Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontwerp van een biocompatibele drug-Eluting tracheale stent in muizen met Laryngotracheale stenose

6.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60483

⸱

21 januari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, University of California, San Francisco, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Johns Hopkins School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Laryngotracheale stenose is het resultaat van pathologische litteken afzetting die de tracheale luchtweg kritisch vernauwt en geen effectieve medische therapieën mist. Met behulp van een PLLA-PCL (70% poly-L-lactide en 30% polycaprolactone) stent als een lokale drug delivery systeem, potentiële therapieën gericht op het verminderen van litteken proliferatie in de luchtpijp kan worden bestudeerd.

Samenvatting

Laryngotracheale stenose (LTS) is een pathologische vernauwing van de subglottis en luchtpijp die leidt tot extrathoracale obstructie en significante kortademigheid. LTS resulteert in een slijmvlies beschadiging door een vreemd lichaam in de luchtpijp, wat leidt tot weefselbeschadiging en een lokale ontstekingsreactie die misgaat, wat leidt tot de afzetting van pathologisch littekenweefsel. De behandeling van LTS is chirurgisch vanwege het gebrek aan effectieve medische therapieën. Het doel van deze methode is om een biocompatibele stent te construeren die kan worden geminiaturiseerd om in muizen met LTS te plaatsen. We hebben aangetoond dat een plla-PCL (70% poly-L-lactide en 30% polycaprolactone) constructie een optimale biomechanische sterkte had, was biocompatibel, praktisch uitvoerbaar voor een in vivo plaatsing stent, en geschikt voor het eluering van drugs. Deze methode biedt een systeem voor het afleveren van geneesmiddelen voor het testen van verschillende immunomodulerende middelen om de ontsteking lokaal te remmen en de fibrose van de luchtwegen te verminderen. De productie van de stents duurt 28 − 30 uur en kan eenvoudig worden gereproduceerd, waardoor experimenten met grote cohorten mogelijk zijn. Hier hebben we het medicijn rapamycine binnen de stent opgenomen om de effectiviteit ervan te testen bij het verminderen van fibrose en collageen depositie. De resultaten toonden aan dat PLLA-PCL-tenten betrouwbare rapamycineafgifte vertoonden, mechanisch stabiel waren in fysiologische omstandigheden en biocompatibel waren, waardoor weinig ontstekingsreactie in de luchtpijp werd teweeggebracht. Verder vermindert de rapamycine-eluting PLLA-PCL stents de littekenvorming in de luchtpijp in vivo.

Inleiding

Laryngotracheale stenose (LTS) is een pathologisch vernauwing van de luchtpijp, meestal als gevolg van iatrogene post-intubatie letsel. De combinatie van bacteriële kolonisatie, reactie van het buitenlandse lichaam op een tracheostomie of endotracheale buis, en patiëntspecifieke factoren leiden tot een afwijkende ontstekingsreactie. Deze maladaptieve immuunrespons leidt tot de afzetting van collageen in de luchtpijp, resulterend in Luminale vernauwing van de luchtpijp en daaropvolgende stenose1,2. Aangezien de huidige behandeling voor deze ziekte primair chirurgisch is, is het ontwikkelen van een alternatief medisch gebaseerd behandelings paradigma gericht op de afwijkende inflammatoire en profibrotische trajecten die leiden tot overmatige collageen depositie. Rapamycine, die remt de mTOR signalering complex, is gebleken dat immunosuppressieve effecten evenals een robuuste antifibroblast effect. Wanneer rapamycine echter systemisch wordt toegediend, kunnen vaak voorkomende bijwerkingen (bijv. hyperlipidemie, anemie, trombocytopenie) worden uitgesproken3. Het doel van onze methodologie is het ontwikkelen van een voertuig voor lokale geneesmiddelafgifte uitvoerbaar voor gebruik op de luchtweg die deze systemische effecten zou verminderen. Onze beoordelingen zijn gericht op het onderzoeken van de lokale immuunrespons op de drug delivery construct evenals de capaciteit voor de remming van fibroblast functie en de lokale immune micro omgeving te veranderen. Ziektespecifieke uitkomsten omvatten in vivo testen die markers van fibrose evalueren.

