Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60486

⸱

7 november 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Pediatrics and Communicable Diseases, University of Michigan Medical School, 3Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 4Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Michigan Medical School, 5Undergraduate Research Opportunity Program, University of Michigan, 6Department of Surgery, Ann Arbor Veterans Affairs Healthcare System

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocyte in vitro cultuur systeem dat het mogelijk maakt dissectie van de rollen van de matrix en adipocytes in bij te dragen tot vetweefsel metabole fenotype.

Samenvatting

De extracellulaire matrix (ECM) speelt een centrale rol bij het reguleren van weefselhomeostase, het betrekken van Overspraak met cellen en het reguleren van meerdere aspecten van cellulaire functie. De ECM speelt een bijzonder belangrijke rol in de vetweefsel functie bij obesitas, en veranderingen in vetweefsel ECM afzetting en samenstelling zijn geassocieerd met metabole ziekte bij muizen en mensen. Tractable in vitro-modellen die een dissectie van de rollen van de ECM mogelijk maken en cellen die bijdragen aan het wereldwijde weefsel fenotype zijn schaars. We beschrijven een roman 3D in vitro model van menselijke ECM-adipocyte cultuur die het mogelijk maakt studie van de specifieke rollen van de ECM en adipocytes in het reguleren van vetweefsel metabole fenotype. Humaan vetweefsel is decellularized te isoleren van ECM, die vervolgens wordt herbevolkt met preadipocytes die vervolgens worden gedifferentieerd binnen de ECM in volwassen adipocytes. Deze methode creëert ECM-adipocyten constructies die metabolisch actief zijn en kenmerken van de weefsels en patiënten waarvan zij afkomstig zijn, behouden. We hebben dit systeem gebruikt om ziekte-specifieke ECM-adipocyten overspraak in menselijk vetweefsel aan te tonen. Dit cultuur model biedt een hulpmiddel voor het ontleden van de rollen van de ECM en adipocytes in het bijdragen aan wereldwijd adipeus weefsel metabole fenotype en maakt studie van de rol van de ECM in het reguleren van vetweefsel homeostase.

Inleiding

De extracellulaire matrix (ECM) biedt niet alleen een mechanische steiger voor weefsels, maar houdt ook in complexe Overspraak met cellen die erin wonen, reguleren van diverse processen die nodig zijn voor weefselhomeostase, met inbegrip van celproliferatie, differentiatie, signalering en metabolisme1. Terwijl gezonde ECM een essentiële rol speelt bij het behoud van de normale weefsel functie, is disfunctionele ECM betrokken bij meerdere ziekten2.

Vetweefsel speelt een belangrijke rol in de pathogenese van metabole ziekten. Obesitas wordt geassocieerd met overmatige adipocyte hypertrofie en cellulaire hypoxie, defecten in adipocyte cellulaire metabolisme, en vetweefsel endoplasmisch reticulum en oxidatieve stress en ontsteking. Terwijl slecht begrepen, deze complexe processen samenspannen te beschadigen vetweefsel nutriënten buffercapaciteit, wat leidt tot nutriënten overloop van vetweefsel, toxiciteit in meerdere weefsels, en systemische metabole ziekte3,4 ,5. De opeenvolging van gebeurtenissen en specifieke mechanismen die ten grondslag liggen aan vetweefsel falen zijn slecht begrepen, maar wijzigingen in adipeus weefsel ECM zijn betrokken. De samenstelling van de ECM is veranderd in vetweefsel in menselijke en muriene obesitas, met verhoogde afzetting van ECM-eiwitten samen met kwalitatieve biochemische en structurele verschillen in de vetweefsel-ECM geassocieerd met menselijke metabole ziekte, waaronder type 2 diabetes en hyperlipidemie6,7,8,9,10,11.

