatie, voor het eerst beschreven door DeOme et al. in 19591. Experimenten in verschillende decennia toonden de neiging van ductalweefsel uit donorborstklieren om het hele vetpad5,6,7 opnieuw te bevolken en gaven aan dat een kritieke component van de ontwikkeling van de borstklier in deze epitheelstructuren woont. Latere studies bij muizen toonden aan dat een enkele borststamcel een gewist vetpad kan herbevolken en heeft bijgedragen aan de ontdekking van een enkele, gemeenschappelijke voorloper van basale en luminaire borstepitheelcellen8,9,10. In overeenstemming met deze conclusies is gesuggereerd dat transplantatie de pool van cellen met multilineage-repopulating potentieel als gevolg van plasticiteit verhoogt, waardoor de geënte cellen een functionele borstklierkunnenlaten groeien 7,10,11,12,13. Belangrijk is dat het gebruik van transplantatietechnieken bij knaagdieren de beperkingen van celkweek-geïnduceerde afwijkingen overwint14 en vaak resultaten oplevert in slechts een kwestie van weken.

Terwijl de procedure oorspronkelijk werd beschreven in de context van preneoplastische laesies bij muizen, werd het al snel uitgebreid tot ratten en gebruikt in combinatie met de carcinogene behandeling om multipliciteit vast te stellen als een maatregel van de gevoeligheid van kanker15, maar de populariteit van transplantatie technieken heeft gevolgd de ontwikkeling van genetische instrumenten voor elke soort. Hoewel muisstudies waarin transplantatie is opgenomen, veel translationele bevindingen hebben bijgedragen, lijkt de haakse van de rattenborstklier op de mens dichterop 16,17 en biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van oestrogeenreceptor-positieve (ER+) borstkanker. Borsttumoren zijn in ducible in beide soorten, maar ze verschillen in termen van hormoongevoeligheid en genexpressie profielen. Een primair verschil is dat rat borsttumoren uitdrukken en afhankelijk zijn van de functie van eierstokkanker en hypofyse hormoonreceptoren, namelijk oestrogeen en progesteron (PR), vergelijkbaar met de luminal-A subtype van de menselijke borstkanker. Inderdaad, borstepitheel epitheel celtransplantatie, zoals beschreven in dit protocol, is gebruikt om genetische varianten die betrokken zijn bij borstkanker te bestuderen en de cellulaire autonomie van effecten op borstepitheelcellen te bepalen18.

Naast de tumorbiologie vertoont het ductale epitheel van de normale rattenborstklier een hoger niveau van vertakking en wordt geflankeerd door een dikkere laag stroma dan de muis. Het belang van de stroma is goed gedocumenteerd in borstepitheel epitheliale transplantatie studies. Borstepitheel moet interageren met vette stroma, en idealiter zijn eigen mesenchyme, om zijn karakteristieke morfogenese19,20ondergaan . Entweefsel in een ontvanger borstklier zorgt voor een optimale omgeving; de aanwezigheid van endogene epitheel kan echter de resultaten verstoren. Preclearing de borstklier van endogene epitheel wordt vaak uitgevoerd in muistransplantatie tests en vereist chirurgische excisie van endogene borstweefsel en / of verwijdering van de tepel1,21,22. Hoewel mogelijk, preclearing de borstepitheel in post-spenen ratten is niet zo breed uitgevoerd, vooral te wijten aan de ineffectiviteit van het opruimen van de groeiende borstboom in post-spenende ratten. Aangezien is aangetoond dat gebieden van vetweefsel elders in het lichaam de groei van getransplanteerde borstepitheel21,23,24kunnen ondersteunen, kan het proces van voorclearing gemakkelijk worden vermeden bij ratten door weefsel te enten in het interscapulaire witte vetpad.

De in dit document beschreven transplantatiemethode omvat de injectie van enzymatisch gescheiden borstklierorganoïden (fragmenten van borstkanaalepitheel en andere cellendie morfogenese kunnen) of mono-verspreide cellen in het interscapulaire vetpad in inteelt, isogenische of congene stammen van laboratoriumratten2. Omdat de interscapulaire vetpad normaal gesproken verstoken is van borstweefsel, biedt het een geschikte omgeving voor meerdere transplantatielocaties zonder dat het endogeen epitheel vooraf hoeft te zuiveren. Als gevolg hiervan zijn de endogene, abdominale borstklieren van het gastheerdier niet onderhevig aan chirurgische manipulatie, ontwikkelen zich normaal en kunnen ze de interpretatie van de resultaten niet verstoren. Bovendien kunnen de intacte borstklieren worden gebruikt voor vergelijking om gastheer versus donoreffecten op de borstepitheelontwikkeling en tumorigenese18,25te evalueren. Hoewel herpopulatie van de borstklier uit een enkele stamcel beschikbaar is voor muizen, is deze nog niet ontwikkeld voor ratten, voornamelijk vanwege het gebrek aan beschikbaarheid van antilichamen om te selecteren voor ratborststamcellen25,26,27. Desondanks kan transplantatie van monodispersed borstepitheelcellen om repopulating potentieel te kwantificeren met succes worden uitgevoerd, en die cellen zullen zich normaal ontwikkelen wanneer ze in het juiste kader2,3,4worden geënt. Hoewel organoïden voor vele doeleinden goed zijn, zijn monodispersed cellen nodig voor kwantitatieve toepassingen, bijvoorbeeld om het aantal borstepitheelcellen te bepalen dat nodig is voor de kankerinitiatie na ioniserende bestraling28 of voor het vergelijken van kenmerken van flow cytometrisch geselecteerde borstepitheelcelpopulaties29.

