Methodenartikel

Het volgen van superparamagnetische ijzer oxide-gelabelde mesenchymale stamcellen met behulp van MRI na intranasale levering in een traumatisch hersenletsel Murine model

DOI:

10.3791/60450

⸱

21 november 2019

 ,  ,  , 
1Ph.D. Program for Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University and National Health Research Institutes, 2Center for Neurotrauma and Neuroregeneration, Taipei Medical University, 3TMU Neuroscience Research Center, Taipei Medical University, 4Department of Neurosurgery, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Surgery, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gepresenteerd hier is een protocol voor niet-invasieve mesenchymale stamcel (MSC) levering en tracking in een muismodel van traumatisch hersenletsel. Superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes worden gebruikt als een magnetische resonantie imaging (MRI) sonde voor MSC labeling en niet-invasieve in vivo tracking na intranasale levering met behulp van real-time MRI.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stamcel-gebaseerde therapieën voor hersenletsel, zoals traumatisch hersenletsel (TBI), zijn een veelbelovende benadering voor klinische proeven. Technische hindernissen zoals de levering van invasieve cellen en het volgen met een lage transplantatie-efficiëntie blijven echter uitdagingen bij translationele stamgebaseerde therapie. Dit artikel beschrijft een opkomende techniek voor stamcel labeling en tracking op basis van de labeling van de mesenchymale stamcellen (MSCs) met superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) nanodeeltjes, evenals intranasale levering van de gelabelde MSCs. Deze nanodeeltjes zijn fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-ingebed en veilig om de MSCS te labelen, die vervolgens door de intranasale route aan de hersenen van TBI-geïnduceerde muizen worden geleverd. Vervolgens worden ze in vivo niet-invasief bijgehouden door real-time Magnetic Resonance Imaging (MRI). Belangrijke voordelen van deze techniek die SPIO combineert voor cellabeling en intranasale levering omvatten (1) niet-invasieve, in vivo MSC tracking na levering voor lange Volg perioden, (2) de mogelijkheid van meerdere doseringsschema's als gevolg van de niet-invasieve route van MSC levering, en (3) mogelijke toepassingen voor de mens, als gevolg van de veiligheid van SPIO, niet-invasieve aard van de cel-trackingmethode door MRI, en toedieningsweg.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn aantrekkelijke kandidaten voor stamcel-gebaseerde therapieën in behandelingen van aandoeningen van het centrale zenuwstelsel (CZS) en verwondingen bij de mens. Bovendien zijn MSCS gebruikt als een voertuig voor de afgifte van therapeutische eiwitten bij schade sites1,2. In de afgelopen jaren zijn veelbelovende innovaties ontwikkeld om 1) nieuwe routes van cellevering en 2) celtracering voor stamcel-gebaseerde therapieën van CZS-aandoeningen te vestigen. De intranasale levering van stamcellen in de hersenen hangt af van het vermogen van cellen om de cribriform plaat te omzeilen en de olfactorische bol gedeeltelijk in te voeren via een parenchymale route3. De combinatie van intranasale levering en het labelen van MSCS met superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) nanodeeltjes vertegenwoordigt een veelbelovende benadering voor klinische toepassingen van MSCS bij de behandeling van CZS-aandoeningen, aangezien SPIO nanodeeltjes zijn veilige sondes voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en toestaan niet-invasieve gevoelige longitudinale tracking van MSCS na levering door MRI3,4,5. Bovendien is intranasale levering een veilige en niet-invasieve route die herhaalde toediening binnen een korte tijd mogelijk maakt.

