Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

6.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60511

⸱

27 november 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Immunology and Allergy, Lausanne University Hospital, 2Department of Fundamental Neuroscience, University of Lausanne, 3Department of Biochemistry, Erasmus Medical Center, 4Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratories, 5Department of Biochemistry, University of Lausanne

In dit artikel

Samenvatting

RNA haarspelden en lussen kunnen fungeren als primers voor reverse transcriptie (RT) bij afwezigheid van sequentie-specifieke primers, interfereren met de studie van overlappende antisense transcripten. We hebben een techniek ontwikkeld die in staat is om streng-specifiek RNA te identificeren, en we hebben het gebruikt om HIV-1 antisense Protein ASP te bestuderen.

Samenvatting

Bij retrovirussen is antisense transcriptie beschreven in zowel humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) als humaan T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). In HIV-1 bevindt het antisense Protein ASP-gen zich op de negatieve streng van env, in het Lees frame-2, dat de kruising gp120/gp41 beslaat. In de zin oriëntatie overlapt het 3 ' einde van het open Lees frame van ASP met gp120 hypervariable-regio's v4 en V5. De studie van ASP-RNA is gedwarslanteerd door een fenomeen dat bekend staat als RT-Self-priming, waarbij RNA-secundaire structuren de mogelijkheid hebben om RT bij afwezigheid van de specifieke primer te prime, waardoor niet-specifieke Cdna's worden gegenereerd. Het gecombineerde gebruik van hoge RNA-denaturatie met biotinyleerd reverse primers in de RT-reactie, samen met affiniteits zuivering van de cDNA op streptavidin gecoate magnetische kralen, heeft ons toegestaan om selectief te versterken ASP-RNA in CD4 + T cellen afgeleid van individuen geïnfecteerd met HIV-1. Onze methode is relatief voordelig, eenvoudig uit te voeren, zeer betrouwbaar en gemakkelijk reproduceerbaar. In dit opzicht vertegenwoordigt het een krachtig hulpmiddel voor de studie van antisense transcriptie, niet alleen in HIV-1, maar ook in andere biologische systemen.

Inleiding

Het antisense protein (ASP)-gen is een open Lees frame (ORF) dat zich bevindt op de negatieve streng van het humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) envelop (env)-gen, dat de kruising gp120/gp411beslaat. In de afgelopen dertig jaar hebben verschillende rapporten aangetoond dat het HIV ASP-gen inderdaad is getranscribeerd en vertaald2,3,4,5,6,7,8,9. Hoewel ASP antisense transcripten volledig in vitrozijn gekarakteriseerd, was tot voor kort nog informatie over de werkelijke productie van ASP-RNA bij patiënten verdwenen.

De opeenvolging van ASP is omgekeerd en complementair aan env. Dit vormt een belangrijk obstakel wanneer u transcripten voor ASP probeert te detecteren. Standaard reverse transcriptie-polymerase chain reaction (RT-PCR) methoden gebruiken genspecifieke antisense primers om complementaire Dna's (Cdna's) van de juiste polariteit te synthetiseren. Deze aanpak staat echter niet toe om de oriëntatie (zin of antisense) van de initiële RNA-template te bepalen, aangezien RNA-haarspelden of lussen in beide richtingen kunnen worden priem bij afwezigheid van primers10, een fenomeen dat bekend staat als RT Self-priming. De meeste ASP-onderzoekers gaan het probleem van RT Self-priming aan met behulp van primers gelabeld met sequenties die niet gerelateerd zijn aan HIV-111,12. Deze strategie elimineert echter niet het optreden van het fenomeen en kan leiden tot een mogelijke overname van niet-specifieke Cdna's in de PCR11.

We hebben onlangs een nieuwe strand-specifieke RT-PCR-test ontwikkeld voor de studie van antisense RNA en we hebben het gebruikt voor ASP-RNA-detectie in een cohort van zes HIV-geïnfecteerde patiënten, zoals weergegeven in tabel 1. De hieronder beschreven procedure is eerder gepubliceerd door Antonio Mancarella et al.13. In ons protocol vermijden we de productie van niet-specifieke Cdna's door een dubbele aanpak. Ten eerste elimineren we RNA-secundaire structuren door denaturerende RNA op hoge temperatuur (94 ° c), en ten tweede, we reverse transcriberen ASP RNA met behulp van een biotinyleerd ASP-specifieke primer en affiniteit-zuiveren van de resulterende cDNA. Door deze aanpak kunnen we alleen onze doel-cDNA versterken, omdat andere niet-specifieke RT-producten worden verhinderd om te worden gegenereerd (denaturatie van hoge temperaturen van RNA) of geëlimineerd vóór PCR (affiniteits zuivering).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de institutioneel beoordelings Raad van het Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).