Tot op heden, de procedure hier beschreven is de meest robuuste methode van het uitvoeren van borstklier transplantatie in de rat met een algemeen doel van het bestuderen van borstklier ontwikkeling en mechanismen die ten grondslag liggen borstkanker ontwikkeling. Vaak worden de donor- en/of ontvangende dieren vóór, tijdens of na de epitheeltransplantatie blootgesteld aan verschillende variabelen. Voorbeelden hiervan zijn enkelgenstudies met chemische carcinogenese30, straling28,31,32, genetische manipulatie van gastheer/donorgenoom18en hormonale manipulatie12. Een groot voordeel van de enzymatische dissociatie beschreven in dit protocol is de mogelijkheid om epitheliale organoïden of monodispersed cellen te isoleren voor complementaire experimenten met flow cytometrie, 3-D cultuur, genbewerking, en nog veel meer. Toekomstige toepassingen van deze techniek zullen aanvullende manipulatie van donor- en/of gastheerweefsel met genetische manipulatie omvatten. Donorcellen kunnen bijvoorbeeld genetisch worden gewijzigd ex vivo op elke gekozen genomische locus met behulp van het CRISPR-Cas9 genbewerkingssysteem. Op dezelfde manier kunnen ontvangers ratten ook genetisch worden gewijzigd om de interactie tussen donor en ontvanger gemanipuleerde genetische factoren te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren werden gehuisvest en onderhouden in een aaalac-goedgekeurde faciliteit, en experimenten beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door het MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Dieren die bij wederkerige transplantatie worden gebruikt, moeten een ingeteelde of isogene stam zijn, met een congene status die de voorkeur heeft of gedurende ten minste 6 generaties wordt gekruist.

1. Oogsten donorrat borstklier epitheel

  1. Bepaal het aantal donorratten dat nodig is voor transplantatie.
    OPMERKING: Over het algemeen kan 1 donorrat (4 weken oud) voldoende cellen leveren voor transplantatie bij 4 ontvangende dieren. Bepaalde toepassingen van dit protocol vereisen extra aantallen cellen en er kunnen spanningsspecifieke verschillen in totale opbrengst zijn.
  2. Label alle benodigdheden en zorg voor een toegankelijke plaatsing voor de chirurg(tabel 1).
  3. Noteer het lichaamsgewicht van elke vrouwelijke donorrat. Volg institutionele richtlijnen om de donorrat volledig te verdoven of te euthanaseren. Controleer op de diepte van anesthesie door het gebrek aan reactie op de teen knijpen.
  4. Verplaats het dier naar het steriele chirurgische veld. Leg het dier op de rug en spuit het gehele ventrale oppervlak met 70% ethanol.
  5. Maak een sagittale, X-vormige incisie, waardoor toegang tot thoracale, buik- en inguinale borstklieren. Ontleed al het borstklierweefsel van de donorrat met behulp van een schaar(figuur 1). Verwijder alle zichtbare lymfeklieren.
  6. Haal het borstweefsel met behulp van tangen en plaats in een gelabelde 60 mm schotel op ijs. Voeg 500 μL serumvrije DMEM/F12-media toe aan de 60 mm schotel. Pas de plaatsing van het borstklierweefsel aan zodat het volledig nat blijft.
  7. Hak fijn het borstweefsel met behulp van een schaar. Snijd het weefsel hiervoor in stukken van 1-2 mm3 groot(figuur 1C). Houd de klier op ijs totdat al het donorweefsel is geoogst (niet meer dan 60 min).
    OPMERKING: Extra personeel kan borstklieren gehakt en bovendien voorbereiden collagenase oplossing, terwijl de chirurg verder gaat met weefselextracties.