Ondanks deze observaties, de rol van adipeus weefsel ecm in bemiddelen vetweefsel dysfunctie is niet goed gedefinieerd. Dit is deels te wijten aan een gebrek aan Tractable experimentele modellen die een dissectie van de specifieke rollen van ECM en adipocytes in de regulering van Ultimate adipeus weefsel functie toestaan. ECM-adipocyten cultuur simuleert beter de in vivo omgeving van native vetweefsel in ten minste twee opzichten. Ten eerste biedt de ECM-cultuur een moleculaire omgeving die lijkt op inheems vetweefsel, inclusief inheemse collagens, Elastinen en andere matrix proteïnen die afwezig zijn in de standaard 2D-cultuur. Ten tweede is de cultuur op 2D-plastic aangetoond dat het adipocyten metabolisme verandert via mechanische effecten als gevolg van een verminderde elasticiteit van kunststof substraat12, die de ECM-cultuur elimineert.

Methoden om biologische steigers te engineeren door isolatie van ECM uit decellularized vetweefsel en andere weefsels zijn bestudeerd in de context van regeneratieve en reconstructieve geneeskunde en weefsel engineering13,14, 15,16,17,18. We hebben eerder de methodologie gepubliceerd waarin we deze methoden hebben aangepast om een in vitro 3D-model van humane ECM-adipocyten cultuur te ontwikkelen, met behulp van ECM en adipocyten stamcellen (preadipocytes) afgeleid van humane viscerale vetweefsels11. In dit artikel beschrijven we deze methoden in detail. De decellularisatie procedure voor menselijk vetweefsel is een vierdaags proces waarbij mechanische en enzymatische behandelingen worden uitgevoerd om cellen en lipide te verwijderen, waardoor een biologische steiger blijft die kenmerken van het weefsel behoudt waaruit het is afgeleid. Decellularized ECM ondersteunt adipogenic differentiatie van menselijke preadipocytes, en wanneer gereconstitueerd met adipocytes, onderhoudt microarchitectuur en biochemische en ziekte-specifieke kenmerken van intact vetweefsel en houdt zich bezig met metabole functies die kenmerkend zijn voor inheemse vetweefsel. Deze matrix kan alleen worden bestudeerd of herplaatst met cellen, het toestaan van studie van interacties en overspraak tussen de cellulaire en extra-cellulaire componenten van vetweefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Vetweefsel worden verkregen van menselijke proefpersonen die electieve bariatrische chirurgie ondergaan onder goedkeuring van de institutionele beoordelings Raad.

1. voorbereiding van preadipocyten isolatie en cultuur reagens

  1. Bereid 2% bovien serumalbumine (BSA) in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
  2. Bereid type II Collagenase: 2 mg/mL in 2% BSA in 1x PBS. Bereid onmiddellijk voor gebruik.
  3. Bereid rode bloedcel (RBC) Lysing oplossing: 1,5 M NH4Cl, 100 mm NaHCO3, 10 mm dinatriumedta in gedeïoniseerd water (di/H2O). Bewaren bij 4 °C. Bereid 1x RBC Lysing oplossing van 10x stockoplossing in DI/H2O onmiddellijk voor gebruik.
  4. Bereid groei media voor: 15% foetaal runderserum (FBS), 1% antibioticum-antimycotische oplossing (ABAM) in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium: nutriënten mengsel F-12 (DMEM/F12). Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
  5. Bereiding Preadipocyte invriezing oplossing: 10% dimethylsulfoxide, 15% FBS in DMEM/F12 media. Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
  6. Maak een differentiatie medium: 10 mg/L transferrin, 33 μM biotine, 0,5 μM humane insuline oplossing, 17 μM D-Pantotheenzuur hemicalciumzout, 100 nM dexamethason, 2 nM 3, 3 ', 5-Triiodo-L-thyronine natriumzout (T3), 1 μM ciglitizone, 540 μM 3- Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1% ABAM in DMEM/F12. Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.

