Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

6.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60455

⸱

12 december 2019

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

In dit artikel

Samenvatting

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Samenvatting

Inkeping signalering regelt het onderhoud van neurale stam/progenitorcellen door celcelinteracties. De componenten van Inkeping signalering vertonen dynamische expressie. Inkeping signalering Effector Hes1 en de inkeping ligand Delta-like1 (dll1-) worden uitgedrukt in een oscillerende manier in neurale stam/voorlopercellen. Omdat de periode van de oscillerende expressie van deze genen zeer kort is (2 uur), is het moeilijk om hun cyclische expressie te monitoren. Om zulke snelle veranderingen in de genexpressie of eiwit dynamiek te onderzoeken, zijn snelle respons verslaggevers vereist. Vanwege de snelle rijpings kinetiek en hoge gevoeligheid is de Bioluminescentie reporter plaats geschikt om snelle genexpressie veranderingen in levende cellen te monitoren. We gebruikten een gedestabiliseerde plaats reporter voor het bewaken van de organisator activiteit en een plaats-gesmolten reporter voor visualisatie van eiwit dynamica bij een enkele celresolutie. Deze bioluminescentie verslaggevers vertonen een snelle omzet en genereren zeer zwakke signalen; Daarom hebben we een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem ontwikkeld om dergelijke zwakke signalen te detecteren. Deze methoden stellen ons in staat om verschillende genexpressie dynamiek in levende cellen en weefsels te monitoren, wat belangrijke informatie is om de werkelijke cellulaire toestanden te helpen begrijpen.

Inleiding

Het zoogdier brein bestaat uit een groot aantal verschillende soorten neuronen en gliacellen. Alle cellen worden gegenereerd uit neurale stam/voorlopercellen (npc's), die eerst prolifereren om hun getallen uit te breiden, dan beginnen te differentiëren in neuronen, en ten slotte geven aanleiding tot gliacellen1,2,3,4,5. Zodra cellen zijn gedifferentieerd in neuronen, ze kunnen niet vermenigvuldigen of hun aantallen te verhogen, en daarom, het onderhoud van Npc's tot latere stadia is belangrijk. Notch signalering via celcelinteracties speelt een belangrijke rol bij het handhaven van npc's6,7. Notch liganden interactie met het membraan eiwit, Inkeping, op het oppervlak van de naburige cellen en activeert de inkeping eiwit. Na activering komt proteolyse van Inkeping eiwit voor, waardoor het intracellulaire domein van Inkeping (NiCd) van het celmembraan in de Nucleus8,9,10wordt vrijgegeven. In de Nucleus bindt NICD aan de organisator regio's van Hes1 en Hes5 (Hes1/5) en activeert de expressie van deze genen. Hes1/5 Druk op de uitdrukking van de proneural genen Ascl1 en Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Omdat proneural genen neuronale differentiatie induceren, spelen Hes1/5 essentiële rollen bij het onderhouden van npc's. Bovendien, als proneural genen de uitdrukking van de inkeping ligand Delta-like1 (Dll1-) kunnen activeren, Hes1/5 ook onderdrukken de uitdrukking van dll1-. Daarom, de uitdrukking van Dll1-leidt tot de naburige cellen negatief voor Dll1-via inkeping signalering. Op deze manier, cellen remmen aangrenzende cellen van het volgen van hun zelfde lot, een fenomeen bekend als de laterale remming8. In de ontwikkelende hersenen speelt laterale remming een rol bij het genereren van verschillende celtypen.

