Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantitatieve meting van Intrathecaal gesynthetiseerde eiwitten bij muizen

11.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60495

⸱

29 november 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine & Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

In dit artikel

Samenvatting

Verhoogde ruggenmergvloeistof eiwit niveaus kunnen ofwel het resultaat van diffusie van plasma eiwit over een veranderde bloed-hersen barrière of intrathecale synthese. Een geoptimaliseerd testprotocol wordt in dit artikel gepresenteerd dat helpt om beide gevallen te discrimineren en kwantitatieve metingen van intrathecaal gesynthetiseerde eiwitten verschaft.

Samenvatting

Cerebrospinale vloeistof (CSF), een vloeistof gevonden in de hersenen en het ruggenmerg, is van groot belang voor zowel de basis-als de klinische wetenschap. De analyse van de CSF-eiwit samenstelling levert cruciale informatie in fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek en neurologische ziekten. Een voorbehoud is dat eiwitten gemeten in CSF kunnen voortvloeien uit intrathecale synthese en transudatie uit serum, en eiwitanalyse van CSF kan alleen de som van deze twee componenten bepalen. Om onderscheid te maken tussen eiwit transudatie uit het bloed en intrathecaal geproduceerde eiwitten in diermodellen en bij mensen, de metingen van het CSF-eiwit profiel met behulp van conventionele eiwitanalyse hulpmiddelen moeten de berekening omvatten van het albumine CSF/serum quotiënt (Q-albumine), een marker van de integriteit van de bloed-hersen interface (BBI) en de eiwit index (q-eiwit/q-albumine), een schatting van intrathecale eiwitsynthese. Dit protocol illustreert de gehele procedure, van CSF en bloedinzameling tot quotiënten en indices berekeningen, voor de kwantitatieve meting van intrathecale eiwitsynthese en de beperking van BBI in muismodellen van neurologische aandoeningen.

Inleiding

Cerebrospinale vloeistof (CSF), een heldere en kleurloze vloeistof rond de hersenen en het ruggenmerg, houdt grote klinische en fundamentele wetenschappelijke betekenis. De CSF behoudt de elektrolytische omgeving van het centrale zenuwstelsel (CNS), balanceert de systemische zuur-base status, levert voedingsstoffen aan neuronale en gliale cellen, functioneert als een lymfatisch systeem voor het CZS, en vervoert hormonen, neurotransmitters, cytokines en andere neuropeptiden in het CZS1. Dus, aangezien de CSF-samenstelling de activiteit van het CZS weerspiegelt, biedt deze vloeistof een waardevolle, hoewel indirecte, toegang om de fysiologische en pathologische toestand van het CZS te karakteriseren.

CSF is gebruikt voor de diagnose van aandoeningen die invloed hebben op het CNS voor meer dan honderd jaar, en voor de meeste van deze tijd, het werd voornamelijk bestudeerd door clinici als een diagnostisch instrument. In de afgelopen jaren hebben neuro biologen echter het potentieel van CSF erkend voor het bestuderen van de pathofysiologie van het CZS. In het bijzonder zijn er verschillende eiwitanalyse hulpmiddelen met hoge doorvoer geïntroduceerd in het neurowetenschaprijk, waardoor een gedetailleerde studie van de eiwit samenstelling van het CSF mogelijk is, met de verwachting dat deze analyse kan helpen om inzicht te geven in de dynamische veranderingen die zich binnen het CZS voordoen.

Technologische ontwikkelingen in multiplex immunoassay technieken zoals luminex en simoa Technologies2,3, bieden onderzoekers vandaag de mogelijkheid om honderden eiwitten te detecteren bij zeer lage concentraties. Bovendien maken deze zelfde technologieën het gebruik van kleine monsterhoeveelheden mogelijk, waardoor studies bij kleine dieren, waaronder muizen, worden bevorderd, waarbij beperkte monstervolumes van CSF tot voor kort de gedetailleerde kenmerken van de vloeistof hebben uitgesloten.