2. voorbereiding van het ECM-reagens

  1. Bereiding Vries buffer oplossing: 10 mM tris-basis, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) in DI/H2O. Roer oplossing om EDTA op te lossen. Pas de pH tot 8,0 aan met HCl of NaOH. bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
  2. Bereid enzymatische oplossing #1:1% ABAM in 0,25% trypsine-EDTA. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
  3. Bereiding spoel buffer oplossing: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM na2HPO4, 1,5 mm KH2po4, 1% abam, 1% PMSF in gesteriliseerde di/H2O. roer om zouten te ontbinden. Stel de pH in op 8,0 met HCl of NaOH. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
  4. Enzymatische oplossing bereiden #2:55 mM na2HPO4, 17 mm KH2po4, 4,9 mm MgSO4∙ 7h2O, 1% abam, 1% PMSF in di/H2O. bewaren 4 °c gedurende maximaal 3 maanden. Roer om zouten te ontbinden. Voeg onmiddellijk vóór gebruik 80 U/mL lipase toe van de alvleesklier, type VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease I van boviene alvleesklier, type II-S; en 100 μg/mL ribonuclease A van boviene alvleesklier, type III-A.
  5. Bereid polaire oplosmiddelextractie oplossing: 1% ABAM, 1% PMSF in isopropanol.
    Let op: isopropanol is ontvlambaar; bewaren in een ontvlambare kast bij 25 °C en afvoeren in brandbare afvalstoffen.
  6. Bereid 70% ethanol, 1% ABAM, 1% PMSF in DI/H2O. Voeg abam en PMSF toe net vóór gebruik.
    Let op: ethanol is ontvlambaar; bewaren in een ontvlambare kast bij 25 °C en afvoeren in brandbare afvalstoffen.
  7. Opslagoplossing voorbereiden: 1% ABAM, 1% PMSF in 1x PBS. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.

3. metabool voorbereiding van de fenotyping reagens

  1. Glucose opname
    1. Bereid serum verhongering media: DMEM/F12, 1% ABAM. Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C
    2. Bereid 200 nM humane insuline oplossing direct voor gebruik in 1x PBS.
    3. Bereid 200 nM humane insuline, 0,1 mM 2-deoxy-D-glucose, 1 μCi/well deoxy-D-glucose, 2-[1, 2-3H (N)]-, in 1x PBS. Bereid onmiddellijk voor gebruik.
  2. Lipolyse
    1. Bereid isoproterenol verdund in PBS: 3 mM stockoplossing. Verdun tot een werkconcentratie van 3 μM voor assay.
  3. Olie rood-O kleuring
    1. Bereid 4% Formalin in DI/H2O. bewaren bij kamertemperatuur.
    2. Bereid olie rood-O werkoplossing. Verdunde olie rood-O-oplossing (ORO) met DI/H2o in een 3:2-verhouding (Oro: di/h2o). Bereid onmiddellijk voor gebruik. Filtreer door filtreerpapier (tabel met materialen).

4. aankoop van vetweefsel

Opmerking: visceraal vetweefsel (BTW) wordt verzameld van het grotere Omentum aan het begin van de operatie door de chirurg en getransporteerd naar het laboratorium op ijs voor onmiddellijke verwerking. Universele voorzorgsmaatregelen moeten worden gebruikt bij het hanteren van alle menselijke weefsels en bijtende reagentia, inclusief het uitvoeren van al het werk in een laminaire stroom afzuigkap, met behulp van complete laboratorium veiligheids slijtage en geen recappen van naalden.

  1. Voeg 5-10 g intacte BTW toe aan 15-25 mL Vries buffer oplossing in een conische buis van 50 mL om het weefselmonster onder te dompelen. Bewaar voorbeelden bij-80 °C tot decellularisatie, voor maximaal 1 maand.
  2. Gebruik een afzonderlijk vers VAT van de BTW voor de isolatie van preadipocyten, zoals beschreven in rubriek 5.