Dit artikel beschrijft een zeer gevoelige en niet-invasieve techniek voor het bijhouden van MSCs in vivo post-intranasale levering in een muismodel van traumatisch hersenletsel (TBI), die gebruik maakt van SPIO-gelabelde cellen en MRI. Een belangrijk voordeel van de SPIO-labeling is de gevoelige detectie van SPIO in weefsel door MRI, wat het mogelijk maakt om cellen efficiënt en niet-invasief te volgen. De hier gebruikte SPIO nanodeeltjes zijn commercieel beschikbaar en getagd met een fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) fluorophore, dat de detectie van SPIO in weefsel mogelijk maakt zonder immunokleuring of extra verwerking. Bovendien is het mogelijk om longitudinale real-time tracking uit te voeren en de biodistributie van de geleverde MSCs te onderzoeken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures met betrekking tot dieren in dit protocol zijn goedgekeurd door het Comité voor dierenverzorging en-gebruik, met de goedkeuring van de ethische commissie voor dier gebruik in de medische universiteit Taipei (goedkeurings nr. LAC-2018-0574; 15.03.2019).

1. etikettering van MSCs met SPIO nanodeeltjes

  1. Om MSCs met SPIO te labelen, voegt u 6 mL etiketterings media (25 μg/mL SPIO in het gemodificeerde Eagle medium van Dulbecco [DMEM] met geen foetaal runderserum [FBS]) toe aan een T75 kolf met MSCs (80% confluency).
  2. Incuberen de cellen met de etiketterings media in een CO2 -incubator (37 °c, 5% Co2) zonder te schudden. Verwijder na 24 uur de etiketterings media voorzichtig met een steriele Pasteur-pipet met een plastic punt dat aan een vacuüm is bevestigd. Was de cellen monolaag 2x met 6 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om eventuele sporen van een ongeinternaliseerde SPIO te verwijderen.
    1. Om te bepalen of de cellen met succes zijn gelabeld, controleert u de gelabelde cellen onder een fluorescerende Microscoop of confocale Microscoop als de SPIO zijn gelabeld met een de (dat wil zeggen, zoals die hier worden gebruikt; Figuur 1B, C). U ook Pruisisch blauwe vlekken voor de cellen uitvoeren (Zie stappen 6.2 – 6.4 voor het kleurings Protocol).
  3. Oogst aanhandige cellen door behandeling met 3 mL trypsine en inincuberen bij 37 °C. Voeg na 5 minuten incubatie 7 mL voorverwarmde DMEM-media toe met 10% FBS (v/v) om de trypsine te deactiveren. Verzamel de celsuspensie met een pipet in een conische buis van 15 mL.
  4. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in PBS. Tel de levensvatbare cellen met trypan blauwe kleurstof en een hemocytometer.
    Opmerking: De celpellet van de gelabelde cellen wordt als een donkere kleur weergegeven als gevolg van het laden van ijzer (figuur 1d). Dit protocol is relevant voor MSC-labeling en MRI-beeldvorming. De procedure voor MSC-labeling6 is eerder geoptimaliseerd en alleen de stappen voor het voorbereiden van gelabelde MSCS om in vivo bij te houden, zijn hier opgenomen, omdat in vivo tracking de focus is. Het protocol voor het kweken en labelen van andere celtypen moet worden geoptimaliseerd door de onderzoeker.
  5. Pas de celconcentratie aan met PBS tot 150.000 cellen (of een getal dat resulteert in een voldoende MRI-signaal) in 18 μL PBS (of het totale volume dat zal worden gebruikt bij de intranasale afgifte procedure).
    Opmerking: Het werd opgemerkt dat een celconcentratie hoger dan 150.000 cellen/18 μL PBS leidt tot celaggregatie, wat de efficiëntie van intranasale levering kan beïnvloeden. Als een hoger aantal cellen nodig is voor intranasale levering, Verhoog het totale volume van celsuspensie en verhoog het aantal intranasale toedieningen, omdat intranasale toediening een niet-invasieve procedure is en meervoudige dosering mogelijk is.

2. gecontroleerde corticale impact (CCI) letsel

Opmerking: In dit protocol, mannelijke C57 BL/6 muizen (7 – 8 weken oud) werden gehouden in een 12/12 h licht/donkere cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water.