Niettemin is een voorbehoud dat eiwitten gemeten in CSF kunnen voortvloeien uit intrathecale synthese en/of transudatie uit het serum als gevolg van een beschadigde bloed-hersen interface (BBI). Helaas, eiwitanalyse van CSF alleen kan alleen de som van deze twee componenten te bepalen. Om onderscheid te maken tussen transudaat en intrathecaal geproduceerde eiwitten, moeten de CSF-eiwit metingen met behulp van een beschikbare proteïne-Analysetool worden aangepast voor individuele variabiliteit in serumconcentraties en barrière-integriteit. Hoewel deze aanpassing vaak wordt gebruikt in de klinische praktijk, bijvoorbeeld de CSF IgG-index, die een hoge gevoeligheid heeft voor het opsporen van intrathecale IgG-synthese4,5,6, hebben tot op heden zeer weinig onderzoeken de CSF-eiwit concentraties gecorrigeerd voor de serumconcentratie en barrière-integriteit7,8.

Momenteel is de Reibergram aanpak de beste manier om de barrièrefunctie en intrathecale synthese van eiwitten te bepalen. Het is een grafische evaluatie in CSF/serum quotiënt diagrammen die, op een geïntegreerde manier, zowel de barrière (dys) functie en intrathecale eiwitsynthese analyseert, verwijzend naar een uitsluitend bloed-afgeleid eiwit9,10. De zeer overvloedige eiwit albumine wordt meestal gekozen als referentie-eiwit omdat het alleen in de lever wordt geproduceerd en omdat de grootte, ongeveer 70 kDa, intermediair is tussen kleine en grote eiwitten11. Het analyseschema werd voor het eerst gedefinieerd door Reiber en Felgenhauer in 1987 voor de belangrijkste klassen van immunoglobulinen (IGS)11, empirisch gebaseerd op de resultaten verkregen uit de analyse van duizenden menselijke monsters9. De aanpak werd vervolgens bevestigd door de toepassing van de twee Fick-wetten van diffusie in de theorie van de Moleculaire diffusie/debiet12. Een dergelijke theorie toont aan dat de diffusie van een eiwit door de barrière een hyperbolische verdeling heeft en de dynamiek van eiwitten in het CZS9,13kwantificatief kan verklaren. Over het algemeen is het voordeel van het gebruik van het Reibergram voor het aantonen van intrathecale eiwitsynthese dat het gelijktijdig de eiwitfractie identificeert die de CSF uit het serum binnenkomt, evenals de hoeveelheid eiwit die in het CSF wordt aangetroffen vanwege lokale productie.

Het huidige artikel en het bijbehorende protocol beschrijven de hele procedure, van CSF en bloedafname tot de uiteindelijke berekeningen die de GSK-eiwit niveaus corrigeren, voor de kwantitatieve meting van intrathecale eiwitsynthese in muismodellen van neurologische Aandoeningen. Deze procedure vormt een basis voor de beoordeling (1) van de pathofysiologische oorsprong van elk CSF-eiwit en (2) de stabiliteit en de functionele betekenis van de barrière-integriteit. Deze procedure en het protocol zijn niet alleen nuttig voor het beoordelen van muis CSF-voorbeelden, maar zijn ook nuttig bij het analyseren van CSF in een veelheid van diermodellen van neurologische ziekten en menselijke patiënten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle werk van dieren maakt gebruik van protocollen die zijn beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) bij Geisel school of Medicine bij Dartmouth.

1. inzameling van vloeistoffen

Opmerking: zowel serum als CSF zijn vereist. Voor overleving en obductie zijn twee protocollen voor elke vloeistof verzameling nodig.