5. isolatie van preadipocyten

  1. Plaats 2 g intacte BTW in 20 mL Collagenase, type II, oplossing in een conische buis van 50 mL. Dan grondig gehakt door het inbrengen van een steriele schaar in de conische buis en het hakken van het weefsel in de buis. Eenmaal volledig fijngemalen tot een fijne slurry, inbroed het weefsel in de Collagenase-oplossing op een rondschudapparaat bij 130 rpm en 37 °C gedurende 60 min.
  2. Filtreer het resulterende verteren door een 100 μm nylon gaas in een nieuwe conische buis van 50 mL door het digestaat te gieten van een conische buis door een stuk gaas dat over de bovenkant van een frisse conische buis is gevouwen. Het digestaat op dit punt moet een geel-oranje vloeistof met matige viscositeit, met kleine hoeveelheden residuele strengen van onverteerd vezelige weefsel. Het gaas moet grotere stukjes onverteerd weefsel te vangen, die worden weggegooid.
  3. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 270 x g . Verwijder het supernatant en rebreng de celpellet in 2 ml 1x RBC Lysing oplossing met een pipet.
    1. Incuberen gedurende 1 minuut bij 25 °C en voeg vervolgens 10 mL 15% FBS-DMEM/F12 toe. Centrifugeer bij 270 x g gedurende 10 min.
  4. Verwijder de supernatant en rebreng de celpellet in 10 mL 15% FBS-DMEM/F12 met een pipet. Breng de celsuspensie over naar 100 mm Petri schaaltje met een pipet en inbroed bij 37 °C en 5% CO2, tot de cellen 80-100% samenvloeiing bereiken, meestal 2-6 dagen. Verander de media elke 2-3 dagen.
  5. Maak cellen los en spoel ze.
    1. Verwijder media met een pipet en breng 4 mL 0,25% trypsine-EDTA aan op aan te brengen cellen. Inincuberen bij 37 °C gedurende 10 minuten, waarbij de plaat periodiek zachtjes wordt gezwenkenom de cellen los te maken.
    2. Voeg 20 mL 15% FBS-DMEM/F12 toe en rebreng de losgekoppelde cellen in deze media met een pipet. Breng vervolgens over naar een frisse 50 mL conische buis en centrifuge 270 x g gedurende 10 min.
    3. Verwijder het supernatant en gooi het weg. Was de celpellet eenmaal in 1x PBS en breng vervolgens de celpellet in 20 mL verse 15% FBS-DMEM/F12 met een pipet. Breng de celsuspensie over in een T-150 kweek kolf.
  6. Kweekcellen bij 37 °C en 5% CO2. Splits en breid cellen elke 2-3 dagen uit terwijl ze 80-100% samenvloeiing bereiken door 7 mL 0,25% trypsine-EDTA toe te passen, uit één kolf naar 8 kolven uit te breiden.
    Let op: dit vereist meestal 3-4 passages, die een passende uitbreiding mogelijk maakt en behoudt adipogenic potentieel en patiënt-en depot-specifieke cellulaire metabole fenotypes. Doorgang preadipocytes boven 4-5 passages leidt tot verlies van adipogenic potentieel.
  7. Maak cellen in 8 kolven los met 7 mL 0,25% trypsine-EDTA per kolf, zoals hierboven beschreven, en inincuberen bij 37 °C gedurende 10 minuten.
  8. Voeg 8 mL 15% FBS-DMEM/F12 per kolf toe en hervat de losgekoppelde cellen met een pipet. Breng de gehele celsuspensie gelijkmatig verdeeld in 3 50 mL conische buizen en centrifugeer bij 270 x g gedurende 10 minuten.
  9. Respendeer de resulterende celpellets in 5 mL 15% FBS-DMEM/F12 in een conische buis van 15 mL en Tel cellen met behulp van een cel teller en Trypaan blauw.
  10. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 270 x g . Hervat vervolgens de celpellet in de oplossing van het invriezen van Preadipocyten tot een uiteindelijke celconcentratie van 1 x 106/ml en aliquot 1 ml celsuspensie per 1,5 ml cryoviale buis.
  11. Bewaarcellen in cryoflesjes gedurende 1 dagen bij-80 °C. Breng cryoflesjes over naar vloeibare stikstof voor lange termijn opslag voor 3-6 maanden.
  12. Wanneer klaar voor gebruik, ontdooit een cryovial in een waterbad van 37 °C voor 3-5 min. Respendeer de cellen in 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, en centrifugeer bij 270 x g gedurende 10 minuten.
  13. Respendeer de celpellet in 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, Pipetteer in een enkele T-150 kolf en groei vervolgens tot 80% samenvloeiing over 2-3 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
  14. Maak cellen los met 7 mL 0,25% trypsine-EDTA per kolf zoals hierboven beschreven in stap 5,6. Respenderen bij 3.000.000 cellen per mL (d.w.z. 6 x 104 cellen per 20 μL) in 15% FBS-DMEM/F12, en gebruik zoals hieronder uiteengezet (sectie 7, stap 7,4).