  1. Om elke muis voor CCI letsel voor te bereiden, dien je de zolazepam (50 mg/kg) en xylazine (20 mg/kg) anesthetiserende cocktail toe via intraperitoneale (i.p.) injectie (1 mL/kg). Zorg ervoor dat de diepte van de anesthesie voldoende is door een gebrek aan teen-knijpen reactie. U ook de muis in een kamer plaatsen die wordt geleverd met 2% – 4% Isofluraan voor 60 s.
  2. Scheer de vacht van het rugoppervlak van de schedel tussen de oren met behulp van een elektronische Hair Clipper. Reinig het geschoren gebied meerdere malen met behulp van een steriel wattenstaafje geweekt in jodium. Gebruik een wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol te reinigen van de jodium.
  3. Plaats de verdoofd Mouse in het stereotactische frame en bevestig de muis met behulp van oorstangen en neus stangen. Maak een midsagittale incisie (ongeveer 2,5 cm) in de geschoren huid met behulp van steriele schaar om toegang te krijgen tot het oppervlak van de schedel.
  4. Verwijder het weefsel op het bot met behulp van een wattenschijfje om de schedel bloot te leggen. Reinig het schedel oppervlak met een wattenstaafje gedrenkt in een 3% H2O2 voor 10 s, reinig het dan met een droge wattenschijfje.
    Opmerking: De schedel hechtingen en zowel bregma als Lambda kunnen nu gemakkelijk geïdentificeerd worden.
  5. Identificeer de coördinaten van de keuze op het schedel oppervlak voor het CCI-letsel en teken een cirkel (4 mm diameter) rond de coördinaten met behulp van een potlood of een goede marker.
    Opmerking: In dit protocol werden de coördinaten bij anteeroposterior (AP)-2,0 mm en Mediolaterale (ML) + 1,5 mm gebruikt voor CCI-inductie.
  6. Gebruik een microdrill en ronde Braam (0,5 mm diameter) om de schedel te verdunnen aan de gemarkeerde cirkel. Vermijd het toepassen van druk tijdens het boren, als het boren door het bot kan schade toebrengen aan de hersen parenchym. Reinig bot stof weg met een schoon en droog wattenstaafje.
  7. Verwijder voorzichtig de botflap met een steriele fijne tang om de dura mater bloot te leggen terwijl deze intact blijft. Verwijder de muis uit het Stereotactisch frame dat werd gebruikt voor de voorbereiding van het letsel en plaats het in het stereotactische frame van het CCI-apparaat.
  8. Stabiliseer het hoofd van de muis met behulp van de gehoor stangen en neus stangen. Zorg ervoor dat het hoofd van de muis niveau in de rostral-caudal richting en pas de Nose bars, indien nodig.
  9. Volg de instructies op de bedieningskast om het botslichaam uiteinde op het blootgestelde corticale oppervlak te nihil. Zorg ervoor dat de punt van het botslichaam direct boven de gewenste cortex-coördinaten wordt uitgelijnd om te worden beïnvloed met behulp van de X-en Y-besturings wielen op de basis van het botslichaam.
  10. Stel de experiment parameters in met behulp van de bedieningskast met een snelheid van 5 m/s, dwelltijd van 250 MS en blessure diepte van 1 mm voor het opwekken van licht letsel in de muis.
  11. Letsel veroorzaken door op de knop ' impact ' op de bedieningskast te drukken. Swab elke bloeding die optreedt met een steriel wattenstaafje.
  12. Verwijder de muis uit het stereotactische frame en sluit de incisie met behulp van zijden chirurgische hechtingen. Gebruik geen metalen klemmen om de operatieplaats te sluiten, omdat de muis wordt onderworpen aan een magnetisch veld voor MRI.
  13. Breng actuele antibiotica (bacitracine neomycine) aan op de operatieplaats om infecties te voorkomen. Houd de muis op het verwarmingspaneel en bewaak deze nauwkeurig tijdens de herstelfase.
  14. Toedienen ketoprofen (2,5 mg/kg, IP) dagelijks gedurende 3 dagen na de operatie, tenzij de ketoprofen administratie in tegenspraak met de studiedoelen.