  1. Serum en CSF-inzameling met behulp van overlevings procedures
    Opmerking: voor de collectie Survival Fluid moet de serum verzameling voorafgaan aan de CSF-collectie omdat het een minder invasieve procedure is. Het CSF moet binnen één week na de serum trekking worden verkregen.
    1. Retro-orbitale bloeden procedure voor serum collectie.
      Opmerking: deze procedure is voor overleving bloeden van muizen14. De beschreven procedure geldt voor elke leeftijd, geslacht en stam van muizen. Aangezien de IACUC-regels bepalen dat een maximaal bloed volume van 1% van het lichaamsgewicht kan worden verwijderd als een enkelvoudige bloed uittrekking, wordt aanbevolen de procedure alleen te laten uitvoeren op muizen die meer dan 15 g wegen.
      1. Verplaats de kooien met muizen van het rek naar een geschikt werkgebied. Bereid de anesthesie gasmachine door het inschakelen van de zuurstof debietmeter 1 L/min.
      2. Plaats het dier in de inductie kamer en sluit het deksel strak. Zet de Isofluraan vaporizer aan tot 3,5% en bewaak het dier totdat het is teruggebogen.
      3. Verwijder het dier uit de kamer en beoordeel het niveau van de anesthesie door pedaal reflex, d.w.z. stevige voetpad knijpen. Zorg voor voldoende diepte van anesthesie voordat u de procedure: gebrek aan reactie op een stevige knijp geeft voldoende anesthesie.
      4. Restrain de verdoofd Mouse door het grijpen van de losse huid achter de oren met de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand. Bult de ogen met behulp van de wijsvinger om terug te trekken van de huid boven het oog en de duim terug te trekken van de huid onder de ogen.
      5. Plaats de punt van een Pasteur-pipet in het oogcontact onder de oogbol (Figuur 1, linkerpaneel) en zet de punt op ongeveer 45 ° naar het midden van het oogcontact (Figuur 1, rechter paneel). Draai de pipet tussen de vingers tijdens de voorwaartse passage. Breng zachte druk aan en laat vervolgens los totdat er bloed in de pipet komt.
        Opmerking: maximale hoeveelheid bloed die in één keer uit deze locatie kan worden gehaald, is ongeveer 1% van het lichaamsgewicht, bijvoorbeeld 0,2 mL van een 20 g muis.
      6. Verwijder voorzichtig het capillair om letsel aan het oog te voorkomen en plaats het verzamelde bloed in een centrifugebuis van 1,5 mL. Sluit het ooglid en breng milde druk met gaas aan om verdere bloedingen te voorkomen. Eenmaal volledig alert en mobiel (meestal 3 − 5 min), keert u de muis terug naar de vasthoud kooi.
      7. Laat gedurende 30 − 60 minuten bloed stollen bij kamertemperatuur (RT) en centrifugeer bloed gedurende 10 minuten bij 2.000 x g in een gekoelde centrifuge van 4 °c. Gebruik een schone pipet techniek en verzamel serum in een nieuwe, gelabelde 0,5 mL injectieflacon. Onmiddellijk invriezen flacon serum bij-80 °C.
    2. CSF-collectie met overlevings procedure
      Let op: deze procedure is voor een overlevings operatie, en is gebaseerd op het Protocol gepubliceerd door Liu en Duff in 200815. De muizen worden geanesthetiseerd door een ketamine (20 mg/mL), xylazine (0,5 mg/mL) en Acepromazine (0,5 mg/mL) cocktail toegediend intraperitoneaal.