Real-time beeldvorming op het niveau van één cel onthult dynamische expressies van de componenten van Inkeping signalering in npc's15,16,17. Notch signalering activeert de uitdrukking van Hes1, maar Hes1 eiwit bindt aan zijn eigen promotor en onderdrukt zijn eigen uitdrukking. Bovendien is Hes1 een extreem onstabiel eiwit, dat wordt aangetast door het ubiquitin-proteasome traject; Daarom is de onderdrukking van zijn eigen promotor slechts van korte duur en vervolgens begint de transcriptie opnieuw. Op deze manier, de uitdrukking van Hes1 schommelt op zowel de transcriptie en translationele niveaus in een 2 h cyclus18. De oscillerende uitdrukking van Hes1 induceert op zijn beurt de oscillerende expressie van de downstream-doel genen, zoals Ascl1, Neurog2 en dll1-, via periodieke repressie15,16,17,19. Terwijl proneural genen neuronale differentiatie kunnen induceren, is hun oscillerende expressie niet voldoende voor Neuronale Differentiatie; hun aanhoudende expressie is veeleer essentieel voor de neuronale differentiatie. De oscillerende expressie van proneural genen is belangrijk voor het onderhouden van npc's in plaats van voor het induceren van neuronale differentiatie14,15,16. De uitdrukking van dll1- oscilleert op zowel de transcriptie-als translationele niveaus tijdens verschillende morfogenese, zoals neurogenese en somitogenese. De dynamische expressie van dll1- is belangrijk voor de normale morfogenese en gestage expressie van dll1-induceert defecten in neurogenese en somitogenese17. Deze bevindingen tonen de belangrijke functie die de dynamiek van genexpressie en eiwit kinetiek heeft op de regulering van verschillende ontwikkelings gebeurtenissen (d.w.z. dat verschillende expressie dynamiek verschillende outputs in cellulair gedrag oplevert).

Voor het analyseren van de dynamiek van Inkeping signalering, de statische analyse van weefsels en cellen zijn onvoldoende omdat ze voortdurend veranderen. Real-time beeldvorming van enkele cellen is een krachtig hulpmiddel om de dynamiek in genexpressie te onthullen. De dynamische uitdrukking van inkepingen signalering moleculen ondergaan snelle cyclische reacties in de periode van 2-3 h. Deze snelle periodieke uitdrukking presenteert twee moeilijke problemen voor de real-time monitoring: (1) de uitdrukking van de moleculen wordt onderdrukt tot lage niveaus, en (2) snelle omzet vereist snelle respons Reporters. Om deze problemen te overwinnen, ontwikkelden we eerder een bioluminescentie real-time beeldvormings methode20. Omdat de Bioluminescentie reporter een hogere gevoeligheid en kortere rijpingstijd heeft dan fluorescerende reporters, stelt deze strategie ons in staat om de snelle dynamiek in levende cellen te monitoren. Met behulp van real-time visualisatie ontdekten we dat meer genen dynamische expressie vertoonden dan we eerder dachten. Daarnaast is het aantal rapporten met uitdrukking en eiwit dynamiek in levende cellen en de betekenis van deze dynamiek in verschillende biologische gebeurtenissen toegenomen, wat een fundamentele rol van de dynamiek in genexpressies21,22suggereert.

In dit rapport beschrijven we een manier om de uitdrukking van de inkeping ligand dll1-in npc's in zowel gezien culturen als in corticale segment culturen te visualiseren. Om de dynamiek van dll1- transcriptie op één celniveau te monitoren, genereerden we gezien culturen van npc's afgeleid van de embryonale telencephalon van transgene muizen met pDll1-UB-Fluc Reporter, een dll1-Promoter-gedreven gedestabiliseerde plaats Reporter. Om Dll1-proteïne dynamica in vivo te monitoren, introduceerden we de Dll1--Fluc Fusion reporter in Npc's in de cortex en visualiseerde de uitdrukking van de reporter in Npc's in corticale segment culturen. Real-time Imaging stelde ons in staat om de verschillende kenmerken van genexpressie en eiwit dynamiek in levende cellen te vangen met een hoge temporele resolutie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures, waaronder dierproef personen, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van het Instituut voor grens leven en medische wetenschappen, de Universiteit van Kyoto.

