Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantificering van proliferative en dode cellen in Enteroïden

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60501

⸱

31 januari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genomic Resource Center, Medical College of Soochow University, Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, University of Chicago, 3Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital–Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van flow cytometrie om het aantal vermenigvuldigende en dode cellen in gekweekte muisenteroïden te kwantificeren. Deze methode is nuttig om de effecten van medicamenteuze behandeling op organoïde proliferatie en overleving te evalueren.

Samenvatting

Het darmepitheel fungeert als een barrière die voorkomt dat de inhoud van de armatuur, zoals pathogene microbiota en toxines, de rest van het lichaam binnendringt. Epitheliale barrière functie vereist de integriteit van darmepitheelcellen. Terwijl epitheelcelproliferatie een continue laag cellen onderhoudt die een barrière vormt, leidt epitheelschade tot barrièredisfunctie. Als gevolg hiervan kan de luminaalinhoud via een onbeperkt pad over de darmbarrière lopen. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met veel darmziekten, zoals inflammatoire darmziekte. Geïsoleerde muis darmcrypten kunnen worden gekweekt en onderhouden als crypt-villus-achtige structuren, die worden genoemd intestinale organoïden of "enteroïden". Enteroïden zijn ideaal om de proliferatie en celdood van darmepitheelcellen in vitro te bestuderen. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om het aantal proliferative en dode cellen in gekweekte enteroïden te kwantificeren. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en propidiumjodide worden gebruikt om woekerende en dode cellen in enteroïden te etiketteren, en het aandeel van vermenigvuldigende en dode cellen wordt vervolgens geanalyseerd door stroomcytometrie. Dit is een nuttig hulpmiddel om de effecten van medicamenteuze behandeling op darmepitheliale celproliferatie en celoverleving te testen.

Inleiding

Een fundamentele functie van darmepitheelcellen is het beschermen van de intrede van luminale inhoud zoals pathogene bacteriën en toxines1,2. Om een dergelijke functie uit te voeren, vermenigvuldigen darmstamcellen zich voortdurend en onderscheiden ze zich in een verscheidenheid van epitheelcellen, waaronder enterocyten en secretoire cellen, die een barrière vormen door het vormen van nauwe verbindingen3. De snelle vernieuwing van darmepitheelcellen vereist een strikte coördinatie van celproliferatie, celdifferentiatie en celdood4,5. Verminderde celproliferatie of overmatige celdood leidt tot epitheelschade en gecompromitteerde barrièrefunctie1,6. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met inflammatoire darmziekten7,8.

Een methode om darmcrypten te kweken is eerder ontwikkeld. Met behulp van deze techniek groeien geïsoleerde muiscrypten uit tot darmorganoïden (enteroïden), die crypte-villusachtige structuren hebben en alle darmepitheelcellijn9,10bevatten. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) is een thymidine analoog die in staat is om thymine (T) te vervangen in DNA dat replicatie ondergaat tijdens celproliferatie. De proliferative cellen kunnen snel en nauwkeurig worden gelabeld door EdU kleuring. Propidiumjodide (PI) is een analoog van ethidiumbromide die rode fluorescentie vrijgeeft bij het inbrengen in dubbelstrengs DNA. PI detecteert specifiek dode cellen, omdat het alleen door het beschadigde celmembraan gaat.

In dit protocol beschrijven we eerst hoe crypten uit de dunne darm van murine te isoleren en ze vervolgens te kweken als enteroïden in vitro. Vervolgens beschrijven we hoe de proliferative en dode cellen in enteroïden te analyseren door EdU en PI integratie en flow cytometrie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) van soochow University.