2. Extract hersenweefsel van geëuthanaseerde donoren

  1. Draai het lichaam van het donordier voorzichtig om om het in een gevoelige positie te plaatsen. Veilig met pinnen. Spray het hoofd en de bovenrug met 70% ethanol.
  2. Zoek de basis van de schedel en maak een incisie onder de occipital condyles. Steek een scherpe schaar onder de huid en snijd de huid uit de buurt van de schedel, met inbegrip van de zijkanten van het hoofd.
  3. Gebruik botsnijders of sterke schaar om de schedel langs de middellijn te snijden, van de occipital tot frontale botten. Houd het blad zo oppervlakkig mogelijk en hoek omhoog om de vernietiging van het onderliggende hersenweefsel te voorkomen.
  4. Pel het bot weg met rongeurs of sterke tangen. Steek het gereedschap zijwaarts aan het cerebellum om het bot aan weerszijden te breken, waardoor het benige gehoorkanaal wordt blootgelegd. Doorsmijn de verbindingen met de hersenvliezen.
  5. Til de hersenen voorzichtig op met gebogen, fijne punttangen. Plaats de hersenen op een stuk folie en neem het gewicht op en breng dan onmiddellijk over naar een buis van 15 mL met een gelijke hoeveelheid (w:v) van media, opgeslagen op ijs.
    1. Optioneel, gebruik fijne-tip tangen om de hypofyse (gelegen onder de hersenen) te verwijderen voor extra gebruik in de transplantatie procedure, indien nodig.
  6. Gebruik een mechanische homogenisator om het weefsel te verstoren. Homogeniseren van de hersenen voor 10-15 s op lage snelheid. Laat het mengsel minstens 1 min op ijs zitten en homogeniseer dan weer. Homogenisatie is voldoende wanneer het uiteindelijke mengsel vrij is van grote stukken.
  7. Filtreer het homogenalaat door het door een 100 μm filter te laten gaan. Houd het filtraat op ijs tot gebruik (minder dan 4 uur).