1. bioluminescentie verslaggevers

Opmerking: de plaats reporter is geschikt voor het meten van de snelle dynamiek van de organisator activiteit door het degradatie signaal te fusing. Bovendien maakt de plaats Fusion reporter het mogelijk om de eiwit dynamiek in de enkele cel te bewaken. Beide soorten verslaggevers zijn beschikbaar voor mono-Layer cultuur (dissociatie cultuur) en weefselcultuur (slice Culture) experiment.

  1. Reporter voor monitoring Dll1-Promoter activiteit17
    Opmerking: om de snelle veranderingen in genexpressie te monitoren, is de snelle respons en instabiele reporter essentieel. Firefly plaats (Fluc) toont snelle rijping in vergelijking met fluoresceïne Reporters. Omdat ubiquitine Fused plaats Reporter (UB-Fluc) snelle afbraak en snelle-omzet vertoont, is het zeer nuttig om de dynamische genexpressie in levende cellen20te monitoren.
    1. Gebruik dll1-door de promotor gedreven gedestabiliseerd plaats Reporter, alomtegenwoordige plaats (pDll1-UB-Fluc, Figuur 1A bovenste paneel), om snelle veranderingen in dll1- expressie op een transcriptionele niveau17te monitoren.
    2. Genereer een transgene muis lijn die pDll1-UB-Fluc draagt voor de stabiele uitdrukking van deze Reporter.
  2. Reporter voor monitoring Dll1-Protein Dynamics17.
    1. Voor het genereren van knock-in muizen, steek de plaats cDNA in de 3 ' Termini van de dll1-coderende regio, zodat dll1--plaats fusie-eiwit wordt uitgedrukt (dll1--Fluc Reporter, Figuur 1A, onderste paneel)17.
    2. Bewaak de expressie dynamiek van dll1-op eiwit niveaus door het meten van de plaats-activiteit.
    3. Voor het monitoren van Dll1-eiwit dynamica op weefsel niveaus, introduceert de Dll1--Fluc reporter in Npc's in de embryonale telencephalon door in utero elektroporation.

2. bioluminescentie beeldvormings systeem

  1. Bouw een bioluminescentie Live-Imaging systeem met behulp van een omgekeerde Microscoop geïnstalleerd met een zeer gevoelige, watergekoelde CCD-camera. Om het lawaai te verminderen en een hoge gevoeligheid te verkrijgen, moet u de camera koelen met gekoeld water dat door de watercirculatie wordt geleverd bij een geoptimaliseerde temperatuur van-90 °C.
  2. Voor de Live Cell/weefsel beeldvorming installeert u het incubatie systeem, waarbij de temperatuur en het gemengde gas worden bestreden tot de Microscoop fase.
  3. Voor Imaging de uitdrukking van gedestabiliseerde plaats Reporter, gebruik hoge numerieke hoek (na: 1,30) 40x olie-onderdompeling objectief objectief. De werkafstand van deze lens is 0,2 mm, het is beschikbaar voor niet alleen mono-Layer celcultuur, maar ook segment cultuur.
  4. Voor dubbele bewaking van plaats en fluoresceïne reporter expressie, installeert u het LED-verlichtings apparaat op het lichtpad van de Microscoop.
  5. Bedien de time-lapse Imaging met een software die is gekoppeld aan de Microscoop (bijv. multidimensionaal acquisitie programma van MetaMorph software).
  6. Bereid het hele systeem in een donkere kamer, omdat het signaal van de gedestabiliseerde plaats reporter is zeer vaag, en om te voorkomen dat het vreemde licht te voorkomen dat de overname.