      1. Verplaats de kooien met muizen van het rek naar een aangewezen operatie werkgebied. Bereid operatieruimte voor in een steriele omgeving. Zorg ervoor dat alle gebruikte instrumenten en materialen voor de operatie gesteriliseerd worden.
      2. Weeg de muis en bereken de anesthesie volume nodig (0,1 mL anesthesie cocktail voor een 20 g muis). Injecteer anesthesie intraperitoneaal16. Na een paar minuten, test de muis door het voetpad te knijpen om voldoende anesthesie te garanderen. Als er meer verdoving nodig is, Injecteer dan verder 0,01 − 0,03 mL van de verdovings cocktail.
      3. Gebruik ofwel een schaar of een scheerapparaat om een klein gedeelte van het hoofd te scheren, op het caudal einde, mediaal op de schedel, om groot genoeg werkgebied voor de CSF-collectie bloot te leggen. Plaats de muis in de liggende positie op het stereotaxsch instrument en zet het hoofd stabiel met behulp van oorstangen (Figuur 2a).
        Opmerking: de muis is zo vastgelegd dat het hoofd een hoek van bijna 135 ° vormt met het lichaam (Figuur 2a). Zodra het dier is gepositioneerd, wordt een chirurgische draperen gebruikt om een steriel veld op de chirurgische plaats te behouden. Doorzichtige lijm gordijnen hebben de voorkeur voor de CSF-collectie in muizen, omdat ze directe en meer gerichte visualisatie van het dier mogelijk maken.
      4. Veeg de operatieplaats met 30% chloorhexidine DIACETAAT. Met behulp van een steriele scalpel, maken een sagittale incisie van de huid inferieur aan de achterhoofdsknobbel om de spieren boven de Cisterna magna bloot.
      5. Door botte dissectie met Tang, scheid het subcutane weefsel en de spieren om de Cisterna magna bloot te leggen (Figuur 2b). Gebruik microretractors om de spieren uit elkaar te houden (Figuur 2b) en stel de dura mater Meningeale laag bloot aan de Cisterna magna.
      6. Was voorzichtig met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om mogelijke bloed verontreiniging te verwijderen. DEP de dura mater droog met een steriel wattenstaafje en prik het membraan dat de Cisterna magna bedekt met een 30 G naald zachtjes door. Voeg snel en voorzichtig een kleine glazen capillaire buis voor het verzamelen van CSF (figuur 2c).
        Opmerking: intracraniële druk zorgt ervoor dat CSF spontaan in het capillair stroomt (figuur 2c). Afhankelijk van de leeftijd en de grootte van de muis wordt ongeveer 5 − 12 μL CSF van elke muis verkregen.
      7. Verwijder voorzichtig de capillaire buis van het membraan. Verbind de buis met een 3 mL spuit door een polyethyleen slang (tabel van materialen) en Injecteer de verzamelde CSF in een gelabelde 0,5 ml tube (figuur 2D). Bewaar de injectieflacons in ijs.
      8. Sluit incisie met behulp van polydioxanon hechtmiddel (PDS) met wegwerp naald en met behulp van begraven hechtingen17. Reinig het gebied van een gedroogd bloed of weefsel.
      9. Injecteer muizen, subcutaan of intraperitoneaal16, met 0,05 − 0,1 mg/kg buprenorfine hydrochloride als analgetische behandeling. Injecteer ook subcutaan 1 mL steriele zoutoplossing om uitdroging te voorkomen.
      10. Plaats de muis terug in een schone en warme kooi voor herstel. Zodra de muis is mobiel en in staat om voedsel en water te bereiken, plaats de kooi terug op het rek.