Biologisch afbreekbare drug-eluting stents zijn gebruikt in diermodellen van de ziekte in meerdere orgel systemen, met inbegrip van de luchtweg4. Voor het beheer van de luchtweg stenose of instorting, hebben eerdere onderzoeken gebruik gemaakt van met drugs beklede siliconen en op nikkel gebaseerde stents5. Een PLLA-PCL-constructie werd gekozen voor deze specifieke methode vanwege zijn geneesmiddel elutie profiel en mechanische sterkte in fysiologische omstandigheden gedurende een periode van 3 weken, wat is aangetoond in eerdere gepubliceerde studies6. PLLA-PCL is ook een biocompatibel en biologisch afbreekbaar materiaal dat al is goedgekeurd door de FDA4. Biocompatibele stents eluering cisplatine en MMC zijn bestudeerd in grote diermodellen zoals konijnen en honden. Echter, in deze diermodellen, stents werden niet geplaatst in een diermodel van de ziekte en werden geïmplanteerd transcervically. Deze studie biedt een unieke methode voor het beoordelen van een biocompatibele drug-eluting stent geplaatst transoraal in een muismodel van luchtweg letsel en laryngotracheale stenose. Een biocompatibele stent die lokaal een immunomodulerend geneesmiddel wegspost en kan worden geminiaturiseerd voor studie in een muriaans model is waardevol voor translationeel preklinisch onderzoek. Eerdere pogingen tot stent-gebruik met andere materiaal constructies genereerden robuuste reacties van het buitenlandse lichaam en verergeren de onderliggende ontstekingdie LTS onderscheidt. Deze methodologie, naar onze kennis, is de eerste in zijn soort om de immunomodulerende en antifibrotische effecten van een stent-based geneesmiddel bezorgingssysteem in een muriene model van LTS te bestuderen. Het model van de Murine zelf biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van de effecten van een immunomodulerende drug op de luchtpijp. Genetisch gemodificeerde muizen en experimentele cohorten van gezonde en zieke muizen kunnen worden bestudeerd, wat kan leiden tot experimentele reproduceerbaarheid en het verbeteren van de kosteneffectiviteit. Bovendien bootst de levering van de stent transoraal in de luchtpijp van de muis de klinische levering van een dergelijke stent bij mensen na, wat het translationeel voordeel van deze methode verder benadrukt. Ten slotte, het relatieve gemak waarmee de PLLA-PCL stent met het medicijn kan worden geproduceerd, maakt het mogelijk om alternatieve medicamenteuze therapieën te leveren die gericht zijn op het verminderen van littekenvorming in de luchtpijp.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Johns Hopkins University (MO12M354).

1. bereiding van rapamycine in PLLA-PCL

  1. Bereid twee glazen flesjes (met doppen) van 70:30 PLLA-PCL Polymeeroplossingen (inherente viscositeit 1.3 − 1.8 DL/G; Tabel met materialen) oplossingen, met één injectieflacon met 1,0% rapamycine en de andere zonder rapamycine.
    1. Maak een 1,0% rapamycine bevattende polymeeroplossing door 6 mg rapamycine toe te voegen aan 600 mg van 70:30 PLLA-PCL in een glazen injectieflacon.
    2. Voor polymeeroplossing zonder rapamycine (controle), Voeg alleen 600 mg 70:30 PLLA-PCL toe aan de glazen injectieflacon.
  2. Voeg onder een rook afzuigkap 6 mL dichloormethaan toe aan elke glazen injectieflacon.
    Let op: dichloormethaan is een corrosief materiaal en er mogen alleen glazen pipetten worden gebruikt. Gepaste veiligheidsmaatregelen zijn onder andere persoonlijke oogbescherming en handschoenen.
  3. Voeg 120 μL glycerol toe aan elke glazen injectieflacon (voor 2% glycerol oplossing).
    Opmerking: de toevoeging van glycerol zorgt voor meer flexibiliteit en verminderde stijfheid in de stent construct.
  4. Recap de glazen flesjes en laat 70:30 PLLA-PCL met en zonder rapamycine ontbinden en homogeniseren voor 6 − 12 uur.
    Opmerking: glazen flesjes kunnen ook op een draaiend schud platform worden geplaatst voor een snellere oplossing.