3. neurale stam/voorlopercellen (NPC) dissociatie culturen

  1. Bereiding van cultuur media, gerechten en reagentia voor NPC dissociatie cultuur
    1. Bereid N2/B27 media voor het kweken van neurale stam/voorlopercellen met een uiteindelijke concentratie van 1x N2, 1x B27, 1 mM N-Acetylcysteïne, 10 ng/mL bFGF en 50 U/mL Penicillair/streptomycine in DMEM/F12 media.
    2. Bereid papaïne oplossing voor dissociatie met 7 U/mL papaïne, 0,006% DNase en 1 mM N-Acetylcysteïne in EBSS media.
    3. Bereid 100 mM luciferine natrium oplossing voor luminescentie Imaging. Verdun 100 mM luciferine-oplossing in N2/B27-media tot een eindconcentratie van 1 mM.
      Opmerking: luciferin toont auto-fluorescein zelf. In het geval van Luciferase-fluorescentie Dual Imaging, met name EGFP, het verlagen van de concentratie van luciferine tot 0,5 mM is beter.
    4. Jas een 35-mm glasbodem gerechten (glazen diameter 27-mm) met 40 μg/mL poly-L-lysine (PLL) oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur. Na incubatie de platen 3x met PBS wassen en laten drogen.
  2. Dissectie van embryo's en dissociatie van Npc's
    1. Na euthanatatie van een zwangere pDll1-UB-Luc transgene muis (embryonale dag 12,5 (E 12.5)) door CO2 verstikking en cervicale dislocatie, snijd door de buik en haal de baarmoeder uit.
      Let op: onderzoekers moeten de verordeningen en richtlijnen van de dierenonderzoekscommissie van hun instelling volgen. Als anesthesie of pijnbestrijding drugs worden gebruikt, gebruik ze goed.
    2. Breng de baarmoeder in een 10 cm Petri schaaltje met 25 mL ijskoude PBS. Haal de embryo's uit de baarmoeder in ijskoude PBS, met behulp van een micro schaar en een fijne Tang.
    3. Knip het hoofd van elk embryo af met een schaar en breng het over naar 10 cm Petri schaaltjes met ijskoude DMEM/F12. Verwijder de epidermis en het kraakbeen rond de hersenen en breng de hersenen over naar 35 mm Petri schaaltje met ijskoude 3 mL N2/B27-media.
    4. Afgesneden van de linker en rechter telencephalon van diencephalon (Figuur 1BA-f, C, D). Verwijder de hersenvliezen die het oppervlak van telencephalon bedekken met behulp van een fijne Tang (Figuur 1bi). Met behulp van Fine Tang weer, neem het dorso-laterale deel van de cortex uit de telencephalon (Figuur 1BG, h, j-l E).
    5. Breng de weefsels over in nieuwe 1,5 mL tubes met behulp van een P1000 pipet en verwijder eventueel extra medium met een P200 pipet. Voeg toe 0,1 mL papaïne oplossing per hersenweefsel (een paar van de cortex). Pipetteer de monsters na 15 minuten incubatie bij 24 °C voorzichtig 10 keer met P1000 pipet. Inincuberen de monsters gedurende 15 minuten bij 24 °C.
    6. Pipetteer de monsters 10 keer zachtjes met P1000 pipet. Centrifugeer de monsters 3 min bij 400 x g en kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatant weg.
    7. Voeg 1 mL DMEM/F12-medium toe aan de pellet. Pipetteer 10 keer zachtjes met P1000 pipet. Centrifugeer de monsters 3 min bij 400 x g en RT. Gooi het supernatant weg. Herhaal dit ten minste 2 keer.
    8. Aan de pellet, Voeg 0,5 mL N2/B27 media met 1 mM luciferine en meng goed. Zaai de cellen (1 x 106 cellen) naar een met PLL gecoate glazen bodem schotel. Kweek de cellen in de CO2 -incubator voor 1 uur. Zodra de cellen zich aan het gerecht hechten, voeg 2 mL N2/B27 media toe, bevattende 1 mM luciferin.
  3. Visualisatie van plaats reporter expressie in NPC dissociatie cultuur
    1. Start het luminescentie Live-Imaging systeem voordat u het dissectie uitvoert. Voor de NPC-cultuur stelt u de temperatuur van de stage incubator in op 37 °C en stelt u de instelling van het gasmengsel 20% O2,5% co2in.
    2. Zet de Dompel olie op de objectief lens. Plaats de monster schotel op de Microscoop. Bekijk het veld handmatig en kies de beste positie en de focus van de cellen van belang. Klik op Live om de testafbeelding te verkrijgen.
    3. Voer de time-lapse-acquisitie uit met 2-dimensionale (luminescentie-en Bright-veld) overnames voor 24 h met multidimensionaal acquisitie programma. Kies multidimensionaal acquisitie programma en stel de aanschaf instelling als volgt in (stap 3.3.6).
    4. Voor het verkrijgen van luminescentie beelden gebruikt u de volgende camera-instellingen: lage overdrachtssnelheid (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 min/5 min belichtingstijd. Gebruik de volgende instellingen voor het verzamelen van heldere velden: tussenliggende overdrachtssnelheid (1 MHz), 1 x 1 binning en 100 MS belichtingstijd.