      11. Centrifugeer CSF gedurende 10 minuten bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge van 4 °c. Controleer de mate van bloed verontreiniging door visuele inspectie voor de identificatie van xanthochromie en de aanwezigheid van een rode pellet in de bodem van de buis. Gooi bloed vervuilde monsters weg.
        Opmerking: de formule die wordt gebruikt voor de correctie van CSF-eiwit bedragen in met bloed besmette specimens is gebaseerd op vergelijkings parameters die het eiwitgehalte in CSF en serum bevatten, hematocriet (HCT) en rode bloedcellen (RBC) tellen in CSF en Blood18. Een dergelijke correctie strategie kan echter niet gemakkelijk worden toegepast op muizen CSF-specimens als gevolg van het geringe volume, waardoor de correctie strategie wordt beperkt tot een visuele inspectie.
      12. Gebruik een schone pipet techniek en verzamel CSF in een nieuwe tube van 0,2 mL, die de pellet met cellen achterlaat. Verdun CSF 1:3 met PBS om het volumeverlies als gevolg van aërosol te verminderen. De injectieflacon met CSF onmiddellijk bevriezen bij-80 °C.
  2. Serum en CSF-inzameling met behulp van niet-overlevings procedures
    Opmerking: voor niet-Survival Fluid Collection, CSF Collection voorafgaat aan serum collectie als de muis moet een puls hebben.
    1. CSF collectie bij obductie
      Opmerking: deze procedure is voor niet-overlevings operaties en ongeveer 10 − 20 μL CSF wordt verkregen van elke muis. Een steriel chirurgische veld wordt aanbevolen, maar is niet vereist voor een niet-overlevings operatie.
      1. Verplaats de kooien met muizen van het rek naar een comfortabele werkruimte. Volg de stappen 1.1.2.2 − 1.1.2.7 en 1.1.2.11 − 1.1.2.12 voor de CSF-collectie. Ga verder naar punt 1.2.2 voor serum verzameling.
    2. Bloedafname via intracardiale punctie (open aanpak)
      Opmerking: de verwachte bloed volumes zijn ongeveer 3% van het lichaamsgewicht, bijvoorbeeld 0,6 mL van een 20 g muis.
      1. Na de CSF-collectie zorgt u ervoor dat de muis nog steeds voldoende verdoiliseerd wordt door de voetpad te knijpen. Als er een reactie wordt waargenomen, dien dan een tweede dosis anestheticum toe. Als er geen reactie wordt waargenomen, gaat u verder.
      2. Plaats het dier op de rug en veeg de huid op de buik met 70% alcohol. Met chirurgische schaar, open de thoracische Holte en bloot het hart. Plaats een 25 G naald (bevestigd aan een 3 mL spuit) in de linker ventrikel en breng zachtjes een negatieve druk aan op de zuiger van de spuit. Trek de naald terug nadat het bloed is verzameld.
      3. Voer een secundaire methode van euthanasie zoals onthoofding of cervicale dislocatie om ervoor te zorgen dat het dier is overleden.
      4. Duw de zuiger van de spuit naar beneden en Injecteer het verzamelde bloed in een Injectieflacon van 1,5 mL. Laat bloed stollen voor 30-60 min bij RT en Centrifugeer het gedurende 10 min bij 2.000 x g in een gekoelde centrifuge van 4 °c.
      5. Gebruik een schone pipet techniek en verzamel serum in een nieuwe, gelabelde 0,5 mL injectieflacon. Onmiddellijk invriezen flacon serum bij a-80 °C vriezer.