3. Vertering en verwerking van borstklierextracten

  1. Ontdooi of warme reagentia zoals aangegeven (tabel 1). Volg de juiste stappen voor het herstellen van organoïden of monodispersed cellen.
  2. Bereid 10 mL serumvrije vergistingsmedia (zonder collageenase) voor elk donordier (Supplemental Bestand 1).
    OPMERKING: Het volume van de gebruikte verteringsmiddelen kan worden aangepast (opgeschaald omhoog of omlaag) om het gegroepeerde weefsel, indien van toepassing, tegemoet te komen.
    1. Voor organoïden ga je naar 3,3.
    2. Voor monodispersed cells, bereiden verse Monodispersie Mengsel en Inactivatie Oplossing(Aanvullende Bestand 2, Aanvullende Bestand 3) in aanvulling op de serum-vrije collageen ase spijsvertering media. Ga verder naar stap 3.3.
  3. Wanneer al het borstweefsel van donoren is geëxtraheerd en gehakt, voeg het collagenase enzym toe aan de warme (of kamertemperatuur) spijsverteringsmedia(Supplemental File 1). Meng door omtekeren.
  4. Geef de collageenase verteringmedia door middel van een 20 μm filter. Doseer 10 mL gefilterde media in de gelabelde 50 mL buizen voor de spijsvertering.
  5. Gebruik voor elk monster een nieuwe pipettip van 1.000 μL en breng het gehakte donorweefsel van elke 60 mm schotel over naar de collageenachtige spijsverteringsbuis. Snijd 1 cm af het uiteinde van een 1.000 μL-punt en plaats deze voor gebruik handmatig op het apparaat. Meng het gehaktweefsel voorzichtig door 1-2 keer op en neer te stampen.
    OPMERKING: Als het weefsel moeilijk te pipet is tijdens de overdracht, gebruik dan een kleine hoeveelheid van de collagenase vergistingsmedia van de 50 mL buis, en breng het dan terug.
  6. Plaats de monsters in de horizontale positie in een schuddende couveuse en laat de monsters 1,5-2 uur verteren bij 37 °C, 200-220 rpm.
    1. Voor organoïden overslaan naar 3,7.
    2. Voeg voor monodispersed cells DNase I (0,2 μg/mL) de laatste 10 min van de spijsvertering toe aan het mengsel. Incubeer als voorheen, met krachtig schudden. Ga verder naar stap 3.7.
  7. Wanneer het weefsel volledig is verteerd, pellet de suspensie met behulp van koude centrifugatie (4 °C) gedurende 10 min bij 1.200 x g (Figuur 1D).
    OPMERKING: Houd buizen op ijs tussen elke stap om de levensvatbaarheid van cellen te verhogen.
  8. Zorg ervoor dat een pellet is gevormd, en giet dan zorgvuldig uit de supernatant en vet laag. Voorzichtig resuspend de pellet in 10 mL verse DMEM/F12 media.
  9. Kort draaien op 68 x g voor ongeveer 10 s. De lengte van de spin (maar niet de snelheid) kan worden verhoogd als er geen duidelijke scheiding van cellen is. Controleer de pellet visueel voordat u verdergaat (figuur 1D).
  10. Verwijder voorzichtig de supernatant, waardoor een klein volume achterblijft. Ga naar de volgende stap, op basis van de vraag of organoïden of monodispersed cellen nodig zijn.
    OPMERKING Het is belangrijk om een klein volume van de media in de buis, omdat de pellet zal zeer los. Het resterende volume van de media zal worden verdund door middel van wasstappen.
    1. Voeg voor organoïden nog eens 10 mL volume DMEM/F12 media toe en herhaal de was/spin. Na de tweede wasbeurt, resuspend de cellen in een kleiner volume (1-2 mL) van DMEM/F12 media voor filtratie. Ga naar stap 3.11.
    2. Voor monodispersed cells, los in 2 mL van voorverwarmde HBSS met 0,025% (w/v) Trypsine en 6,8 mM EDTA. Digest gedurende 3-5 min bij 37 °C. Onmiddellijk inactiveren.
      1. Voeg 4 mL DMEM/F12 toe met 10% FBS om te stoppen met het inactiveren van de trypsine.