4. in utero elektroporation

Opmerking: dit wordt uitgevoerd voor de introductie van Dll1--Fluc reporter in de neurale voorlopercellen.

  1. Bereiding van gereedschappen en reagentia voor elektroporation
    1. Bereid micro capillairen voor de injectie van DNA in de ventrikel van het embryonale telencephalon. Strek een gras capillair met hitte en snijd en poets de punt ervan met de polijstmachine.
    2. Bereid een mengsel van DNA met kleurstof (bijv. Trypaan blauw). De concentratie van elk DNA is 1 μg/μL in PBS en voegt de kleurstof toe aan een uiteindelijke concentratie van 10%.
      Opmerking: gebruik het mengsel van DNA voor visualisatie van Dll1-eiwit dynamica als volgt: Dll1--Fluc (Dll1-Protein Reporter, Figuur 2e Upper) en pEF-EGFP (EF-Promoter driven EGFP-expressie vector, Figuur 2e lager), monitoring van de locatie en morfologie van getransfunteerde cellen.
    3. Bereid twee soorten anesthetica: 3,88 mg/mL van pentobarbital en 0,12% van xylazine, in steriele 1x PBS.
    4. Gebruik de steriele instrumenten en chirurgische handschoenen tijdens het bedrijf.
  2. In utero elektroporation
    1. Anesthetiseer een tijd zwangere ICR Mouse (E 12.5) door intraperitoneale toediening van anesthetica met 500 μL van 3,88 mg/mL pentobarbital en 500 μL 0,12% xylazine.
      Opmerking: onderzoekers moeten de regulering van dierproeven volgen. Als men nodig heeft om anesthesie of pijnbestrijding drugs gebruiken, gebruik ze goed.
    2. Knip het haar en Desinfecteer de huid met chirurgische scrub.
    3. Controleer of het gebrek aan teen pinch Response. Zodra de pedaal reflex niet wordt waargenomen, maakt u een 2-3 cm door de buik langs de middenlijn. Zet gauzes rond het ontleed gedeelte en Bevochtig de gauzes met warme PBS om de incisie niet op te drogen. Neem de rechter baarmoeder hoorn voorzichtig met ringvormige Tang en Tel het aantal embryo's.
    4. Injecteer voorzichtig met micro capillair 1-2 μL van het gemengde DNA in de ventrikel van de telencephalon van embryo's.
      Opmerking: wanneer de injectie succesvol is, kan men de blauwe kleur van de verf over het oppervlak van de baarmoeder zien.
    5. Bevochtig de baarmoeder en de elektrode voordat u de Spanningspulsen geeft en houd vervolgens het hoofd van een embryo zachtjes vast. Stel de positief geladen elektrode in op de zijkant van de hemisfeer, waarin het DNA is geïnjecteerd. Zorg ervoor dat de conditie van de puls van de elektroporation is 30-50 V voor 50 MS, het interval van de pulsen is 1 s (50 MS charge en 950 MS non-charge). Geef 5 pulsen aan één embryo en controleer of er bubbels worden opgewekt uit de negatief geladen elektrode.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de richting van de elektrode: DNA is opgenomen in de cellen aan de zijkant van de positieve elektrode. Verplaats de positie van de elektrode tijdens deze procedure niet.
    6. Herhaal de stappen 4.2.3-4.2.4 voor andere embryo's en keer de baarmoeder hoorn terug naar de buikholte. Voer dezelfde procedure uit voor de embryo's in de linker baarmoeder hoorn.
    7. Na het terugplaatsen van de linkerkant, hechting van de incisie door een zijde hecht (4-0) met een naald (17 mm). Voordat de incisie volledig te sluiten, zet warme PBS in de buikholte
      Opmerking: het interval tussen hechtingen is ongeveer 2 mm.
    8. Na het beëindigen van de operatie, plaats de muis op een verwarmingskussen voor na anesthesie herstel. Huis de muis afzonderlijk.
      Opmerking: onderzoekers moeten hun lokale instiutionele regulering van dierproeven volgen. Als men pijnstillers moet gebruiken, gebruik ze dan goed.