2. rapamycine elutie testen

  1. Pipetteer 1 mL 70:30 PLLA-PCL-oplossing met 1% rapamycine in een glazen Petri schaaltje.
    Opmerking: dit volume van 70:30 PLLA-PCL oplossing met 1% rapamycine bevat 120 μg rapamycine en vertegenwoordigt de totale hoeveelheid rapamycine in elke constructie. Alternatieve volumes en concentraties kunnen worden gebruikt.
  2. Laat 70:30 PLLA-PCL toe met 1% rapamycine om te harden in een vlakke schijf in de glazen Petri schaal.
  3. Eenmaal gehard, plaats de schijf in 2 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) en inincuberen in een 37 °C kamer.
  4. Verzamel en vervang PBS (2 mL) elke 24 uur en gebruik verzamelde PBS voor high-performance vloeistofchromatografie (HPLC)-analyse van rapamycine-inhoud.
  5. Gebruik een autosampler en een C18 4,6 cm x 250 mm HPLC-kolom om monsters te draaien via de autosampler-injector, samen met seriële verdunningen van rapamycine om een gekalibreerde standaard curve te maken. Voer elk voorbeeld in drievand uit.
    Opmerking: seriële verdunningen van rapamycine die moeten worden getest zijn 10%, 1%, 0,1% en 0,01%.
  6. Gebruik een mobiele fase van HPLC-kwaliteit water en acetonitril met 10/90 volume/volume met een debiet van 2,0 mL/min. Stel de extinctie in tijdens HPLC voor rapamycine tot 280 nm.
    Opmerking: afbeelding 1 toont de elutie van rapamycine over een periode van 14 dagen.

3. creatie van rapamycin-eluting PLLA-PCL Murine luchtweg stents

Opmerking: Voer de stappen 3.2 − 3.9 uit met steriele materialen en steriele techniek om besmetting te voorkomen die in vivo en in vitro toepassingen zou beïnvloeden.

  1. Bereid PLLA-PCL-oplossingen die rapamycine bevatten, zoals beschreven in punt 1.
  2. Gebruik een glazen Pasteur-pipet met een rubberen ballon en breng 1 mL PLLA-PCL-oplossing met 1% rapamycine aan op de veneuze canule van een op 22 G gefluoreerde ethyleen propyleen gebaseerde angio katheter (Inhoudsopgave). Houd de angio katheter in één hand vast en gebruik de glazen pipet om de PLLA-PCL-oplossing op de angio katheter te laten vallen. Draai de angio katheter langzaam om een homogene dekking van de angiocatheter met de PLLA-PCL-oplossing te garanderen.
    Opmerking: in eerste plaats zal de PLLA-PCL-oplossing dun zijn, maar naarmate de dichloormethaan tijdens de toepassing op de angio katheter verdampt, zal de oplossing meer visceus worden om op de angio katheter te schimmel. Continu draaien van de angio katheter tijdens de toepassing is gunstig. Deze stap moet langzaam en nauwgezet worden uitgevoerd om de consistente dikte van de stent te garanderen.
  3. Prop de gevormde angio katheter met de punt van de angio katheter naar beneden gericht en de gevest op de rand van een glazen Petri schaaltje om te drogen.
  4. Laat de stents 24 uur drogen in een vacuüm afzuigkap bij kamertemperatuur (Figuur 2a).
  5. Verwijder de stent-constructie van de onderliggende angio katheter door de onderliggende katheter voorzichtig vrij te draaien en uit de gevormde stent te schuiven (Figuur 2B).
  6. Controleer de stent omtrek op eventuele defecten die tijdens het gietproces hebben kunnen ontstaan. Als er een defect in de gegoten stent aanwezig is, gooi deze dan weg.
  7. Trim elk uiteinde van de gegoten stent met een fijne rechte schaar zodat de randen axiaal zijn.
  8. Met behulp van fijne rechte schaar, knip 3 mm axiale segmenten van de cast stent voor gebruik in een muismodel van LTS (Figuur 2C).
    Opmerking: ongeveer 8 stents kunnen worden gemaakt van één gegoten angio katheter, met elke 3 mm stent met 120 μg rapamycine.
  9. Laad de 3 mm stent op een nieuwe 22 veneuze katheter voor gebruik in een muismodel van LTS (Figuur 1).