2. eiwitanalyse

  1. Gebruik een voorkeursmethode, bijvoorbeeld luminex-technologie, voor het kwantificeren van doel proteïne (s) en albumine in gecompenseerde serum-en CSF-specimens.
    Opmerking: hier wordt een voorbeeld gegeven met magnetische luminex-technologie, maar vrijwel elke techniek die eiwit hoeveelheden meet, inclusief enzym-gebonden immunosorbens (Elisa's), kan worden toegepast op het huidige protocol. Idealiter worden CSF-en serummonsters uitgevoerd voor zowel albumine als doelwit eiwitten op hetzelfde platform. De testomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd voor cruciale stappen in het Protocol, zoals antigeen-kraal koppelings concentratie, serum-en CSF-monster verdunningen, de best passende standaard curven voor elke analyt en buffer samenstelling om niet-specifieke reactiviteit te verminderen. Als een commerciële Kit wordt gebruikt voor de meting van de proteïne (s), bijvoorbeeld de immunoglobuline isotyping Kit (Tabel met materialen) gebruikt om gegevens te verkrijgenFiguur 3, moeten de instructies van de fabrikant worden opgevolgd.
    1. Na ontdooien en voorafgaand aan de analyse, centrifugeer CSF en serummonsters (2.000 x g gedurende 10 min) en gebruik het supernatant om verstopping van de filterplaten en/of sonde te voorkomen. Volg de testprocedure die met de kit is meegeleverd voor geschikte monster verdunningen. Anders, bepaal de juiste verdunning voor elke analyt en vloeistof. Monsters in PBS dienovereenkomstig verdunnen.
      Opmerking: als er geen specifieke richtsnoeren of instructies zijn, moeten voor elke analyt en vloeistof verdunningen worden vastgesteld vóór de studie test, door de juiste verdunnings reeksen te bepalen die nodig zijn om concentratie ramingen te verkrijgen die binnen de meest betrouwbaar bereik van een standaard curve. Het kennen van de kenmerken van het te analyseren biologisch monster, bijvoorbeeld fysiologische en pathologische concentraties in de vloeistof, maakt het mogelijk verschillende verdunningen te proberen met monsters met een laag, gemiddeld en hoog analyt gehalte. Indien het verwachte aantal concentraties in de monsters a priori bekend is, kunnen de verdunningen worden geselecteerd na berekening van het aantal malen dat het monster moet worden verdund om binnen het gekozen standaard curve bereik te zijn.
      Let op: door het berekenen van de verdunningsfactoren, vergeet niet dat CSF al is verdund 1:3.
    2. Bereid een standaard curve voor elk eiwit van belang, bijvoorbeeld albumine en IgG zoals gebruikt voor het genereren van gegevens in Figuur 3, door middel van Serial verdunnen referentiestandaard eiwitten. Tijdens de bereiding van standaard curven, grondig mengen elke hogere concentratie voor het maken van de volgende verdunning.
      Opmerking: ongeacht de gekozen methode van kwantificering is het essentieel om elke keer dat de test wordt uitgevoerd een standaard curve op te nemen om de eiwit (s) concentratie in monsters te schatten. De beste keuze voor een referentienorm is een gezuiverde, bekende concentratie van het eiwit van belang. Het bepalen van de specifieke verdunningen, evenals het aantal gegevenspunten en replicaties die worden gebruikt om de standaard curve te definiëren, is afhankelijk van de mate van niet-lineariteit in de standaard curve.