5. bereiding van segment culturen van de ontwikkelende cortex en visualisatie van plaats reporter expressie in de corticale schijfjes

  1. Bereiding van cultuur media en reagentia voor segment culturen van de cortex
    1. Bereid verrijkte media voor het kweken van corticale schijfjes met 5% foetaal runderserum en 5% paarden serum in N2/B27-media.
    2. Bubble 100% O2 gas via DMEM/F12 media voor dissectie en het maken van corticale segmenten.
      Opmerking: om zuurstof gas veilig te gebruiken, bewaar de O2 cilinder in de cilinderkast en bewaak de zuurstofconcentratie in de lucht door een zuurstofconcentratie meter.
    3. Verdun 100 mM luciferine natrium oplossing in verrijkte media tot een eindconcentratie van 1 mM.
      Opmerking: luciferin toont auto-fluorescein zelf. In het geval van Luciferase-fluorescentie Dual Imaging, met name EGFP, is de lagere concentratie van luciferine (0,5 mM) beter.
    4. Stel de multi-gas incubator in op 37 °C door 40% O2 en 5% Co2.
  2. Dissectie van embryo's en onderzoek van de uitdrukking van fluorescerende reporter
    1. Na euthanatatie van de zwangere muis waarop de verslaggevers (e 13.5) worden geïntroduceerd door in utero elektroporation (stap 4,2), snijd door de buik en haal de baarmoeder uit.
      Opmerking: onderzoekers moeten de regulering van dierproeven volgen. Als met behulp van anesthesie of pijnbestrijding drugs, gebruik ze goed.
    2. Breng de baarmoeder over naar een 10 cm Petri schaaltje met PBS. Haal de embryo's uit de baarmoeder in PBS, met behulp van een micro schaar en een fijne Tang. Knip het hoofd van elk embryo af en breng over naar een 10 cm Petri schaaltje met DMEM/F12 media met 100% O2 gas. Verwijder epidermis en kraakbeen rond de hersenen in DMEM/F12 media.
    3. Zet de hersenen op het deksel van de Petri schaal met ringvormige Tang en zet het deksel op de fluorescentie stereoscopische Microscoop fase. Controleer de regio van de cortex die fluorescerende eiwitten uitdrukt onder het excitatie lampje (Figuur 2A, B).
    4. Breng de hersenen over naar een Silicone rubber snijplank gevuld met 30 mL DMEM/F12 media borrelen met 100% O2 gas. Verwijder hersenvliezen die het oppervlak van de telencephalon bedekken met een fijne Tang.
    5. Snijd de grens tussen het mediale en laterale deel van de dorsale telencephalon en scheid in twee hersenhelften met behulp van micro chirurgisch mes of fijne Tang. Gebruik een micro chirurgisch mes, snijd de cortex zoals strepen en maak corticale schijfjes (Figuur 2C, D). Pipetteer segmenten met medium met behulp van pipetten en breng ze over naar verrijkte media in een schaal van 35 mm.
    6. Zet de plakjes op de cultuur inserts in de glazen bodem gerechten met verrijkte media. Corrigeer de richting van de segmenten met een fijne Tang. Stel het snijoppervlak van de segmenten in op het oppervlak van de kweek plaat. Verwijder de extra media met een pipet. Incureer de segmenten in multi-gas Incubator set door 40% O2 en 5% Co2 bij 37 °c gedurende 30 minuten.
    7. Voeg 300 μL verrijkte media met 1 mM luciferine toe aan de buitenkant van het kweekbakje in de glazen bodem schaal.
  3. Visualisatie van plaats reporter-expressie in segment culturen
    1. Start het luminescentie Live-Imaging systeem voordat u begint met het dissectie. Gebruik de volgende toestand van corticale segment culturen: 40% O2,5% co2 en 37 °c.
    2. Zet de Dompel olie op 40x objectief objectief. Zet de monster schotel in het stadium van de Microscoop. Verkrijg het testbeeld van fluorescentie en stel de positie en het scherpstel vlak in op het gebied van belang onder de verlichting van excitatie licht.
    3. Voer de time-lapse-acquisitie uit met 3-dimentionele acquisities (luminescentie, fluorescentie en helderveld) voor 24 uur (Figuur 2F-h). Voor het verkrijgen van luminescentie beelden gebruikt u de volgende camera-instellingen: lage overdrachtssnelheid (50 kHz), 2x2/4x4 binning, 10 min/5 min belichtingstijd. Gebruik voor het verzamelen van fluorescentie-en heldere velden de volgende instellingen: gemiddelde overdrachtssnelheid (1 MHz), 1x1-binning en 100 MS belichtingstijd.