4. laryngotracheale stenose inductie bij muizen

  1. Voorafgaand aan het uitvoeren in vivo muis studies krijgen goedkeuring van het Dierenzorg-en gebruiks Comité.
  2. Anesthetiseer een 9 weken oude mannelijke C57BL/6 door het geven van een intraperitoneale injectie van ketamine (80 − 100 mg/kg) en xylazine (5 − 10 mg/kg).
    Opmerking: andere muizenstammen kunnen worden vervangen, maar het wordt aanbevolen dat het gewicht van de muizen tussen de 20 − 27 g ligt.
  3. Muizen randomiseren tot een experimentele groep (chemomechanische verwonding met een plaatsing van een 1% rapamycine bevattende PLLA-PCL stent) en twee controlegroepen: 1) chemomechanische verwonding met de plaatsing van een PLLA-PCL stent, 2) chemomechanische verwonding zonder de plaatsing van een stent.
  4. Plaats een muis op een chirurgisch platform in rugligging. Gebruik een kleine lus van draad aangebracht op de bovenkant van het platform om de cervicale wervelkolom uit te breiden door deze rond de centrale snijtanden te herhalen.
  5. Bevestig de handen en benen van de muis aan de tafel met 2 inch stukjes tape. Knijp muis paw om ervoor te zorgen dat het voldoende verdoving heeft gehad.
  6. De operatieplaats wordt dan afgebroken. De bovenliggende vacht moet worden verwijderd en de huid moet worden gereinigd (afwisselend jodium of chloorhexidine scrub met alcohol of verdunde huid ontsmettingsmiddel) driemaal. Het gebied moet worden gedrapeerd en steriele handschoenen worden gedragen. De gesteriliseerde instrumenten moeten op een steriel oppervlak worden gelegd wanneer ze niet in gebruik zijn.
  7. Maak een 1,5 cm middenlijn verticale incisie in de nek van de muis met behulp van fijne gebogen Iris schaar. Verdeel de overliggende thymus en lateraliseer de twee resulterende lobben om de luchtpijp te visualiseren. Verdeel de bovenliggende sternohyoid en sternoschildklier (riem) spieren bij de superieure bevestiging bilateraal.
    Opmerking: het hele laryngotracheale complex moet na deze volledig worden blootgesteld.
  8. Passeren een 22 G angio katheter transoraal door het strottenhoofd in de luchtpijp. Gebruik kleine tang om druk toe te passen op het voorste strottenhoofd van de muis om te helpen bij de juiste plaatsing van de angio katheter. Visualiseer de witte angio katheter door de luchtpijp om een correcte plaatsing te garanderen (niet-oesofageale).
    Opmerking: de luchtpijp van de muis is extreem dun en de witte angio katheter zal worden gevisualiseerd door de doorschijnende luchtpijp.
  9. Laat een draad borstel met bleomycine coating door de ingebracht angio katheter.
  10. Trek de angio katheter langzaam terug zodat alleen de draad borstel in de luchtpijp blijft.
  11. Breng tegen druk aan met behulp van fijne Tang op de luchtpijp om het tracheale lumen mechanisch te verstoren met de draad borstel.
  12. Plaats de angio katheter opnieuw in de luchtpijp over de draad borstel.
  13. Verwijder de draad borstel en breng Bleomycine opnieuw aan.
  14. Herhaal stap 4.8 − 4.12 een totaal van 5x. Breng bleomycine aan op het penseel tussen elke toepassing.
    Opmerking: validatie en beschrijving van dit model kan worden gevonden in Hillel et al.8.
  15. Verwijder de angio katheter uit de luchtpijp van de muis.
    Opmerking: als er geen stent moet worden geplaatst, kan de incisie worden gesloten met weefsellijm.