3. intranasale levering

  1. Bij 1 dag na CCI inductie, toedienen van de zolazepam (50 mg/kg) en xylazine (20 mg/kg) anesthetiserende cocktail via i.p. injectie. Zorg ervoor dat de muis diep verdoofd door gebrek aan teen-knijpen reactie.
  2. Bereid de muis voor op intranasale levering van MSCs door hyaluronidase behandeling.
    1. Pak de Scruff van de muis en zet de rug stevig aan terwijl je de schedel immobiliseren. Plaats het uiteinde van een pipet dat hyaluronidase bevat in steriele PBS (4 U/μL) in de buurt van het neusgat van de muis in een hoek van 45 °.
    2. Dien 3 μL hyaluronidase suspensie in elk neusgat toe. Houd de muis geïmmobiliseerd en naar boven gericht op een schoon pad voor 5 min. herhaalde hyaluronidase behandeling 4x (totaal 100 U hyaluronidase suspensie).
  3. Na hyaluronidase behandeling, houd de behandelde muis op een schone pad naar boven gericht voor 30 min.
  4. Om MSCs in de hersenen te leveren, houdt u de muis stevig vast, zoals beschreven in stap 3.2.1. Dien 3 μL/neusgat van MSC-suspensie toe met een interval van 3 sec. Houd de muis gedurende 30 sec. ingedrukt totdat de monster druppels volledig verdwenen zijn.
    Opmerking: Vermijd het vormen van luchtbellen tijdens toediening.
  5. Herhaal de toediening met een interval van 2 minuten tot 3x.
    Opmerking: Het totale aantal te leveren cellen is 150.000, zodanig dat 18 μL celsuspensie kan worden geleverd bij een dosering van 3 μL voor elk neusgat, 3x elk.
  6. Keer de muis terug naar de kooi en bewaak deze nauwkeurig totdat deze volledig is hersteld van anesthesie.

4. in vivo magnetische resonantie beeldvorming

Opmerking: Histologische kleuring van hersenweefsel is eerder gebruikt om de succesvolle levering van stamcellen na intranasale toediening te bevestigen. Deze methode kan echter alleen worden gebruikt als een eindpunt van een studie, niet longitudinaal. Met behulp van MRI-sondes om therapeutische stamcellen te labelen, kunnen longitudinale, niet-invasieve, in vivo tracking van de cellen met behulp van MRI worden gebruikt. Belangrijk is dat dit protocol het aantal benodigde dieren op efficiënte wijze vermindert. In dit protocol werd MRI-Scanning uitgevoerd op dag 1, 7 en 14 na levering van MSCs.