1. Intestinale isolatie en cultuur

  1. Isolatie van darmcrypten en enteroïdecultuur
    1. Euthanaser een 8 weken oude wild-type muis met CO 2-inademing. Gebruik weefseltangen en fijne irisschaar om ongeveer 8 cm ileum uit te ontleden.
    2. Spoel uit met behulp van een spuit met gavage voeding naald met ongeveer 40 mL van ijskoude Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), dan in de lengte gesneden met een schaar en open het ileum.
    3. Snijd het ileum in kleine (0,5−1,0 cm) stukken. Plaats de stukken in 5 mL steriele ijskoude DPBS in een conische buis van 15 mL en rock vervolgens 5 min op ijs.
    4. Gebruik een pipetcontroller om de DPBS aan te zuigen en te vervangen door 10 mL koude buffer 1 (2 mM EDTA in DPBS). Rock voor 30 min op ijs.
    5. Gebruik de pipetcontroller om buffer 1 aan te zuigen en te vervangen door 10 mL koude buffer 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sacharose in DPBS). Schud 2−3 min met de hand (~80 shakes/min).
    6. Neem een 20 μL druppel buffer 2 inhoud na het schudden en inspecteren onder een microscoop.
    7. Filter buffer 2-inhoud met een steriele celzeef van 70 μm en verzamel vervolgens de gefilterde buffer met een conische buis van 50 mL.
    8. Pipetteer 20 μL filtraat op de glijbaan om de crypten te tellen. Breng een voldoende volume buffer 2 van stap 1.1.7 om ervoor te zorgen dat er ~ 500 crypten / goed.
    9. Draai naar beneden bij 150 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Zodra het spinnen klaar is, zuigt voorzichtig de supernatant aan.
    10. Schorscrypten in 50 μL keldermembraanmatrix (bijvoorbeeld Matrigel) per 500 crypten, pipeter op en neer (voorzichtig zijn om bellen te vermijden), plaats dan een 50 μL druppel van keldermembraanmatrix/cryptemix in het midden van één put in een 24-putplaat. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C om keldermembraanmatrix te polymeriseren.
    11. Voeg na 30 min polymerisatie voorzichtig 600 μL minigut media toe (geavanceerde Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamine, pen/strep [100 units/mL], 10 mM Hepes, N2-supplement [1:100], B27 supplement [1:50] met epidermale groeifactor [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], en Y27632 [10 μM]) aan elke put, dan de plaat terug te geven aan de 37 °C incubator. Observeer elke dag onder een microscoop en verander de media elke 2−3 dagen.
  2. Enteroid passaging
    OPMERKING: Voor lange culturen moeten enteroïden ongeveer elke week worden gesplitst.
    1. Om de enteroïden te passeren, plaats je de weefselkweekplaat op ijs. Aanzuigen van de media en voeg 1 mL koude DPBS aan elke put. Gebruik een P1000 tip om op en neer te pipeteren totdat er geen solide kelder membraan matrix brokken blijven.
    2. Ga één keer op en neer door een insulinespuit van 1 mL (27 G) en in een conische buis van 15 mL. Draai 5 min bij 150 x g bij 4 °C.
    3. Gebruik pipet om DPBS te verwijderen. Resuspend in 50 μL van kelder membraan matrix / goed.
    4. Plaats de plaat in een 37 °C incubator gedurende 30 min om keldermembraanmatrix te laten polymeriseren. Overlay elk goed met 600 μL enr media (minigut media, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), dan terug de plaat naar de incubator.

2. Flow Cytometry Analyse van EdU-positieve cellen in Enteroïden

OPMERKING: Figuur 1 toont de workflow voor flow cytometrieanalyse van EdU-positieve cellen in enteroïden.