    3. Selecteer de juiste met antilichamen gekoppelde magnetische kraal sets (tabel met materialen). Voor individuele flacons met kralen, sonicatie elke injectieflacon voor 30 s en Vortex gedurende 1 minuut. bereid een "werk kralen mengsel" voor door verdunning van de kraal voorraden tot een eindconcentratie van 50 parels van elke verzameling/μL in de test-/wasbuffer (PBS, 1% boviene serumalbumine [BSA]). Voeg 50 μL van de gemengde kralen toe aan elk goed in een vlakke bodem 96-well plate (tabel met materialen).
      Let op: de fluorescerende kralen zijn lichtgevoelig. Daarom moeten zij gedurende de gehele procedure worden beschermd tegen langdurige blootstelling aan licht.
    4. Diagram de plaatsing van achtergronden, standaarden en voorbeelden op een goed kaart werkblad.
    5. Voeg 50 μL assay/Wash buffer toe aan elke achtergrond, en 50 μL van elke standaard naar de putjes voor de standaard curve. Laad de 50 mL van elk verdund monster in de daarvoor bestemde putjes. Wikkel de plaat met folie en incuberen met agitatie (~ 800 rpm) op een plaat Shaker gedurende 30 min bij RT.
    6. Plaats de plaat op een handheld magneet (tabel met materialen) en rust de plaat op de magneet voor ~ 60 s om volledige instelling van magnetische kralen toe te staan. Verwijder goed inhoud door de plaat voorzichtig te decanteren en op de plaat te tikken op absorberende pads om restvloeistof te verwijderen.
    7. Was de plaat door deze uit de magneet te verwijderen, door 200 μL assay/Wash buffer toe te voegen, door te schudden voor ~ 30 s, en tot slot door deze aan de magneet te bevestigen. Herhaal het wassen 3x.
    8. Verdun het biotinyleerd detectie-antilichaam, d.w.z. het met biotine gelabelde antilichaam dat tegen de eiwithoudende gastheer wordt opgewekt, tot 4 μg/ml in de test-/wasbuffer. Voeg aan elke put 50 μL van het verdunde detectie-antilichaam toe. Bedek de plaat en inincuberen gedurende 30 minuten bij RT op de plaat Shaker bij ~ 800 rpm. Plaats de plaat op de magneet en herhaal de stappen 2.1.6 en 2.1.7.
    9. Verdund phycoerythrin (PE)-geconjugeerde streptavidine (SAPE) tot 4 μg/mL in de assay/Wash-buffer. Voeg aan elk goed 50 μL verdunde SAPE toe. Bedek de plaat en inincuberen gedurende 30 minuten bij RT op de plaat Shaker bij ~ 800 rpm. Plaats de plaat op de magneet en herhaal de stappen 2.1.6 en 2.1.7.
    10. Verwijder de plaat van de magneet en breng de parels in 100 μL van de test-/wasbuffer. Lees putten met een dubbel laser stroom-gebaseerd detectie-instrument waarmee de grootte van de intensiteit van de PE fluorescentie (FI) kan worden opgespoord.
      Opmerking: het signaal, bijvoorbeeld, FI, is evenredig met de hoeveelheid doel antigeen die aan het oppervlak van de kralen is bevestigd.
    11. Exporteer onbewerkte gegevens en creëer standaard curven door grafisch detectiesignaal FI versus standaard eiwit concentraties. Gebruik de standaard curve (s) om de concentratie van de analyt (s) in de monsters te berekenen.
      Opmerking: albumine wordt bij voorkeur uitgedrukt in g/dL, terwijl eiwitten van belang bij voorkeur worden uitgedrukt in mg/dL.