  1. Om de muis voor te bereiden op MRI-Scanning, anesthetiseer de muis met Isofluraan (5% Isofluraan in 1 L/min van O2 voor inductie, 1.5% – 2% Isofluraan voor onderhoud). Voer een teen-pinch om ervoor te zorgen dat de muis het vereiste anesthesie niveau bereikt.
  2. Plaats de muis op de Imaging houder en bevestig de positie met behulp van kranen of een andere juiste methode. Verplaats de houder naar het midden van de MRI-spoel (7 T/40 cm magneet) en sluit de bewakings verbinding aan.
  3. Voor het verkrijgen van T2 *-gewogen scans met behulp van een spin-ECHO-reeks stelt u de herhalings tijd (TR) in op 1500 MS en ECHO time (TE) tot 2,8 ms.
  4. Gebruik een 16 mm x 16 mm gezichtsveld (FOV), 128 x 128 acquisitie matrix (MTX) en een snijdikte van 0,75 x 0,8 mm2 met vier signaal gemiddelden en een 90 ° Flip Angle (FA).
  5. Trek de muishouder uit het MRI Coil Center na het voltooien van de scans. Keer de muis terug naar de kooi en bewaak deze nauwkeurig totdat deze volledig is hersteld van anesthesie.
  6. Om de gelabelde MSCs op de T2 *-gewogen afbeeldingen te volgen en te kwantificeren, gebruikt u ITK-SNAP-software (versie 3.8.0)7.
    1. Breng de onbewerkte gegevens van de MRI-scans over van de computer van de MRI-machine naar de computer die wordt gebruikt voor analyse in een DICOM-formaat (Digital Imaging and Communications in Medicine).
    2. Voer de ITK-SNAP-software uit en laad de MRI-beelden door op de knop bestand te klikken. Klik vervolgens op Open hoofdafbeelding in het menu. Druk op de knop afbeelding openen in het weergavevenster en zoek en open de MRI-beelden met behulp van de knop Bladeren .
      Opmerking: De visualisatie van gelabelde cellen in de MRI-beelden zal verschijnen als intense gebieden. Als het contrast van de afbeelding moet worden aangepast, selecteert u extra | Beeld contrast.
    3. Maak segmentaties van de intense gebieden en laesie of andere hersendelen door actief label te selecteren in het gedeelte segmentatie labels. Gebruik verschillende Labelkleuren voor verschillende segmenten (als de segmentatie van meer dan een deel nodig is).
    4. Gebruik het gereedschap veelhoek in de hoofdwerkbalk om te tekenen rond de intense-gebieden die de SPIO-gelabelde MSCS vertegenwoordigen. Selecteer accepteren, onder de MRI-afbeelding. De gesegmenteerde gebieden worden weergegeven als dezelfde kleur van het actieve label dat aan het desbetreffende segment is toegewezen. Herhaal deze segmenterings stap voor alle MRI-segmenten.
    5. Ontwikkel een 3D-kaart van de gesegmenteerde gebieden om de MSC-distributie in de hele hersenen weer te geven door de scalpel-tool onder aan de 3D-werkbalkte selecteren, in de Segmenterings labels sectie onderaan theitk-snap Toolbox. Druk vervolgens op accepteren onder aan de gemaakte 3D-kaart.
    6. Als u een kwantitatieve analyse (volume-en intensiteits gemiddelde) van de gesegmenteerde intense-gebieden wilt uitvoeren die gelabelde cellen vertegenwoordigen, drukt u op de knop segmentatie in het bovenste deelvenster en selecteert u volume en statistiek.

5. fixatie van de muis hersenen en Cryosectioning

  1. Om de muis hersenen te repareren, voert u transcardiac perfusie uit met 4% Paraformaldehyde (PFA) na de laatste MRI-scan, zoals eerder beschreven8.
    1. Onthooi het hoofd en pak de hersenen8. Bevestig de hersenen met 4% PFA voor ten minste 48 uur bij 4 °C.
    2. Dehydraat de hersenen door het onder te dompelen in een 30% sucrose-oplossing bij 4 °C totdat de hersenen naar de bodem van de oplossing zinkt.
  2. Sluit de hersenen in de optimale snijtemperatuur (OCT) oplossing en Vries bij-20 °C. Deel de hersenen met een cryostaat microtoom in plakjes met een dikte van 14 μm en monteer ze op dia's. Bewaar de delen glaasjes bij-20 °C tot verder gebruik.

6. Pruisische blauwe kleuring

Opmerking: Pruisische blauwe kleuring wordt vaak gebruikt om het ijzergehalte in SPIO-gelabelde cellen te detecteren. Hier wordt Pruisische blauwe kleuring gebruikt om te bevestigen dat de intense signalen in de MRI-beelden corresponderen met de SPIO-gelabelde MSCS en niet met artefacten. Pruisische blauwe kleuring is een van de meest gevoelige histochemische methoden die worden gebruikt om ijzer in weefsels te detecteren en kan worden gebruikt om zelfs een enkele korrel van ijzer in de cellen te identificeren.