5. transoral PLLA-PCL stent plaatsing bij muizen

  1. Laad één 3 mm gegoten stent op een lege angio katheter van 22 G (Figuur 3A).
    NB: de stent moet 5 mm van de punt van de angio katheter rusten.
  2. Teken een dunne zwarte verticale lijn op de 3 mm gegoten stent.
    Opmerking: deze lijn zorgt voor een verbeterde visualisatie van de stent in de luchtpijp.
  3. Transorale intuberen de muis met de angio katheter die vooraf is geladen met de stent.
  4. Visualiseer de stent op de angio katheter in de luchtpijp door de transcervicale incisie (Figuur 3B).
    Let op: de luchtpijp is erg dun, waardoor de zwarte kleurstof op de stent door de luchtpijp gevisualiseerd kan worden. Gebruik dit om de juiste tracheale plaatsing te bevestigen.
  5. Houd de stent op zijn plaats door de luchtpijp door de transcervicale incisie met fijne Tang te grijpen.
  6. Verwijder de angiocatheter transoraal met behoud van grip op de stent met de fijne Tang.
    Opmerking: het is uitermate belangrijk om de stent niet te veel kracht toe te passen om het lumen niet te verpletteren wanneer de angio katheter wordt verwijderd. Er is echter voldoende kracht nodig om ervoor te zorgen dat de stent niet wordt verwijderd met de angio katheter. Een 0,8 mm sialendoscoop kan worden gebruikt om de locatie en plaatsing van de stent in de luchtpijp te visualiseren.
  7. Sluit de transcervicale incisie met weefsellijm.
  8. Laat elke muis herstellen naar zijn oorspronkelijke activiteitsniveau voordat u deze terug in de kooi plaatst.

6. histologische bereiding van monsters

  1. Anesthetiseren muizen met geïnhaleerde verdoving en offeren muizen met cervicale dislocatie per dier protocol na 7, 14, of 21 dagen.
    Opmerking: op basis van de chroniteit van het onderzoek kunnen verschillende tijdsintervallen worden gebruikt (bijvoorbeeld 28, 30 dagen, enz.).
  2. Plaats een muis op het chirurgische platform zoals beschreven in de stappen 4,4 en 4,5.
  3. Open de nekincisie op de muis met behulp van fijn gebogen Iris schaar.
  4. Stel de luchtpijp per stap 4,6 bloot.
  5. Verdeel de distale luchtpijp onder het niveau van de stent met behulp van fijn gebogen Iris schaar.
  6. Verdeel de proximale luchtpijp onder het strottenhoofd en boven de stent met behulp van fijn gebogen Iris schaar.
    Opmerking: het is belangrijk om de distale luchtpijp eerst te verdelen om te voorkomen dat de luchtpijp in de thorax terugtrekt.
  7. Scheid de verdeelde luchtpijp van de slokdarm posteriorly en verwijder de luchtpijp van de muis.
    Opmerking: stents blijft behouden binnen de muis luchtpijp.
  8. Verwijder stent uit de luchtpijp en fixeer 10% formaline voor 24 uur.
  9. Insluiten formalin-vaste muis luchtpijp specimens in paraffine met de distale einde georiënteerde bovenzijde zodat axiale sneden van de luchtpijp kunnen worden gemaakt in de volgende stap.
  10. Snijd 5 μm delen van de met paraffine ingesloten muis luchtpijp met behulp van een microtoom.
    Opmerking: monsters moeten axiaal worden gesneden vanaf de distale trachea.
  11. Verkrijg een representatieve 5 μm-sectie van elke 250 μm over de lengte van het preparaat.
  12. Voltooi H & E vlek op elke representatieve sectie.
    1. Deparaffine de glaasjes door het plaatsen van xyleen 2x per glijbaan gedurende 3 min.
    2. Plaats de glaasjes in 100% ethanol gedurende 2 min, 95% ethanol gedurende 2 min en 70% ethanol gedurende 2 minuten om te hydrateren.
    3. Was de glaasjes met stromend kraanwater gedurende 2 min.
    4. Vlekken op de dia's in hematoxyline voor 3 − 5 min.
    5. Was de glaasjes met stromend kraanwater gedurende 5 min.
    6. Plaats de glaasjes gedurende 1 minuut in 1% zure alcohol.
    7. Was de glaasjes met stromend kraanwater gedurende 1 minuut.
    8. Spoel in 0,2% ammoniak water gedurende 30 sec.
    9. Spoel de dia's in stromend kraanwater gedurende 5 min. dip in 95% ethanol 10x.
    10. Eosine vlek door het plaatsen van de dia in eosine phloxine voor 30 s.
    11. Dehydraat de glaasjes door in 95% ethanol gedurende 5 min te plaatsen, gevolgd door absolute ethanol 2x gedurende 5 min.
    12. Plaats in xyleen 2x gedurende 5 min.
    13. Monteer de dia's met een afdekmedium op basis van xylene.
  13. Meet de dikte van de lamina propria zoals beschreven in Hillel et al.8.