      2. Draai de cellen op 270 x g voor 5 min en breg deze opnieuw op in DMEM/F12 met 10% FBS opnieuw. Ga naar stap 3.11 om de cellen te filteren.
  11. Filtreer de cellen met behulp van een 40 μm celzeef geplaatst in een nieuwe buis van 50 mL. Pre-nat de zeef door pipetteren 1 mL van hetzelfde basismedium gebruikt om de cellen op te schorten, en vervolgens de cel suspensie door het filter met behulp van een pipet om ductal fragmenten / organoïden te verzamelen.
    OPMERKING: De geschatte opbrengst van gefilterd epitheel uit het borstklierweefsel van een enkele, 4 weken oude donorrat is 1 x 106 cellen.
    1. Gooi voor organoïden het filtraat weg. Borstorganoïden blijven in de mand van de celzeef en kleinere, ongewenste cellen worden geëlimineerd. Keer de celzeef over een nieuwe buis van 50 mL en spoel af met het volume dat nodig is om de cellen te verzamelen. Ga naar stap 3.12.
    2. Voor monodispersed cellen, gooi de cel zeef en houd het filtraat, omdat de borstepitheel epitheel cellen zal passeren het filter, samen met kleinere stromal en immuuncellen. Spoel de buis die werd gebruikt voor de spijsvertering / centrifugering met een ander volume van DMEM / F12 met 10% FBS en passeren dezelfde cel zeef. Pellet de monodispersed cellen door centrifugeren op 1.200 x g voor 5 min. Ga naar stap 3.12.
      OPMERKING: De opnieuw onderbroken cellen zijn klaar voor latere toepassingen.
  12. Pulse spin de oplossing en zorgen voor de vorming van een cel pellet voordat u doorgaat naar de volgende stap. Puls spin weer, indien nodig.
  13. Verwijder voorzichtig de supernatant. Resuspend de pellet in een klein volume (1.000-2.000 μL DMEM/F12) om de cellen te concentreren om te tellen.
  14. Tel cellen en verdun indien nodig. Resuspend het gewenste aantal cellen voor transplantatie in 20 μL DMEM/F12 media voor elk dier. Houd cellen altijd op ijs.
    OPMERKING: Donorceltellingen in het bereik van 1 x 105 - 1 x 106 cellen zijn vereist voor elke graftsite op basis van het eindpunt van het onderzoek. Carcinogenese-experimenten vereisen bijvoorbeeld vaak een groter aantal getransplanteerde cellen, in verhouding tot andere toepassingen. Het aantal cellen dat nodig is, moet voor elke stam experimenteel worden bepaald. De in dit protocol beschreven procedure maakte gebruik van 250.000 donorcellen in 20 μL-media per entingsplaats, voorafgaand aan het mengen met hersenhomogenaat, zoals beschreven in stap 3.16.
  15. Bereid alle cellen voor die nodig zijn voor andere experimenten (bijvoorbeeld FACS-isolatie3,26,27,30,33).
    1. Voor organoïden gaat u verder naar stap 3.16.
    2. Voor monodispersed cellen, kwantificeren van de levensvatbare cellen met behulp van Trypan of methyleen blauwe vlekken, en ga dan verder.
  16. Bereid enkele partijen donormateriaal voor alle transplantatieontvangers. Combineer gelijke volumes van de celsuspensie (20 μL) met 50% hersenhomogenaat (20 μL) voor elke plaats van transplantatie.
    OPMERKING: Op elke locatie wordt in totaal 40 μL per locatie geïnjecteerd, maar het wordt aanbevolen om minimaal 25% extra volume voor afval op te nemen.
  17. Ga onmiddellijk later over tot transplantatie of vries cellen voor de transplantatie (potentieel stoppunt).
    OPMERKING: Bevroren cellen zijn niet getest met dit protocol en vereisen optimalisatie voordat een cohort van dieren voor transplantatie-experimenten. Het wordt sterk aanbevolen om verse cellen te transplanteren.