  1. Was de glijbanen van hersendelen met gedestilleerd water gedurende 5 min.
  2. Voer Pruisisch blauwe kleuring uit door de glaasjes 30 minuten onder te dompelen in de kleurings oplossing, die gelijke delen bevat zoutzuur (10%) en kaliumferrocyanide (10%) onmiddellijk voor gebruik worden bereid.
  3. Was 3x met gedistilleerd water, voor 5 min elk. De secties met nucleair snel rood voor 5 min. Spoel de dia's 2x met gedistilleerd water.
  4. Dehydraat de secties geleidelijk door het onderdompelen van de dia's in 95% en 100% alcohol voor 2 min elk. Voeg een dekslip toe met een harsachtige montage medium.
  5. Gebruik een lichte Microscoop om de bevlekte cellen in de hersengedeelten te detecteren.
    Opmerking: Het ijzer in de gelabelde cellen wordt weergegeven als blauw gekleurde afzettingen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vierentwintig uur na intranasale levering werden de SPIO-gelabelde MSCS gedetecteerd als sterke intense-gebieden die mediaal waren voor de cortische verwonding op T2 *-gewogen beelden (Figuur 2b), wat de gerichte migratie van SPIO naar de wond plaats aangeeft. Deze migratie bleef zichtbaar tot 14 dagen na levering, omdat de intense signalen zichtbaar bleken te zijn zonder significante reductie voor deze periode (Figuur 2b). De gewonde dieren die met PBS behandeld werden, toonden geen intense gebieden, wat erop duidt dat de waargenomen intense gebieden corresponderen met de SPIO gelabelde MSCS en niet naar signaal artefacten (Figuur 2a) de biodistributie van de gelabelde MSCS die in vivo werden waargenomen met MRI werd gevisualiseerd met behulp van 3D reconstructie (Figuur 2C, D). De migratie van MSCs naar de gewonde cortex werd histologisch bevestigd door Pruisische blauwe kleuring en FITC-kanaaldetectie van de SPIO met de FITC-tag in het gelabelde MSCs (Figuur 3A, B).

figure-results-1
Figuur 1: schematisch stroomschema van het protocol en in-vitro bevestiging van SPIO-opname door MSCS. (a) MSCS werden geïnpoleerd met SPIO voor 24 uur voor etikettering. Vervolgens werden de gelabelde MSCs in een TBI-muismodel afgeleverd via een intranasale (IN) route. MRI op verschillende tijdstippen werd uitgevoerd om de gelabelde MSCs bij te houden. bevestiging van voldoende labeling van MSCs door SPIO werd bereikt door (B) fluorescentiemicroscopie en (C) confocale microscopie met behulp van het FITC-kanaal, omdat SPIO-nanodeeltjes werden getagd met FITC. (D) de celpellet van het gelabelde MSCs verscheen donker van kleur als gevolg van ijzer belasting. FITC = fluoresceïne isothiocyanaat; SPIO = superparamagnetische deeltjes van ijzeroxide; MSCs = mesenchymale stamcellen; MRI = magnetische resonantie beeldvorming; IN = intranasale; TBI = traumatisch hersenletsel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: real-time MRI maakt het opsporen en volgen van SPIO-gelabelde MSC-migratie naar verwondings sites in de hersenen van TBI-geïnduceerde muizen mogelijk. A) muizen werden onderworpen aan TBI, gevolgd door behandeling met PBS of SPIO-gelabelde MSCS, toegediend via een intranasale route 24 h na letsel. Coronale secties van T2 *-gewogen beelden toonden de gelabelde MSCS als een intense gebied (pijlpunt) aan de rand van de wond site (omlijnd gebied) op 1, 7 en 14 dagen na levering. De met PBS behandelde muizen vertonen geen intense gebied. (B) segmentatie proces van het gebied van de schade site (groen) en gelabelde MSCS (rood) op basis van coronale T2 *-MRI-beelden. (C) 3D reconstructie van de muis hersen behandeling op basis van T2 *-gewogen beelden ter illustratie van de biodistributie van SPIO-gelabelde MSCS in de hersenen 14 dagen na levering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: histologische analyse bevestigt de aanwezigheid van SPIO-gelabelde MSCs in de hersenen van de behandelde dieren. Pruisische blauwe kleuring van hersengedeelten van een (a) muis behandeld met PBS (controle) en (C) muis behandeld met SPIO-GELABELDE MSCS. SPIO-positieve cellen werden gedetecteerd in MSC-behandelde muis (boxed cellen, blauw), terwijl de besturings muis geen positieve cellen toonde op de wond plaats in de cortex na 14 dagen na levering, bevestigende MRI-waarnemingen Fluorescentiemicroscopie analyse van de cortex van een (B) Control Mouse behandeld met PBS en (D) muis behandeld met SPIO-gelabelde MSCS werd uitgevoerd 14 dagen na levering. De analyse toonde de aanwezigheid van FITC-Tagged SPIO-positieve cellen (boxed cellen, groen) bij de gewonde cortex in de met MSC behandelde muis, maar er werden geen FITC-signalen waargenomen in de cortex van de PBS-behandelde muis. Schaal staven = 50 μm, tenzij anders aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt algemene procedures voor de SPIO-labeling van MSCs en MRI-tracking van SPIO-gelabelde MSCs post-intranasale levering. Het protocol biedt de mogelijkheid om de migratie en biodistributie van MSCs Post-delivery in vivo in de hersenen te bestuderen, met behulp van een niet-invasieve methode.