6. voorbereiding van vetweefsel ECM

  1. Dag 1: Vries-ontdooien en enzymatische spijsvertering #1
    1. Bevriezen-ontdooien eerder bevroren (stap 4,2) BTW-monsters opgeslagen in Vries buffer oplossing in 50 mL conische buizen van-80 °C tot 37 °C in een voorverwarmd waterbad, waarbij 20 minuten worden ingevroren met zachte periodieke handmatige opwinding. Eenmaal ontdooid, terug te brengen tot-80 °C en inbroed 20 min. herhalen bevriezen-ontdooien 3x, eindigend door het ontdooien van monsters in een 37 °C waterbad.
    2. Gebruik steriele Tang, breng de BTW-monsters over naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL enzymatische oplossing #1, zodat de BTW-monsters volledig worden ondergedompeld. Inincuberen dan 's nachts op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C).
  2. Dag 2: enzymatische spijsvertering #2
    1. Was samples 3x met 15-25 mL spoel buffer oplossing op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt). Giet de spoel buffer oplossing na elke wasbeurt af.
    2. Breng monsters over naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL enzymatische oplossing #2 en inincuberen op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 's nachts).
  3. Dag 3: Delipidation
    1. Was samples 3x met 15-25 mL spoel buffer oplossing op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt). Giet de spoel buffer oplossing na elke wasbeurt af.
    2. Breng monsters over naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL polaire oplosmiddelextractie oplossing en inincuberen op een rondschudapparaat (130 rpm, 25 °C, 's nachts). Na deze stap, een meerderheid van het lipide moet worden verwijderd, en de monsters moeten wit of doorschijnend in kleur.
      Let op: de polaire oplosmiddelextractie oplossing is ontvlambaar en dient te worden bewaard en gebruikt bij 25 °C.
  4. Dag 4: wassen en opbergen
    1. Breng monsters over naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL spoel buffer oplossing. Was samples 3x op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt).
    2. Was monsters 3x met 15-25 mL 70% ethanol op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt) en giet na elke wasbeurt de 70% ethanol oplossing af.
    3. Was één keer met opslagoplossing op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt).
    4. Gebruik steriele tang om monsters over te brengen naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL opslagoplossing. Zorg ervoor dat voldoende opslagoplossing wordt gebruikt om monsters volledig onder te dompelen. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.