7. stent-biocompatibiliteit in vivo

  1. Bereid weefsel secties voor zoals beschreven in stappen 6.1 − 6.4. Verwijder stent niet uit deze tracheale gedeelten om de veranderingen in ontstekingen te visualiseren ten opzichte van de locatie van de stent binnen het lumen van de luchtpijp.
    1. Om de acute reactie van het buitenlandse lichaam op de stent te bepalen, observeren macrofaag en T Cell activiteit met behulp van CD3 en F4/80 markeringen.
      Opmerking: andere markers kunnen ook worden gebruikt om acute ontstekingsreactie op de stent te bepalen.
    2. Verkrijg 5 μm gesneden delen van de met paraffine ingesloten luchtpijp op in de handel verkrijgbare hydrofiele plus glaasjes (tabel van materialen). Plaats twee secties op elke dia.
      Opmerking: deze secties moeten afkomstig zijn uit een gebied van de luchtpijp waar de PLLA-PCL stent is geplaatst.
  2. Plaats de glaasjes in xyleen 2x gedurende 5 min.
  3. Plaats de glaasjes in 100% ethanol 2x voor 3 min per stuk.
  4. Plaats de glaasjes in 95% ethanol gedurende 1 minuut.
  5. Plaats de dia's in een histologisch kleurenrek, zodat ze worden ondergedompeld in een antigeen-ophaalbuffer (tabel met materialen) en vervolgens gedurende 20 minuten in een groente stomer met kokend water worden gehouden.
  6. Verwijder de kleurings rekken uit de stomer en gooi de antigeen-ophaal buffer weg.
  7. Vervang de buffer door 1 mL PBS.
  8. Plaats de glaasjes gedurende 1 minuut in een natte kleurbox.
  9. Gooi de PBS weg en inbroed de glaasjes met Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% FBS gedurende 30 minuten.
  10. Gooi de DMEM weg en voeg een mengsel toe van twee primaire antilichamen die in verschillende soorten worden opgewekt. Bedek de dia's met paraffine folie en inbroed 's nachts bij 4 °C in een donkere kamer.
    Opmerking: in dit protocol werden konijn anti-CD3 en rat anti-F4/80 (tabel met materialen) gebruikt.
  11. Was de glijbanen in PBS 3x gedurende 5 min.
  12. Inbroed de glaasjes met secundaire antilichamen die specifiek zijn voor de primaire antilichaam soort (tabel van de materialen), verdund in DMEM met 10% FBS voor 0,5 − 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  13. Was de glijbanen in PBS 3x voor 5 min in het donker.
  14. Monteer de dia's op dekstroken met een druppel afdekmedium met 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Bewaar de glaasjes in het donker bij 20 °C of 4 °C.
  15. Observeer de gekleurde dia's op een laser scan confocale Microscoop en foto.
  16. Kwantificeer het totale aantal cellen dat wordt gekleurd met DAPI en antilichamen van belang voor vergelijking met ongewonde luchtpijp.