  1. Incubatie van enteroïden met EdU
    1. Kweek enteroïden van stap 1.2.4 gedurende 5-7 dagen. Passage enteroïden in een nieuwe 24 putplaat in een splitsingsverhouding van 1:2. Voeg 600 μL ENR medium toe aan elke put. Incubeer enteroïden gedurende 4−5 dagen in een 37 °C incubator.
    2. Stel de controlegroep (onbehandelde enteroïden) en experimentele groep (enteroïden behandeld met 5 ng/mL interleukine 22 [IL-22]). Bereid ten minste drie replica's voor elke groep.
    3. Voeg EdU toe aan het ENR-medium om EdU-medium voor te bereiden met een concentratie van 50 μM. Voeg 600 μL EdU medium toe aan elke put en broed gedurende 2 uur in een 37 °C incubator. Stel een put van enteroïden zonder EdU behandeling als een negatieve controle voor achtergrond aftrekken.
  2. Oogsten van enteroïden uit keldermembraanmatrix
    1. Gebruik een pipetcontroller om EdU medium aan te zuigen en 1x wassen met DPBS. Voeg 1 mL DPBS toe.
    2. Gebruik P1000 pipet tip en pipet op en neer totdat er geen solide kelder membraan matrix brokken blijven. Breng over op een 15 mL-buis en draai op 300 x g voor 5 min. Gooi de supernatant weg.
    3. Voeg 500 μL cel-dissociatieenzymen(Tabel van materialen)toe en broed gedurende 15 min bij 37 °C. Gebruik P200 pipet tip en pipet op en neer om enteroïden te breken in enkele cellen.
    4. Voeg 3 mL DMEM-medium toe dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat en herhaaldelijk pipett met een P1000 pipettip.
    5. Draai naar beneden op 300 x g voor 5 min en aanzuigen van de supernatant medium. De cellen opnieuw opschorten met 1 mL DPBS.
  3. Fixatie en permeabilisatie van cellen
    1. Breng de celvering over op een 1,5 mL-buis, draai op 300 x g voor 5 min en gooi de supernatant weg.
    2. Hersuspendeer cellen met 1 mL van 4% paraformaldehyde (PFA), bevestig 15 min bij kamertemperatuur (RT) en spin naar beneden bij 300 x g voor 5 min. Aanzuigen van de supernatant met een pipet tip, was 1x met DPBS, en spin naar beneden om de supernatant te verwijderen.
    3. Cellen opnieuw opschorten met 1 mL van 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof. Incubeer voor 10 min bij RT.
    4. Draai naar beneden op 300 x g voor 5 min en aanzuigen de supernatant. Was 1x met DPBS en draai naar beneden om de supernatant te verwijderen.
  4. Detectie van EDe
    1. Bereid voorraadoplossingen voor elk onderdeel vooraf: 1) werkoplossing van de Alexa Fluor azide, 2) werkoplossing van 1x EdU-reactiebuffer en 3) 10x voorraadoplossing van EdU-bufferadditief.
    2. Bereid 1x EdU buffer additief door verdunning van de 10x oplossing 1:10 in gedeïoniseerd water. Bereid deze oplossing vers voor.
    3. Bereid reactiecocktail volgens tabel 1.
      LET OP: Voeg de ingrediënten toe in de volgorde die in de tabel wordt vermeld. Gebruik de reactiecocktail binnen 15 min na bereiding.
    4. Voeg 100 μL reactiecocktails toe aan elke 1,5 mL buis. Resuspend de cellen, beschermen tegen licht, uitbroeden voor 30 min bij RT.
    5. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en zuig de reactieoplossing voorzichtig aan met pipettip.
    6. Voeg 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve penetrant toe aan elke buis om 1x te wassen bij RT. Centrifuge op 300 x g voor 5 min, aanzuigen van de supernatant met pipet tip zachtjes, en opnieuw de cellen in 1 mL van DPBS.
  5. Analyse van cellen per stroomcytometrie
    1. Filtreer de opnieuw opgehangen cellen met een zeef van 40 μm en verzamel vervolgens de gefilterde cellen met een conische buis van 15 mL. Voer FACS on-machine detectie zo snel mogelijk uit.
      OPMERKING: Als de omstandigheden beperkt zijn, moeten de met cellen bevlekte monsters in het donker bij 4 °C worden opgeslagen en binnen 3 dagen worden getest.
    2. Selecteer het juiste kanaal (volgens het type Alexa Fluor azide in de EdU kit; hier, rood kanaal) en spanning (hier, ~150-350 V) voor flow cytometrie analyse.
    3. Gating strategie
      1. Teken een FSC-A (x-as) vs. SSC-A (y-as) pseudocolor plot en verdeel de meeste cellen naar het zichtbare bereik van de stip kaart door het aanpassen van de spanning. Selecteer de celpopulatie (R1) en sluit het celpuin in de linkerbenedenhoek uit.
      2. Stel vanuit de R1-celpopulatie een FSC-A (x-as) vs. FSC-H (y-axis) pseudocolor plot, en stel de poort om enkele cellen (R2) te selecteren om celklontjes uit te sluiten.
      3. Van de R2 celpopulatie, vaststellen van de fluorescentie intensiteit (x-as) vs. celnummer (y-as) plot, en gebruik de negatieve controle om de poort in te stellen. Het gebied van het tl-signaal is een positief celgebied (R3). Vergelijk de verhouding van EdU-positieve cellen (R3) tussen de experimentele en controlegroepen.

3. Flow Cytometry Analyse van PI-positieve cellen in Enteroïden

OPMERKING: Figuur 2 toont de workflow voor flow cytometrieanalyse van PI-positieve cellen in enteroïden.