7. ECM-adipocyten preparaat

  1. Breng opgeslagen ECM-fragmenten over naar afzonderlijke putjes van 24-Wells plaat met behulp van steriele Tang. Voeg zo veel ECM-fragmenten toe in zoveel putten als nodig is voor de geplande downstreamtest (bijv. glucose opname of lipolyse, zie hieronder), inclusief duplicaten of triplicaten. Wassen met 500 μL van 70% ethanol 3x op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt).
  2. Rehydraat ECM door het wassen van 3x in steriele 1x PBS op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt).
  3. Gebruik een steriele schaar, snijd en weeg ECM in 100 mg fragmenten. Gebruik steriele Tang, plaats 1 100 mg fragment in elke put van een 24-Well plaat. Incuberen bij 25 °C gedurende 15 minuten om overtollige PBS uit fragmenten te laten extruderen. Verwijder de overtollige PBS voorzichtig met een pipet.
  4. Zaai elk 100 mg ECM-fragment met 20 μL preadipocyten celsuspensie (3.000.000 cellen per mL, 6 x 104 cellen per 20 μL, in 15% FBS-DMEM/F12, vanaf stap 5,10). Pipetteer de cellen rechtstreeks in de ecu door het uiteinde van de pipet in de ecu te plaatsen en de celsuspensie zachtjes in het midden van de matrix te zetten, waarbij wordt gezorgd dat de celsuspensie niet overloopt en op de bodem van de put eindigt.
    1. Als de celsuspensie overloopt van de ecu waar de pipetpunt is geplaatst, verwijdert u de punt van die locatie en plaatst u ergens anders in de ecu. Inincuberen ecu voor 40 min bij 37 °C.
      Opmerking: voor RNA-extractie voor qrtPCR, zaai elke 500 mg ECM-fragmenten met 3 x 105 cellen in 100 μL (3.000.000 cellen per ml, d.w.z. 3 x 105 cellen per 100 μL, in 15% FBS-DMEM/F12).
  5. Vul elke put van de 24-put plaat met 500 μL groeimedia om de geseede ECM-fragmenten te bedekken. Cultuur bij 37 °C en 5% CO2 voor 72 h.
  6. Na 72 h, voorzichtig te aspireren 15% FBS-DMEM/F12, kantelen van de plaat enigszins om media te pool onder fragment, en het plaatsen van de pipetpunt net grenzend aan het ECM-fragment zonder te storen. Na het opzuigen, voeg 500 μL differentiatie media toe, veranderende media elke 2-3 dagen met behulp van een vergelijkbare techniek, voor een totale cultuur periode van 14 dagen.
    1. Controleren op differentiatie met behulp van Lichtmicroscopie: cellen zullen lipiden accumuleren, bruin-geel in kleur en meer bolvormig in vorm.
      Opmerking: geseede matrices kunnen worden gebruikt voor metabole tests (bijv. glucose opname test, lipolysisassay, ORO), histologie of immunohistochemie (IHC) of standaard weefsel beeldvorming. Voor ORO-kleuring en beeldvorming op vaste weefsels, bevriezen van ECM-adipocyten monsters in vloeibare stikstof.