6. beeldverwerking en-analyse

  1. Verbind elke afbeelding en maak de stapel afbeeldingen. Klik op Afbeeldingsvolgorde importeren in het menu bestand (bestand | Import | Afbeeldingsvolgorde) en kies de map waar de verkregen afbeeldingen worden opgeslagen. Zet enkele woorden in bestandsnaam naar de kolom van FIle naam bevat.
  2. Om het lawaai van kosmische straal op de Bioluminescentie beelden te verwijderen, past u de Spikenoise filter plug-in van imagej/Fiji toe. Open de stapel afbeeldingen en klik op Spikenoise filter.
  3. Apply Savitzky Golay temporele filter plug-in om duidelijke dynamiek van Reporter expressie te krijgen. Open de stapel afbeeldingen en klik op Savitzky Golay temporele filter.
  4. Om de intensiteit van de reporter expressie te meten, past u Z AXIS profile plus plug-in toe op elke afzonderlijke cel. Selecteer de cellen en stel ROIs, regio van belang in en klik op Z AXIS profile plus.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Uitdrukkingen van de genen Hes1/7 vertonen 2 uur oscillatie cyclus in verschillende cellijnen en tijdens de somitogenese. Bovendien is de periode van oscillatie zeer kort en zowel hun Mrna's en eiwitten zijn zeer onstabiel met de halfwaardetijd van rond 20 min. Als we een trage reactie reporter gebruiken, kunnen we dergelijke snelle dynamiek niet traceren en als we een stabiele reporter gebruiken, accuiteert deze geleidelijk, terwijl de genexpressie oscilleert. Zo moet de melder snel worden afgebroken om de snel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De componenten van Inkeping signalering tonen oscillerende uitdrukkingen in Synchrony tijdens somitogenese maar uit Synchrony tijdens neurogenese, wat leidt tot de moeilijkheden bij het vastleggen van de expressie dynamiek door statische analyse in het laatste geval. Real-time monitoring is dus vereist om de expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten, zoals Hes1 en dll1-te onthullen. Omdat de perioden van de expressies van Hes1 en dll1- oscillaties extreem kort zijn, zijn ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.