4. Transplantatieprocedure (ontvanger ratten 4-5 weken oud)

  1. Weeg elke ontvangende rat af en bereken de juiste dosis goedgekeurde pijnstiller die in de procedure zal worden gebruikt.
    OPMERKING: Lichaamsgewichten kunnen worden gemeten tot 24 uur voorafgaand aan de procedure. Volg institutionele richtlijnen om elk dier voor de duur van het scheren in bedwang te houden of kort te verdoven.
  2. Scheer de chirurgische ruimte op elk dier met behulp van elektrische tondeuse. Identificeer de basis van de schedel en het begin van de wervelkolom. Ongeveer een derde van de weg naar beneden de wervelkolom, scheer een 3 cm x 2 cm gebied op de bovenste thoracale gedeelte van de rug.
    OPMERKING: Scheren kan ook onder narcose worden uitgevoerd op de dag van transplantatie, maar moet buiten het steriele veld worden uitgevoerd. Breng de rat terug naar zijn kooi totdat deze nodig is.
  3. Zoek alle benodigdheden die nodig zijn voor transplantatie(tabel 1).
  4. Evalueer het laboratoriumdieranesthesiesysteem voor gebruik. Top off alle vloeistoffen en vervang alle tanks of onderdelen die nodig zijn. Zorg ervoor dat de gasleiding naar de anesthesiekamer open is en alle perifere lijnen zijn gesloten, zodat isoflurane anesthesie en zuurstof vrij kan stromen naar het dier zodra het is geplaatst in de kamer.
  5. Warme verwarmingspads om de lichaamstemperatuur van de ontvangende dieren te ondersteunen.
  6. Genereer het steriele veld dat zal worden gebruikt voor een operatie. Schik de leveringen zoals beschreven in tabel 1.
  7. Toedienen van preoperatieve pijnstillende aan ontvangende ratten, zoals aangegeven door institutioneel goedgekeurde dierverzorgingsprotocol.
  8. Spoel de Hamilton spuiten met steriele DMEM/F12 media om verlies van cellen te voorkomen. Zorg ervoor dat de naald is bevestigd aan het lichaam van de spuit, steek de naald in de vloeistof, en trek de zuiger terug. Vul tot het maximale volume. Druk de zuiger naar beneden en verdrijft de inhoud in een afvalinzamelbuis. Herhaal 3-5 keer.
  9. Laad het volledige volume donormateriaal (opgesteld in stap 3.16) in een aparte spuit voor elke aandoening (bijvoorbeeld controle, behandelde, wildtype, knock-out, enz.). Steek de punt van de naald in de vloeistof, trek de zuiger terug en houd de naald onder het oppervlak van het mengsel naarmate het volume in de buis afneemt.
    LET OP: Neem minstens 10% extra volume op in elke spuit. Gooi het resterende mengsel niet dicht de buis en houd het op ijs voor het geval er meer nodig is.
  10. Keer de spuit om nadat deze volledig is geladen en druk de zuiger lichtjes om luchtbellen aan het uiteinde van de naald te verwijderen. Ga naar de volgende stap wanneer alles is voorbereid.
    LET OP: Zorg ervoor dat de punt van de naald nooit een ander oppervlak raakt, zelfs niet binnen het steriele veld. Het is nuttig om het lichaam van de spuit over een kleine container van ijs te rusten om levensvatbaarheid van de cellen te bevorderen.
  11. Plaats het ontvangende dier in de anesthesiekamer en zet de machine aan.
  12. Wanneer het dier volledig ontspannen is (reageert niet op tikken of zachte beweging van de kamer), richt u de anesthesie op de neuskegel en breng het dier naar het steriele veld.
    OPMERKING: Langere duur van anesthesie wordt niet goed verdragen door ratten. Voltooi de procedure voor elk dier in 10 min of minder.
  13. Plaats het dier in een gevoelige positie (op zijn buik), zodat de achterkant van het hoofd en de bovenste wervelkolom toegankelijk is.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het dier altijd voldoende warmteondersteuning krijgt en beoordeel regelmatig de diepte van anesthesie met behulp van een stevige teenknijper.
  14. Breng optioneel oogheelkundige vetzalf aan om het drogen van de ogen te voorkomen.
  15. Maak het vers geschoren gebied schoon om overtollig haar te verwijderen. Gebruik een cirkelvormige beweging en breng 70% ethanol (of een ander reagens, per institutionele richtlijnen) op de huid, gevolgd door een antiseptisch (zoals jodium), en herhaal. Plaats een handdoek gordijnen over het dier, zodat alleen de regio voor de geschoren gebied wordt blootgesteld.
  16. Zorg ervoor dat het dier niet reageert op diepe stimuli met een stevige teenknijper en ga vervolgens door naar de volgende stap.
  17. Maak een kleine (2 cm) interscapulaire incisie met behulp van een scherp chirurgisch mes.
    LET OP: De snede moet oppervlakkig zijn, omdat de vetpad zich net onder de huid bevindt.
  18. Zoek het mediale bloedvat voor oriëntatie (figuur 2B).
  19. Til de huid aan de ene kant van de incisie met behulp van tangen en houd het uit de buurt van de vetpad, terwijl de transplantatie wordt uitgevoerd (Figuur 2B). Plaats de naald in de transplantaatplaats.
    1. Verplaats optioneel de punt van de naald in het weefsel en maak een klein zakje om de cellen te verzamelen. Gebruik een kleine, repetitieve beweging. Verwijder de naald niet.
      OPMERKING: Deze stap wordt aanbevolen voor nieuwe gebruikers van het protocol. Wees uiterst voorzichtig bij het maken van een zak, als de interscapulaire vet pad weefsel is zeer delicaat.
  20. Injecteer voorzichtig 40 μL van het celmengsel in het interscapulaire vetpadweefsel. Verwijder de naald langzaam.
  21. Houd het weefsel op zijn plaats en laat de getransplanteerde cellen genoegen nemen met 3-5 s. Gebruik indien nodig een extra paar tangen.
  22. Verwijder de naald. Herhaal de injectieprocedure (stappen 4.18-4.21) op de tweede plaats van transplantatie.
    OPMERKING: Het epitheel van één donorgroep kan in elk dier in dezelfde zijde van het vetpad worden geïnjecteerd, of afwisselende kanten om batch-effecten van de handdominantie van de chirurg te voorkomen.
  23. Sluit de chirurgische wond met behulp van wondclips of hechtingen en stop de anesthesie.
  24. Postoperatieve pijnstiller bieden, zoals aangegeven in institutioneel goedgekeurd protocol.
  25. Verplaats het dier onmiddellijk naar een herstelkooi met de warmtesteun. Controleer op tekenen van nood, zoals bloeden uit de incisie of moeite met ademhalen.
    OPMERKING: Het dier moet volledig herstellen binnen 5-10 min. Raadpleeg institutionele richtlijnen voor het terugbrengen van dieren naar de kolonie en postoperatieve monitoring na overlevingsprocedures.
  26. Doe optioneel carcinogenesestudies uit op de graftsite(s) door de ontvangende ratten 3-4 weken na transplantatie kankerverwekkende stoffen toe te dienen.
    OPMERKING: Typisch, rat borst carcinogenese wordt uitgevoerd met behulp van een chemische carcinogene behandeling op 50-57 dagen oud. Deze behandeling dicteert de leeftijd van de transplantatie chirurgie (die moet worden gedaan tussen 29-36 dagen oud) om voldoende tijd voor de geënte cellen om de groei van de borstklier te starten.