8. muis luchtpijp kwantitatieve genexpressie analyse

  1. Verzamel de muis luchtpijp zoals beschreven in stap 6.1 − 6.7 en verwijder stent.
    Opmerking: geoogste muis trachea's kunnen tot 2 jaar worden bewaard in een diepvries-80 °C-vriezer.
  2. Desiccate het tracheale weefsel geoogst in stap 8,1 met behulp van fijne schaar en verder homogeniseren met behulp van een kraal molen homogenisator met 1,4 mm keramische kralen (tabel van materialen) als onderdeel van een commercieel beschikbare kolom gebaseerde RNA extraction Kit (tabel van materialen).
    Opmerking: kraal molen homogenisator instellingen = 1 40 s cyclus bij 6 m/s.
  3. Extract RNA van tracheale lysaat met behulp van een kolom gebaseerde extractie en zuivering Kit (tabel van de materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Kwantificeer RNA van elk monster met behulp van een spectrofotometer (tabel met materialen).
    Opmerking: RNA-zuiverheid wordt beoordeeld aan de hand van de verhouding van 260/230 nm met een zuiver RNA-monster 2,0.
  5. Maak aanvullend DNA van geëxtraheerd RNA met behulp van reverse transcriptase (tabel met materialen) en een Thermocycler met de volgende instellingen: 5 min bij 25 °c (priming), 46 °c gedurende 30 min (omgekeerde transcriptie) en vervolgens 95 °c gedurende 1 minuut (inactivatie van reverse transcriptase).
  6. Verdun complementaire DNA-monsters met RNase vrij water tot een concentratie van 10 − 25 ng/mL voor gebruik in kwantitatieve real-time PCR.
  7. Meng 1 μL van het complementaire DNA (10 − 25 ng/mL) met 10 μL van een PCR-Mastermix (tabel met materialen), 8 μl DDH2O en 0,5 μL van 10 μM naar voren en omgekeerd primers voor het gen van belang in een put van een 96-well PCR-plaat (tabel metmaterialen).
    Opmerking: het totale volume in elke put moet 20 μL zijn. Elke put op de 96 goed plaat mag slechts één monster en één gen van belang bevatten.
  8. Herhaal stap 8.1 – 8.7 voor alle genen die van belang zijn en voer elk monster uit voor elk gen in drievlaat.
    Opmerking: de genspecifieke voorwaartse en omgekeerde primers (tabel met materialen) voor collageen 1, collageen 3 en het referentie-gen β-actin worden vaak gebruikt om markers van fibrose te onderzoeken.
  9. Plaats de 96 well plate op de real-time kwantitatieve PCR-machine en begin met het volgende Protocol: denatureren bij 95 °C gedurende 15 sec. en anneal bij 60 °C gedurende 60 s voor 40 cycli.
  10. Normaliseer de cyclus drempelwaarde (CT) voor genproduct detectie van elk gen van belang (GOI) tot de CT-waarde voor het referentie-gen β-actin voor alle monsters om een ΔCT voor elke GOI te verkrijgen. Vergelijk vervolgens de ΔCT-waarden voor elke GOI voor behandelde en onbehandelde monsters om een ΔΔCT te genereren.
    Opmerking: de cyclus drempelwaarde is het punt op de versterkings curve wanneer een vooraf bepaalde hoeveelheid genproduct aanwezig is (ΔRn). De waarde ΔRn voor elke reactie moet worden bepaald voor elk gen dat van belang is en moet vallen op het lineaire gedeelte van de versterkings curve.
    Opmerking: ΔCT = CT (GOI) – CT (referentie-gen); ΔΔCT = ΔCT (behandeld) – ΔCT (onbehandeld).
  11. Bereken de relatieve verandering in de genexpressie tussen behandelde en onbehandelde monsters als uitdrukking van een vouw verandering door 2ΔδCTte berekenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De biologisch afbreekbare PLLA-PCL stent constructie, geladen met rapamycine die in deze studie werd gebruikt, kon rapamycine op consistente en voorspelbare wijze in fysiologische omstandigheden Elzen (Figuur 1). Figuur 2 toont de plla-PCL stent die rond een 22 G angio katheter is geplaatst voor gebruik in een muriene model van LTS. Om te bepalen of de effecten van rapamycine elutie in de luchtpijp werkzaam zijn in verzachtende fibrose, kunnen gemeten veranderin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest kritische stappen voor het succesvol construeren en gebruiken van een drug-eluting stent in vivo zijn 1) het bepalen van de optimale PLLA-PCL ratio voor de gewenste drug elutie rate, 2) het bepalen van de juiste concentratie van het geneesmiddel dat moet worden verwijderd, 3) het vormen van de stents rond de angio katheter voor in vivo gebruik, en 4) transoraal het leveren van de stent in de muizen na LTS inductie zonder fatale luchtwegobstructie veroorzaken.