MSCS zijn aantrekkelijke kandidaten voor stamcel-gebaseerde therapieën voor CZS-aandoeningen en verwondingen als gevolg van hun vermogen om trofische factoren die 1) trigger neurorestorative processen en 2) bieden neuroprotectie, als gevolg van hun anti-inflammatoire effecten binnen het letsel gebied9,10,11,12. Hoewel lange termijn MRI-tracking en detectie van SPIO-gelabelde MSCs kan worden beperkt als gevolg van de verdunning van intercellulaire SPIO met celdeling, gelabelde cellen kunnen worden gedetecteerd voor maximaal enkele weken na transplantatie in de hersenen van dierlijke modellen13.

Ook hier beschreven is het labeling Protocol van MSCs met SPIO nanodeeltjes bedekt met dextran zonder transfectie agenten. Andere protocollen zijn gebruikt in de literatuur14,15,16. Echter, in alle gevallen moeten deze protocollen worden aangepast voor celtype, SPIO-grootte, incubatietijd en SPIO-concentratie. MSCs is aangetoond dat verminderde chondrogenic differentiatie potentieel, maar niet adipogenic differentiatie op SPIO labeling17. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om differentiatie testen uit te voeren voordat stamcel levering wordt uitgevoerd om de invloed van SPIO op de differentiatie potentie van stamcellen te evalueren. In een eerdere studie, werd aangetoond dat MSC labeling met hetzelfde SPIO type en de concentratie gebruikt in het hier geen invloed op de osteogenic of adipogene differentiatie potentie van MSCs6.

De intranasale route van therapeutische stamcel afgifte voor hersenaandoeningen en letsels is een veelbelovende benadering voor de klinische toepassing van stamcellen. De intrinsieke en moleculaire mechanismen die het gedrag van stamcellen in de neusholte dicteren, blijven echter onduidelijk. Hoewel de intranasale route op grote schaal wordt verkend voor de levering van kleine moleculen, verschillen de grootte en het bioverdelings gedrag van de therapeutische stam van kleine moleculen. Het huidige protocol toont aan dat MSCs de neiging om te migreren naar de site letsel na intranasale levering.

Hier werden T2 *-gewogen afbeeldingen gebruikt om de SPIO-gelabelde MSCs te volgen. Andere rapporten hebben gebruik gemaakt van gradiënt ECHO Imaging. Echter, gevoeligheids artefacten worden vaak waargenomen in gradiënt ECHO Imaging als gevolg van intercellulaire SPIO. In het huidige protocol was de locatie van de intense-gebieden die de SPIO-gelabelde MSCS op T2 *-gewogen beelden vertegenwoordigen, dezelfde als de locatie van de SPIO in hersengedeelten, zoals gedetecteerd door histologisch onderzoek (Figuur 3). Dit duidt op de adequate gevoeligheid van T2 *-gewogen spin ECHO Imaging voor SPIO-gelabelde MSC tracking in de hersenen.