5. Beoordeling van epitheeluitgroei

  1. Monitor de estrus cyclus van ratten door middel van dagelijkse vaginale spoeling en onderzoeken de cytologie op een microscoop dia. Begin 8-12 dagen voor het eindpunt van de studie. Offer alle ratten op in hetzelfde stadium. Dit is een optionele stap.
    LET OP: De rat estrus cyclus is 4-5 dagen. Het toestaan van het dier te gaan door middel van 1-2 volledige cycli zal vergemakkelijken interpretatie, als lavage dia's uit eerdere cycli kan worden gebruikt voor vergelijking.
  2. Offer transplantatie ontvanger ratten 6-8 weken na transplantatie, volgens institutionele richtlijnen.
    OPMERKING: Uitgroei is meestal detecteerbaar 3-6 weken na transplantatie, maar extra tijd kan nodig zijn.
  3. Plaats het dier in een gevoelige positie en maak het lichaam schoon met 70% ethanol. Til de huid met tangen en maak een incisie langs de wervelkolom om de interscapulaire vet pad bloot. Ontleed de huid uit de buurt van het weefsel, zodat de meerderheid van de vetpad zichtbaar is.
  4. Identificeer het mediale bloedvat dat de transplantaatplaatsen in het interscapulaire vetpad scheidt. Accijns de hele pad als een enkel stuk weefsel of snijd langs het bloedvat en verwijder zijden individueel.
  5. Plaats het weefsel op een positief geladen microscoopdia voor hele mount. Gebruik 2 paar stompe tangen en voorzichtig verspreid het weefsel om de oorspronkelijke conformatie op de dia te herstellen.
    LET OP: Rat borstweefsel is zeer delicaat. De randen van het weefsel kunnen onder zichzelf krullen. Behandel altijd met zorg en houd op zijn plaats totdat het weefsel zich aan de glijbaan hecht (een paar seconden).
  6. Whole-mount ten minste een van de endogene buik-inguinale borstklieren (met lymfeklieren voor oriëntatie) ter vergelijking.
  7. Plaats de dia's in 70% ethanol voor 7-10 dagen om het weefsel te dfateren. Vul ethanol zo vaak als nodig is om ervoor te zorgen dat het weefsel niet uitdroogt.
  8. Bereid alum-karmijnvlek voor en verwerk de glijbanen wanneer het weefsel voldoende ondoorzichtig is. Laat de vlek afkoelen voor gebruik(Aanvullend Bestand 4).
    OPMERKING: De vlek kan worden voorbereid tot een dag van tevoren van de fixatie en rehydratie stappen. De oplossing kan worden opgeslagen bij 4 °C en heeft een beperkt potentieel voor hergebruik.
  9. Repareer het weefsel door de glijbanen in 25% glaciale azijnzuur te plaatsen: 75% ethanol gedurende 60 min.
    1. Rehydrateer het weefsel door middel van een reeks van 3 wasbeurten in een reeks afnemende concentratie ethanol: 70% ethanol voor 15 min, 50% ethanol voor 5 min en dH2O voor 5 min.
  10. Vlek met aluin karmijn voor 4-8 dagen. Controleer de achterkant van de dia's elke dag om te bepalen of de vlek volledig is doorgedrongen tot het weefsel. Ga naar de volgende stap wanneer de kleuring is voltooid.
    OPMERKING: Vlekken zijn voltooid wanneer de dikste delen van de klier een paarse tint hebben en niet meer wit lijken.
  11. Destain en dehydrateren van het weefsel door de overdracht van de dia's door middel van een reeks van toenemende concentratie ethanol: 70% ethanol voor 30 min, 95% ethanol voor 30 min en 100% ethanol voor 30 min.
  12. Plaats uitgedroogde dia's in xyleen gedurende 3 + dagen om het weefsel te wissen. Breng over naar minerale olie voor langdurige opslag.
  13. Nadat de dia's zijn gewist, gebruik maken van low-powered licht microscopie of hoge resolutie digitale fotografie om beelden van de dia's te verwerven voor analyse. Zorg ervoor dat parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen consistent zijn voor alle dia's.
    OPMERKING: Epitheliale uitgroei moet duidelijk te onderscheiden zijn.
  14. Behandel de aanwezigheid van uitgroei als een binaire uitkomst.
  15. Bereken het gemiddelde aantal getransplanteerde epitheelcellen die ≥1 borstuitgroei produceerden in 50% van de transplanteerlocaties met behulp van de verworven beelden. Kwantificering andere fysieke kenmerken, indien nodig.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Donor en ontvanger borstklieren
De stappen om rattenborstepitheelcellen te isoleren en voor te bereiden op transplantatie zijn weergegeven in figuur 1A. Op de leeftijd van 4 weken is de endogene borstklier van de donorrat begonnen met rijping en kan epitheel op geheel gemonteerde glijbanen worden gevisualiseerd die zijn gekleurd met aluincarmine(figuur 1B)....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een borstepitheel celtransplantatie techniek geoptimaliseerd voor het werken met ratten. Geïsoleerde borstepitheele-organoïden van donorratten (3-5 weken oud) worden geënt in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende ratten (ook 3-5 weken oud). Resultaten kunnen worden geïnterpreteerd zo weinig als 4-6 weken later, met behulp van lichte microscopie om het geënte weefsel te onderzoeken; De optimale tijd tussen transplantatie en opoffering moet echter worden bepaald voordat een volledig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de Hollings Cancer Center's Cancer Center Support Grant P30 CA138313 pilot onderzoeksfinanciering van de National Institutes of Health(https://www.nih.gov/),en fondsen van de afdeling Pathologie & Laboratoriumgeneeskunde aan de Medische Universiteit van South Carolina. We willen Marijne Smiths bedanken voor het opnemen van de interviewverklaringen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µM spuitfiltersFisher Scientific09-715Gsteriele-filtrerende collagenase-verteringsmedia