Dankbetuigingen

We danken Yumiko Iwamoto voor de ondersteuning van de productie van de video. We zijn ook Akihiro Isomura dankbaar voor de bespreking en ondersteuning van beeldanalyse, Hitoshi Miyachi voor technische ondersteuning voor het genereren van transgene dieren, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) en OUIN Kunitaki (Andor Japan) voor de technische ondersteuning en discussies van het bioluminescentie beeldvormings systeem. Dit werk werd gesteund door kernonderzoek voor Evolutionele wetenschap en technologie (JPMJCR12W2) (R.K.), subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden (MEXT 24116705 voor H.S. en MEXT 16H06480 voor R.K.), subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. en H.S.), en platform voor dynamische benaderingen van het woon systeem van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie, Japan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bioluminescentiebeeldvormingssysteem
Gekoelde watercirculator (chiller)JulaboModel: F12-ED
Gekoelde CCD-cameraAndor TechnologyModel: iKon-M 934
IncubatorsysteemTOKAI HITModel: INU-ONICS
Omgekeerd microscoopOlympusModel: IX81
Omgekeerd microscoopOlympusModel: IX83
LED-verlichtingsapparaatCoolLEDModel: pE1
MetaMorphMOLECULAR DEVICESModel: 40000
GasmengcontrollerTokkenModel: TK-MIGM OLO2
ObjectieflensOlympusModel: UPLFLN 40X O
Voorbereidingen voor dissectie
DissectiemicroscoopNikonModel: SMZ-2B
Fluorescentie stereoscopische microscoopLeicaModel: MZ16FA
Fijne pincetDUMONTINOX No.5
Scharen, Microscharen
Pincet
Ringvormig pincet
10-cm plastic petrischaalgreiner664160-013
35-mm plastic petrischaalgreiner627160
PBSNacalai Tesque14249-24
DMEM/F12invitrogen11039-021
Reagentia voor NPC-dissociatiecultuur
B27-supplementinvitrogen12587-010
bFGFinvitrogen13256-029Stockoplossing: 1 μg/ml in 0,1% BSA/PBS
D-luciferineNacalai Tesque01493-85Stockoplossing: 100mM in 0,9% zoutwater
DNaseWorthington Biochemical CorporationLK003172Stockoplossing: 1000U/ml in EBSS
EBSSWorthington Biochemical CorporationLK003188
Glazen bodemschaalIWAKI3910-035
N2-supplement (100x)invitrogen17502-048
N-acetyl-cysteïneSigmaA-9165-25G
PapaïneWorthington Biochemical CorporationLK003178Stockoplossing: 7U/ml in EBSS
Penicilline/StreptomycineNacalai Tesque09367-34
Poly-L-lysineSigmaP-628140 mg/ml in DW
Voorbereidingen voor in utero elektroporatie
50-ml spuitTERUMO181228T
ElektrodeNeppagene7-mm
ElektroporatorNeppageneCUY21 EDIT
Pincet
GaasjesKawamoto co.7161
Micro capillairThuis gemaakt
PBSNacalai Tesque14249-24
PentbarbitalKyoritsuseiyakuSomnopentyl
Ringvormig pincet
Scharen, Microscharen
NaaldAkiyama MEDICAL MFG. COF17-40B2
XylazinBayerSeractal
Voorbereidingen voor Slice-cultuur
10-cm plastic petrischaalgreiner664160-013
35-mm plastic petrischaalgreiner627160
CultuurinzetMilliporePICM01250
DMEM/F12invitrogen11039-021
Foetaal runderserumSigma172012-500ML
Fijne pincetDUMONTINOX No.5
Pincet
Paarden serumGibco16050-122
Microchirurgisch mesAlcon19 Gauge V-Lance
Multi-gasincubatorPanasonicMCO-5MUV-PJ
N2/B27 mediaThuis gemaaktref. NPC dissociatiecultuur
PBSNacalai Tesque14249-24
Ringvormig pincet
Scharen, Microscharen
Siliciumrubber snijplankThuis gemaakt

Referenties

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704(2014).
  31. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

neurale stamcellenin utero electroporatieluciferase reporterprote nedynamiekmonitoring van genexpressielive cell imagingcorticale plakcultuurresolutie op enkelcelniveau
Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.