8. metabole fenotyping

  1. Scanning elektronenmicroscopie
    1. Repareer monsters in 2,5% Glutaaraldehyde in de fosfaatbuffer van Sorensen bij 25 °C gedurende 12 h. postfix in 1% osmium tetroxide in de fosfaatbuffer van Sorensen bij 4 °C gedurende 1 uur.
    2. Monsters in ethanol. Was in hexamethyldisalizane en lucht-droog. Monteer dan op een Scanning elektronenmicroscopie stub met colloïdaal grafiet. Droog en sputter-Coat met goud.
    3. Leg beelden vast met een scanning elektronen microscoop.
  2. Olie rood-O kleuring
    1. Levend weefsel: olie rood-O-oplossing
      1. Zuig de media zorgvuldig op uit putten met een pipet. Spoel vervolgens monsters eenmaal met 500 μL 1x PBS per put.
      2. Fixeer monsters met 200 μL van 4% formaline in steriel gedeïoniseerd H2O bij 25 °c gedurende 15 min. aspirate formaline met een pipet, was de monsters tweemaal met 1x PBS (500 μL per wasbeurt).
      3. Voeg 200 μL 60% isopropanol monsters toe bij 25 °C gedurende 5 min. Aspirate 60% isopropanol met een pipet.
      4. Vlek monsters met olie rode-O-werkoplossing bij 25 °C gedurende 5 min. Aspirate olie rood-O met een pipet en spoel vervolgens samples 3x met 1x PBS (500 μL elke Wash). Dan beeld met een optische Microscoop.
    2. Vast weefsel: olie rood-O vlek Kit
      1. Flash-Freeze ECM-adipocyten monsters in optimale snijtemperatuur (OCT) compound en sectie (5 μm) op een cryostat.
      2. Plaats de glijbaan in 85% propyleenglycol in DI/H2o gedurende 2 min. plaats de glijbaan in Oro stain bij 60 °c gedurende 6 min. plaats steh lide in 85% propyleenglycol in di/h2o gedurende 1 min. Spoel de glijbaan tweemaal met di/h2o.
      3. Plaats de dia in gemodificeerde Mayer's Hematoxylin van Oil Red-O-kleuringsset gedurende 1 minuut. Spoel de glijbaan tweemaal met kraanwater. Spoel de glijbaan tweemaal met DI/H2O.
      4. Monteer de dekslip met behulp van een waterige montage medium en een afbeelding op een microscoop.
    3. RNA-extractie van ECM voor qrtPCR
      Opmerking: om de RNA-opbrengst te maximaliseren, gebruikt u 500 mg ECM-fragmenten die zijn geseeerd met 3 x 105 preadipocyten in 100 μL en differentiëren zoals hierboven in 6-well-platen in 3 ml differentiatie media per put.
      1. Eenmaal gedifferentieerd, breng elk afzonderlijk ecu-adipocyte monster over in een conische buis van 50 mL op ijs met behulp van steriele Tang.
      2. Was goed leeg met 500 μL buffer-RLT. Voeg buffer RLT toe aan 50 mL conische buis met bijpassende ECM-adipocyte monster.
      3. Met behulp van steriele schaar, fijngehakt elk ECM-adipocyte monster in de 50 mL conische buis, terwijl het vasthouden van de buis op ijs, het inbrengen van de schaar in de conische buis aan het weefsel gehakt.
      4. De conische buizen volledig bevriezen en ontdooien van-80 °C tot 37 °C 3x.
      5. Centrifugeer conische buizen bij 500 x g en 4 °c gedurende 10 minuten.
      6. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gebruik voor RNA-extractie met een vezelig weefsel RNA extraction Kit (tabel van materialen).
  3. Glucose opname test
    1. Differentiëren 6 x 104 preadipocyten in 100 mg ECM-fragmenten in 0,5 ml van het differentiatie medium in 24-put platen zoals hierboven beschreven (rubriek 5).
    2. Na 14 dagen van differentiatie, verwijder de medium en Wash ECM-adipocytes eenmaal met 1x PBS. Voeg 0,5 mL/well serum Starvation medium en cultuur toe bij 37 °C en 5% CO2 voor 12 uur.
    3. Verwijder medium en spoel de cellen tweemaal met 1x PBS. Voeg 0,5 mL/goed 2% BSA toe in PBS en cultuur bij 37 °C en 5% CO2 voor 2 uur.
    4. Spoel cellen één keer met 1x PBS, Voeg 0,5 mL/goed 1x PBS toe met of zonder 200 nM insuline en inincuberen bij 37 °C gedurende 40 min.
    5. Aspirate 1x PBS, toevoegen 0,5 mL/goed 1X PBS met 0,1 mM 2-deoxy-D-glucose, 2 μCi/mL deoxy-D-glucose, 2-[1, 2-3H (N)], met of zonder 200 nm insuline, en incuberen bij 37 °c en 5% Co2 voor 40 min. gebruik standaard voorzorgsmaatregelen voor het hanteren en verwijderen van alle radioactieve reagentia en afval, zoals voorgeschreven door de lokale regelgevende statuten.
    6. Verwijder medium met een pipet en spoel cellen 3x met 1x PBS. Voeg 420 μL 1% SDS-oplossing toe in DI/H2O en lyse-cellen met krachtige Pipetteer. Incuberen 25 °C gedurende 10 min.
    7. Verzamel 5 μL van elke put voor Bradford Protein assay. Breng 400 μL resterend cellysaat over in 2 mL scintillatievloeistof in een Scintillatie flacon. Count 3H-2dg activiteit op Scintillatie teller. Analyseer gegevens als tellingen per minuut genormaliseerd naar eiwitten, mg/mL.
  4. Lipolyse assay
    1. Differentiëren 6 x 104 preadipocyten in 100 mg ECM-fragmenten in 0,5 ml menselijk differentiatie medium in 24-put platen zoals hierboven beschreven (rubriek 5).
    2. Na 14 dagen van differentiatie, verwijder medium en was de cellen tweemaal met warm 1x PBS. Voeg 0,5 mL serum verhongering (zonder insuline) toe met of zonder 3 μM isoproterenol en kweek adipocytes bij 37 °C en 5% CO2 voor 72 h.
    3. Verzamel cultuur supernatants, die kunnen worden bewaard bij-80 °C tot het klaar is voor assay. Verzamel de ECM in microcentrifuge buizen voor DNA-kwantificering voor gegevens normalisatie.
    4. Pipet keer 2 μL van elk supernatant in een 96-well microplaat. Reserve putten voor blanco's (gedistilleerd H2O) en glycerol standaardoplossing voorzien in de triglyceride Bepalingskit.
    5. Voeg aan elke put 270 μL vrij glycerol-reagens toe van de triglyceride Bepalingsset, pipet om te mengen. Incuberen plaat bij 37 °C gedurende 5 min.
    6. Meet de extinctie bij 540 nm op een microplaat spectrofotometer.
    7. Bereken de concentratie van glycerol en Normaliseer met DNA van ECM:

figure-protocol-1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bereiding van adipeus weefsel ECM, zaaien met preadipocytes, en in vitro differentiatie in volwassen adipocytes resulteren in duidelijke sequentiële morfologische veranderingen in weefsel die visuele beoordeling van de vooruitgang in het hele protocol mogelijk maakt (Figuur 1) . Preadipocyten die worden gebruikt om de ECM te zaaien, worden geïsoleerd met behulp van Collagenase-spijsvertering uit afzonderlijke BTW-monsters (Figuur 2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De ECM-adipocyte cultuur model biedt een waardevol hulpmiddel voor het ontleden van de individuele rollen van ECM en cellen in het dicteren van Ultimate tissue fenotype. Het ECM-isolatie protocol is vrij reproduceerbaar, maar de variabiliteit in het decellularisatie proces kan worden waargenomen. De dag 3 delipidation stap is een cruciaal punt in het protocol. Bij de voltooiing van de nachtelijke extractie, moet delipidatie van de matrix worden aangetoond door de polaire oplosmiddel oplossing geel te worden, terwijl de m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

We danken Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa en Retha Geiss voor hulp bij studie coördinatie. SEM werd uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biomedisch onderzoek kern faciliteit. Dit project werd gesteund door NIH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans affaires Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot en haalbaarheids subsidie van het Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veteranen Administratie VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektronenmicroscopie uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biomedisch onderzoek kern faciliteit. Figuur 4 van dit manuscript werd oorspronkelijk gepubliceerd in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1; 102 (3), 1032-1043. DOI: 10.1210/JC. 2016-2915, en is gereproduceerd met toestemming van Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Voor toestemming om dit materiaal te hergebruiken, gaat u naar http://global.oup.com/academic/rights.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% trypsin-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#25200056
1.5 mL cryovial tubeFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% Neutral Buffered FormalinVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µm nylon mesh filterCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I5879
96-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#15240062
BiotinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Buffer RLTQiagen, Hilden, GermanyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4513
DexamethasoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4902
Dimethyl SulfoxideFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP231Ontvlambaar, bijtend
Disodium EDTAFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium saltSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USACat#DSP-MD.43Ontvlambaar
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#G5882Bijtend
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#440191Ontvlambaar, bijtend
Human insulin solutionSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I9278
IsopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A415Ontvlambaar
IsoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#I5627Ontvlambaar
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compoundAgar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UKCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Osmium tetroxideSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030Bijtend
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Bijtend
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKitQiagen, Hilden, GermanyCat#74704
Scintillation FluidFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate bufferThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
T-150 culture flaskVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homo

Referenties

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4(2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165(2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D celkweekECM van vetweefselpreadipocyt differentiatieweefseldecellularisatiemetabole fenotyperingglucose opnameassaylipolytische functietestscanning elektronenmicroscopieOil Red O kleuring
Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.