1,5 - 2,0 mL microcentrifugebuizen (sterieel)Fisher Scientific05-408-129met resuspendeerde cellen en/of hersenhomogenaatmengsel
100 µM celstrainersCorning431752filteren van hersenhomogenaat
100 uL gasdichte spuiten met 25 gauge naaldenHamilton81001 & 90525Voor het injecteren van graftmengsel in ontvangende dieren (1 per donor genotype/conditie)
1000 uL pipettentips + pipet--overbrengen van cellen/mengsels/weefsel
15 mL polypropyleenbuisFalcon (Corning)352196opslag van hersenhomogenaatmengsel, of cel : homogenaatmengsel voor transplantatie
40 µM celstrainersCorning431750filteren van organoïden na het wassen van het cellenpellet
50 mL polypropyleenbuizenFisher Scientific05-539-6voor collagenase-vertering van donormelkklierweefsel
60 mm schalenThermo Scientific130181voor het snijden van weefsel
Alum KaliumsulfaatSigma-Aldrich243361/237086kleuring van gehele melkklierpreparaten
Anesthesieverstuiver voor veterinair gebruik--volg het institutionele protocol
Beta-dine of jodium--
Borosilicaat glas kweekbuis voor homogenisatieFisher Scientific14-961-26voor homogenisatie van hersenen (gebruik de juiste buis voor de homogenisator)
KarmijnSigma-AldrichC6152/1022kleuring van gehele melkklierpreparaten
Celtellingsapparaat--
Schonemateriaal voor herstel--volg het institutionele protocol
Collagenase Type 3Worthington Biochemical Corp.LS004183enzymatische vertering van gesneden melkklierweefsel van donorratten
De-ioniserd water--voor chemische oplossingen
DMEM/F12GIBCO11320033voor het snijden van weefsel, collagenase-verteringsmedia en het resuspenderen van epitheliale cellenmengsels
EDTA--monodispersiemengsel
Ethanol, 200 ProofDecon Labs2705/2701fixatief voor gehele melkklierpreparaten, wassen voor gehele melkklierpreparaten, schoonmaken chirurgische incisieplaatsen (verdund)
Fataal runder serum (FBS)Hyclone-inactivatieoplossing
Gaze--
IJzerzuurFisher ScientificA38-212gebruik voor fixatief voor gehele melkklierpreparaten (1:4 ijzerzuur in 100% ethanol)
HBSSGIBCO-monodispersiemengsel
Verwarmingspads--volg het institutionele protocol
IJsemmers (x2)--
Incubator met orbitale rotatie--moet in staat zijn om 37°C te handhaven, schudden bij 220-225 RPM (voor collagenase-vertering van borstweefsel)
Isofluraane anesthesie--volg het institutionele protocol
Lichtmicroscoop of digitale camera--visueel bekijken van gehele gemonteerde borstpituitaire klier en/of het maken van afbeeldingen
Mechanische homogenisatorFisher Scientific-TissueMiser of alternatieve modellen
Mineraalolie, puurSigma-Aldrich/ ACROS Organics8042-47-5langetermijnopslag van verduidelijkte gehele melkklierpreparaten
Zuurstoftanks voor anesthesieverstuiver--volg het institutionele protocol
Papierdoekjes of delicate schoonmaakdoekjes--
Positief geladen microscoopglaasjesThermo ScientificP4981-001gehele melkklierweefselpreparaten
Postoperatieve pijnstiller--Institutioneel protocol
Schaallichaamsgewichtmetingen van dieren, juiste dosering van pijnmedicatie
Shaver--elektrische scheerapparaten, of andere
Kleurvaten--minimaal 1 per chemische was, formaat geschikt voor het aantal plaatjes, glas geprefereerd
Steriele velddoekenIMCO4410-IMCgebruikt tijdens transplantatie
Steriele schaar en pincetten x3 (geautoclaveerd)--autoclave chirurgische instrumenten gebruikt voor donoren en ontvangers
Spuiten: 5 mL (of groter)--voor steriele filtratie van collagenase-verteringsmedia
TrypsineWorthingtonmonodispersiemengsel
Afvalinzamelbak voor vloeistoffen (uitgegoten of aangezogen)--
Wondclipapparaat, clips, en verwijderingstoolFine Science Tools12020-00Het sluiten van de huidincisieverwonding boven het interscapulaire witte vetkussen
XyleenFisher ScientificX3S-4verduidelijken van gehele melkklierpreparaten na kleuring

Referenties

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343(1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173(1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7(2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634(1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002(2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Melkklier van de ratisolatie van melkklierweefselcollagenase digestiefiltratie met celzeefmengen met breinhomogenaatchirurgische injectie van het transplantaatwhole mount kleuringontwikkeling van de melkklier
Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.