We beschrijven een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocyte in vitro cultuur systeem dat het mogelijk maakt dissectie van de rollen van de matrix en adipocytes in bij te dragen tot vetweefsel metabole fenotype.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De extracellulaire matrix (ECM) speelt een centrale rol bij het reguleren van weefselhomeostase, het betrekken van Overspraak met cellen en het reguleren van meerdere aspecten van cellulaire functie. De ECM speelt een bijzonder belangrijke rol in de vetweefsel functie bij obesitas, en veranderingen in vetweefsel ECM afzetting en samenstelling zijn geassocieerd met metabole ziekte bij muizen en mensen. Tractable in vitro-modellen die een dissectie van de rollen van de ECM mogelijk maken en cellen die bijdragen aan het wereldwijde weefsel fenotype zijn schaars. We beschrijven een roman 3D in vitro model van menselijke ECM-adipocyte cultuur die het mogelijk maakt studie van de specifieke rollen van de ECM en adipocytes in het reguleren van vetweefsel metabole fenotype. Humaan vetweefsel is decellularized te isoleren van ECM, die vervolgens wordt herbevolkt met preadipocytes die vervolgens worden gedifferentieerd binnen de ECM in volwassen adipocytes. Deze methode creëert ECM-adipocyten constructies die metabolisch actief zijn en kenmerken van de weefsels en patiënten waarvan zij afkomstig zijn, behouden. We hebben dit systeem gebruikt om ziekte-specifieke ECM-adipocyten overspraak in menselijk vetweefsel aan te tonen. Dit cultuur model biedt een hulpmiddel voor het ontleden van de rollen van de ECM en adipocytes in het bijdragen aan wereldwijd adipeus weefsel metabole fenotype en maakt studie van de rol van de ECM in het reguleren van vetweefsel homeostase.
Inleiding
De extracellulaire matrix (ECM) biedt niet alleen een mechanische steiger voor weefsels, maar houdt ook in complexe Overspraak met cellen die erin wonen, reguleren van diverse processen die nodig zijn voor weefselhomeostase, met inbegrip van celproliferatie, differentiatie, signalering en metabolisme1. Terwijl gezonde ECM een essentiële rol speelt bij het behoud van de normale weefsel functie, is disfunctionele ECM betrokken bij meerdere ziekten2.
Vetweefsel speelt een belangrijke rol in de pathogenese van metabole ziekten. Obesitas wordt geassocieerd met overmatige adipocyte hypertrofie en ce....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Vetweefsel worden verkregen van menselijke proefpersonen die electieve bariatrische chirurgie ondergaan onder goedkeuring van de institutionele beoordelings Raad.
1. voorbereiding van preadipocyten isolatie en cultuur reagens
- Bereid 2% bovien serumalbumine (BSA) in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
- Bereid type II Collagenase: 2 mg/mL in 2% BSA in 1x PBS. Bereid onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid rode bloedcel (RBC) Lysing oplossing: 1,5 M NH4Cl, 100 mm NaHCO3, 10 mm dinatriumedta in gedeïoniseerd water (di/H2O). Bewaren bij 4 °C. B....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bereiding van adipeus weefsel ECM, zaaien met preadipocytes, en in vitro differentiatie in volwassen adipocytes resulteren in duidelijke sequentiële morfologische veranderingen in weefsel die visuele beoordeling van de vooruitgang in het hele protocol mogelijk maakt (Figuur 1) . Preadipocyten die worden gebruikt om de ECM te zaaien, worden geïsoleerd met behulp van Collagenase-spijsvertering uit afzonderlijke BTW-monsters (Figuur 2
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ECM-adipocyte cultuur model biedt een waardevol hulpmiddel voor het ontleden van de individuele rollen van ECM en cellen in het dicteren van Ultimate tissue fenotype. Het ECM-isolatie protocol is vrij reproduceerbaar, maar de variabiliteit in het decellularisatie proces kan worden waargenomen. De dag 3 delipidation stap is een cruciaal punt in het protocol. Bij de voltooiing van de nachtelijke extractie, moet delipidatie van de matrix worden aangetoond door de polaire oplosmiddel oplossing geel te worden, terwijl de m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Dankbetuigingen
We danken Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa en Retha Geiss voor hulp bij studie coördinatie. SEM werd uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biomedisch onderzoek kern faciliteit. Dit project werd gesteund door NIH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans affaires Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot en haalbaarheids subsidie van het Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veteranen Administratie VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektronenmicroscopie uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biom....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Ontvlambaar, bijtend |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Ontvlambaar |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Bijtend |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Ontvlambaar, bijtend |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Ontvlambaar |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Ontvlambaar |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Bijtend |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Bijtend |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homo |
Referenties
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