Hoewel er verschillende m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Nationaal Instituut voor doofheid en andere communicatiestoornissen van de National Institutes of Health onder de awardnummers 1K23DC014082 en 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Deze studie werd ook financieel gesteund door de Triological Society en American College of Surgeons (Alexander Hillel), de American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) en een T32 NIDCD training Grant (Kevin Motz).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1. Voor stent
22-gauge angiocatheterJelco4050
DichloromethaanSigma Aldrich270997-100ML
GlycerolFisher Scientific56-81-5Ook verkrijgbaar bij andere leveranciers.
PDLGASigma Aldrich739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)Evonik Industries AG65053
RapamycineLC LaboratoriesR-5000
2. Dierchirurgie
DraadoogMill-Rose Company320101
3. Voor immunohistochemisch kleuring
Antigenen-opname bufferAbcamab93678Ook verkrijgbaar bij andere leveranciers; zure pH vereist
DAPICell Signaling8961S
DMEMThermoFisher Scientific11965-092Ook verkrijgbaar bij andere leveranciers.
FBS (foetaal bovien serum)MilliporeSigmaF4135-500ML
Geit anti-konijn-488 antilichaamLif technologya11008
Geit anti-rat-633 antilichaamLif technologya21094
Hydrofiele plus glijbaanBSB7028
PBSThermoFisher Scientific100-10023Ook verkrijgbaar bij andere leveranciers.
Konijn anti-CD3 antilichaamAbcamab5690
Rat antiF4/80 antilichaamBiolengend123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal MicroscoopZeiss
4. Voor kwantitatieve PCR
0,5 mm glazen kralenOMNI International19-645
Bead Mill HomogenizerOMNI International
Gen Specifieke Forward/Reverse PrimersGenomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrofotometerThermo Scientific
Power SYBR Green MastermixLife Technologies4367659
RNeasy mini kitQiagen80404
StepOnePlus Real Time PCR systeemLife Technologies

Referenties

  1. Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
  2. Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
  3. Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
  4. Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14(2017).
  5. Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
  6. Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
  7. Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
  8. Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
  9. Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
  10. Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
  11. Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10(2015).
  12. Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Medicijnafgevende stentPLLA-PCL-polymeerrapamycinevrijgavetransorale intubatietracheaal letselmodelbiocompatibiliteitstestenflowcytometrieanalyseimmunohistochemische kleuringmuismodel van de luchtwegen
Ontwerp van een biocompatibele drug-Eluting tracheale stent in muizen met Laryngotracheale stenose
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.