3. intrathecale index berekeningen

  1. Organiseer eiwitconcentratie waarden in een spreadsheet en analyseer de resultaten door de volgende formules toe te passen.
  2. Bereken Qalbumine:
    figure-protocol-1
    Wanneer CSF-albumine en serumalbumine concentraties albumine zijn in respectievelijk GECOMPENSEERDE serum en CSF-specimens.
  3. Bereken Q-eiwitten:
    figure-protocol-2
    Wanneer CSF-eiwit en serumproteïne concentraties van doel proteïne (s) zijn in respectievelijk GECOMPENSEERDE serum en CSF-specimens.
  4. Bereken de eiwit index:
    figure-protocol-3

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit representatieve experiment was bedoeld om de intrathecale synthese van IgG te vergelijken in twee klinisch relevante knaagdieren modellen van multiple sclerose (MS): de PLP139-151-geïnduceerde recidief experimentele auto-immune encefalomyelitis (R-EAE) en de chronische progressieve, Theiler Murine encefalomyelitis virus-geïnduceerde demyelinerende ziekte (tmev-IDD) R-EAE is een nuttig model voor het begrijpen van relapsing-reeft MS, terwijl het TMEV-IDD-model chronische progressieve MS19<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kwantitatieve methoden voor de evaluatie van verhoogde GSK-eiwit concentraties zijn nuttige hulpmiddelen bij de karakterisering van de fysiologische en pathologische toestand van het CZS. Afgezien van een betrouwbare kwantificering van het CSF-eiwitgehalte, vereist de opsporing van CSF-eiwitten echter een uitdrukking van de resultaten die discrimineert tussen in bloed en CNS afgeleide fracties in het CSF. Echter, tot nu toe, de veelgebruikte eiwit kwantificering assays niet toestaan discriminatie tussen de twee eiwit com...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de medewerkers van het centrum voor vergelijkende geneeskunde en onderzoek (CCMR) bij Dartmouth voor hun deskundige verzorging van de muizen die voor deze studies werden gebruikt. Het onderzoeksfonds Bornstein financierde dit onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL insulin syringeBD329650
1 mL syringeBD329622
25 gauge needleBD305122
3 mL syringeBD309582
30 gauge insulin needleBD305106
Absorbent padsAny suitable brand
AcepromazinePatterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic WasherBioRad171020100Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex ReaderBioRad171015001
BioPlex Pro Flat Bottom PlatesBioRad171025001
Biotinilated detection antibodyAny suitable sourceDe antistof moet gericht zijn op de soort van het eiwit van belang.
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA4503
Buprenorphine hydrochloridePAR PharmaceuticalNDC 42023-179-05
Capillary TubesSutter InstrumentB100-75-10OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glas 10 cm; getrokken over Bunsen om ID kleiner te maken.
Centrifuge tube, 0.2 mLVWR20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mLVWR87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mLVWR87003-294
Chlorhexidine diacetateNolvasanE004272
Disposable pipettes tipsAny suitable brand
Ear barsKOPF Instruments1921 or 1922
EthanolKopterV1001
FreezerVWRVWR32086A
GauzeMedlineNON25212
Heating padSunbeamXL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction ChamberVETEQUIP
IsofluranePatterson Vet Supply IncNDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed)Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled)BioRadAntibody-gekoppelde magnetische kraal
Microplate ShakerSouthwest ScientificSBT1500
MicroretractorsCarfill QualityACD-010Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel)Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead PanelEMD MilliporeMGAMMAG-300KCommercieel kit voor de kwantificering door Luminex van een panel van immunoglobuline isotypes en subklassen in muisvloeistoffen.
Mouse Albumin capture ELISA kitNovus BiologicalNBP2-60484Commercieel kit voor de kwantificering door ELISA van albumine in muisvloeistoffen.
Multichannel pipetteEppendorf3125000060
Non-Sterile swabsMediChoiceWOD1002Moeten worden geautoclaveerd voor steriliteit
OxygenAIRGASOX USPEA
Pasteur PippettesFisher13-678-20A5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 ProlenPatterson Vet8695GP-3 Reverse Cutting, 18"
PE-StreptavidinBD Biosciences554061
PipettersEppendorfResearch seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated CentrifugeBeckman CoulterALLEGRA X-12R
ScaleUlineH2716
ScalpelFeatherEF7281
ShaverHarvard Apparatus52-5204
Standard proteinsAny suitable sourceDe beste keuze voor een referentiestandaard is een gezuiverde, bekende concentratie van het eiwit van belang.
Stereotaxic instrumentKOPF InstrumentsModel 900LSStandard Accessories
Sterile 1 x PBSCorning Cellgro21-040-CV
Sterile salineBaxter0338-0048-020.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2)Fine Science Tools11271-30Dumont
Surgical ScissorsFine Science Tools14094-11Stainless 25x
Vaporizer + Flow meterModuflex Anhestesia Instruments
VortexFisher02-215-414
Warming padKent Scientific CorporationRT-JR-20
Water SonicatorCole ParmerEW-08895-01
XylazinePatterson Vet Supply Inc

Referenties

  1. Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
  2. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
  3. Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
  4. Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
  5. Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184(2015).
  6. Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
  7. DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109(2019).
  8. Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
  9. Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
  10. Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
  11. Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
  12. Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
  13. Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241(2017).
  14. Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  15. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960(2008).
  16. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771(2012).
  17. Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
  18. Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
  19. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
  20. Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
  21. Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
  22. Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
  23. Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
  24. Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
  25. Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
  26. Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520(2019).
  27. Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
  28. Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
  29. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  30. Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
  31. Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
  32. Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
  33. Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242(2012).
  34. Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Intrathecale eiwitsyntheseCSF-eiwitanalysebloed-hersenbarrièrealbumine CSF-serumquotiëntberekening eiwitindexCSF-afname bij muizenretro-orbitale bloedafnameserum via hartpunctiecentrifugatie voor serumscheidingmeting van fluorescentie-intensiteit
Kwantitatieve meting van Intrathecaal gesynthetiseerde eiwitten bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.