Samengevat, het beschreven protocol is gunstig voor in vivo stamcel tracking studies van hersenletsel en aandoeningen. De longitudinale tracering van stamcellen in vivo wordt traditioneel uitgevoerd door het offeren van dieren op meerdere tijdspunten. Het huidige protocol biedt een niet-invasieve en efficiënte aanpak voor het leveren en volgen van MSCs, wat een mogelijke procedure voor stamcel-gebaseerde therapie voor hersenletsel en aandoeningen in klinische instellingen vertegenwoordigt.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en technologie subsidies, Taiwan (meest 104-2923-B-038-004-MY2, de meeste 107-2314-B-038-063, en de meeste 107-2314-B-038-042) en Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121 -01-N-05 en DP2-108-21121 -01-N-05-01).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celcultuurbenodigdheden (Kunststoffen)ThermoFisher ScientificVariesVervangbaar met elke bron
Wegwerp MicrotomenmesVWR95057-832
D-MEM/F-12 (1x) met GlutaMAXGIBCO10565-018
Inbeddingsmedium voor ingevroren weefselspecimens (O. C. T.)Sakura Finetek4583
Foetaal runder serum (FBS)GIBCO12662-029
Fluorescentie Wild Field MicroscoopOlympusOlympus BX43
ForceptFine Science Tools11293-00Chirurgie
Gentamicine (10 mg/mL)GIBCO15710-064
HaarkapperPet ClubPC-400
Head Trauma Contusion apparaatPrecision Systems and InstrumentationModel TBI-0310
Hyaluronidase uit runder testesMilliporeSigmaH3506
ITK-SNAP SoftwarePenn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) aan de Universiteit van Pennsylvania, en het Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) aan de Universiteit van UtahITK-SNAP 3.8.0
Ketamine (Ketavet)Pfizer778-551
MuizenNationaal Laboratorium Diercentrum, TaiwanC57BL6Wild type muisensoort gebruikt in de studie
MicroboorNakanishiNE50Combineren met boren voor het genereren van het botvenster
MicrotoomLeicaRM2265
Muis (C57BL/6) Mesenchymale StamcellenGIBCOS1502-100
MRI-scannerBruker Biospec
Fosfaat Buffer Saline (PBS)Corning Cellgro/ThermoFisher21-031-CV
Povidon-jodium 7,5%Purdue product L.P.Chirurgisch scrub
Pruisisch Blauw KleurAbcamab150674
SchaarFine Science Tools14084-08Chirurgie
Stereotaxisch frameKopf InstrumentsModel 900
Superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) nanodeeltjesBioPALMolday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51Stamcellen labeling voor in vivo tracking met behulp van MRI
Hechtdraad monofilamentEthiconG697Hechting
TimerWisewindVervangbaar met elke bron
TrypLEGIBCO12604-013
Xylazin (Rompun)BayerQN05 cm92

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelled, G., et al. Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon. Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).
  2. Shahror, R. A., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. Journal of Neurotrauma. , (2019).
  3. Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).
  4. Karussis, D., et al. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).
  5. Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease. Cell Transplant. 23, Suppl 1 123-139 (2014).
  6. Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  7. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  8. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  9. Li, Y., Chopp, M. Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury. Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).
  10. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275, Pt 3 411-426 (2016).
  11. Ohtaki, H., et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).
  12. Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).
  13. Hoehn, M., et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).
  14. Reddy, A. M., et al. In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI. Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).
  15. Roeder, E., et al. Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study. PLoS ONE. 9 (5), e98451(2014).
  16. Schafer, R., et al. Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability. Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).
  17. Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis. NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Magnetische resonantiebeeldvormingcelmarkeringfluorescentiemicroscopiegecontroleerde corticale impactT2 ster gewogenPruisisch blauw kleuring

Gerelateerde artikelen