  1. Incubatie van enteroïde cellen met PI
    1. Kweek enteroïden van stap 1.2.4 gedurende 5-7 dagen. Passage enteroïden in een nieuwe 24 putplaat in een splitsingsverhouding van 1:2. Voeg 600 μL ENR medium toe aan elke put. Incubeer enteroïden gedurende 4−5 dagen in een 37 °C incubator.
    2. Stel de controlegroep (onbehandeld) en experimentele groep (IL-22 behandeld) in met ten minste drie replicaties voor elke groep.
    3. Voeg PI toe aan het ENR-medium om PI-medium voor te bereiden met een concentratie van 3 μM.
    4. Voeg 600 μL PI medium toe aan elke put en incubeer gedurende 30 min in een 37 °C incubator. Stel een put van enteroïden zonder PI behandeling als een negatieve controle voor achtergrond aftrekken.
  2. Oogst enteroïden uit de matrix van het keldermembraan na de stappen 2.2.1−2.2.5.
  3. Analyse van cellen per stroomcytometrie
    1. Filtreer de opnieuw opgehangen cellen met een zeef van 40 μm en verzamel de gefilterde cellen met een conische buis van 15 mL.
    2. Voer FACS on-machine detectie zo snel mogelijk uit.
      OPMERKING: Als de omstandigheden beperkt zijn, moeten de met cellen bevlekte monsters in het donker bij 4 °C worden opgeslagen en binnen 3 dagen worden getest.
    3. Selecteer het juiste kanaal (hier, rood kanaal) en spanning (hier, ~150–350 V) voor stroomcytometrieanalyse.
    4. Gebruik dezelfde gatingstrategie als beschreven in punt 2.5.3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kleine darmcrypten werden geïsoleerd en gekweekt als enteroïden in kelder membraan matrix. Enteroïden begonnen knoppen te vormen 2 dagen na isolatie. Op dag 6 hadden enteroïden veel knoppen met veel puin (dode cellen) in het lumen. Enteroïden waren klaar om te worden doorgegeven in dit stadium (figuur 3).

Talrijke studies hebben aangetoond dat ontstekingscytokinen essentieel zijn voor het behoud van darmepitheelhomeostase. Abnormale expressie van ontstekingscytoki...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor de cultuur van enteroïden in vitro en kwantificering van EdU- en PI-positieve cellen in de enteroïden door stroomcytometrie. Er zijn verschillende voordelen van deze strategie. Ten eerste wordt EdU-etikettering gebruikt om woekercellen in enteroïden te detecteren. In vergelijking met traditionele BrdU-test is de EdU-etiketteringsmethode sneller, gevoeliger en nauwkeuriger. EdU is zeer vergelijkbaar met thymine (T), die thymine vervangt in DNA-synthese tijdens de celd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 en 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University (KF-GN-202004). De Natural Science Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), The Livelihood and Technology Program of Suzhou City (SYS2019030), en The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu Province (KYCX19-1981) . Dit werk wordt ook ondersteund door Tang Scholar van Soochow University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 ml centrifuge tubeCorning430791
22 G gavage needleVWR20068-608
24-well plateNunc142475
40 mm sterile cell strainerBD352340
50 ml centrifuge tubeCorning430829
70 mm sterile cell strainerBD352350
Advanced DMEM/F-12GIBCO12634010
Attune NxT Acoustic Focusing CytometerInvitrogenA24863
B-27 SupplementGIBCO17504044
Buffer 12 mM EDTA in DPBS
Buffer 254,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 miceNanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)Life technologies12605-010
CentrifugeEppendorf5424
CentrifugeEppendorf5424R
CentrifugeEppendorf5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging KitLife technologiesC10639
CO2 incubatorPanasonicMCO-18AC
DPBSGIBCO14190144
D-sorbitolBBISB0491
EDTABBIEB0185
ENR mediaMinigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270-106
Fine Iris ScissorsTansoole2037454
Fluorescence microscopeOlympusFV1000
GlutaMAX SupplementGIBCO35050-061
Goat SerumLife technologies16210-064
HDMEMHycloneSH30243.01B
HEPESSigmaH4034
MatrigelCorning356231
Minigut mediaAdvanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplementR&DAR009
Nonionic surfactant (Triton X)BBITB0198-500ML
Operating Scissor (12,5 cm)Tansoole2025785
Paraformaldehyde (PFA)sigma158127-500g
Penn/StrepInvitrogen15140-148
Phase contrast microscopeNikonTS1000
Propidium iodideSigmaP4170-25MG
Recombinant EGFPeproTech315-09
Recombinant Mouse NogginPeproTech250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1R&D3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22PeproTech210-22-10
SucroseBBISB0498
Tissue ForcepsTansoole2026704
Y-27632 2HC1SelleckS1049

Referenties

  1. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
  2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
  3. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  4. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  5. Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).
  6. Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).
  7. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
  8. Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  11. Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
  12. Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Entero de kweekflowcytometrieEdU labelingpropidiumjodideintestinale epitheelcellencelproliferatieceldoodcryptisolatiebasaalmembraanmatrixIL 22 behandeling
Kwantificering van proliferative en dode cellen in Enteroïden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.