1. infectie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) met HIV-1HXB2 stam

  1. Dag 1: PBMCs STIMULATIE
    1. Isoleer PBMCs van een gezonde donateurs Buffy vacht.
    2. Tellen en respenderen PBMCs in een concentratie van 1x106/ml in het complete Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine (R-10) bevat; met toevoeging van 50 U/ml Interleukine-2 (Il-2) en 3 μg/ml Phytohemagglutinine (PHA).
    3. Pipet op en neer en Splits de cellen in 2 6-well plates (3 mL celsuspensie/well).
    4. Incuberen gedurende 3 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
  2. Dag 3: PBMCs-infectie
    Opmerking: gebruik een van de twee platen zoals in stap 1.1.3 als negatieve controle (deze cellen niet infecteren).
    Let op: Voer de gehele procedure uit in een laboratorium voor bioveiligheid niveau III (P3).
    1. Pool PBMCs van de ene plaat in een 50 mL Falcon Tube en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 min.
    2. Gooi het supernatant weg en regeer de cellen in 2,2 mL R-10 bevattende 20 e/mL IL-2 en 2 μg/mL polybrene.
    3. Ontdooien injectieflacons met het HIV-1HXB2 virus en voeg 1,8 ml virale suspensie (0,376 ng/μL) toe aan de cellen.
    4. Inbroed de cellen voor 2 uur bij 37 °C, zachtjes zwenkende de buis elke 30 minuten.
    5. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g .
    6. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen op 1x106/ml in R-10 met Il-2 (50 U/ml).
    7. Breng de celsuspensie over naar een 24-put-plaat met een concentratie van 1 mL/goed en inbroed gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
    8. Oogst elke dag 1 goed en breng de cellen over naar 1,5 mL Tube (gelabeld met de dag van de infectie).
      Opmerking: Breng vóór het centrifugeren 150 μL celsuspensie over naar een Flowcytometrie buis voor PBMCs infectie kwaliteitscontrole (zie stap 1,3)
    9. Centrifugeer de buisjes op 400 x g gedurende 10 minuten en gooi het supernatant weg.
    10. Vries de celpellets bij-80 °C tot gebruik.
  3. PBMCs-infectie: kwaliteitscontrole
    1. Verzamel voor elke dag van besmetting 150 μL geïnfecteerde PBMCs en breng ze over in een Flowcytometrie buis.
    2. Voeg 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g .
    3. Gooi het supernatant weg en voeg 50 μL PBS met 1 μL Aqua Live/Dead Dye (voorheen verdund 1:10 met PBS) toe.
    4. Incuberen bij 4 °C gedurende 15 minuten.
    5. Voeg 1 mL PBS toe, centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
    6. Voeg 250 μL fixatie/Permeabilization oplossing toe en incuberen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    7. Voeg 1 mL 1x Perm/Wash buffer toe (10x stockoplossing met zowel FBS en saponine verdund 1:10) en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.
    8. Gooi het supernatant weg en voeg 50 μL PBS met HIV Gag p24 fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd antilichaam (verdund 1:10) toe.
    9. Inincuberen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    10. Voeg 1 mL PBS toe, centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
    11. Voeg 150 μL x CellFIX toe (10x stockoplossing met 10% formaldehyde, 3,55% methanol, 0,93% natrium-natriumazide-verdund 1:10) en analyseer cellen door Flowcytometrie.

2. stimulatie van humane CD4 + T-cellen met anti-CD3/CD28-antilichamen

  1. Isoleer CD4 + T-cellen van PBMCs van zowel HIV-1 geïnfecteerde patiënten als gezonde donoren.
  2. Bereid de humane anti-CD3/CD28 antilichaammix door het verdunen van anti-CD3 (1:100) en anti-CD28 (1:50) in PBS.
  3. Mantel een 48-Wells plaat door toevoeging van 200 μL antilichaammix per putje aan een passend aantal putjes en inincuberen bij 37 °C gedurende 2 uur.
  4. Aspireren de antilichaam oplossing en voeg 1 mL CD4 + T-cellen toe op 1x106/ml aan de anti-CD3/CD28-antilichaam-gecoate putjes.
    Opmerking: stimuleren van CD4 + T-cellen tot 5 dagen.

3. omgekeerde transcriptie

Opmerking: om patiënt-specifieke primers te verkrijgen, werd proviral DNA geïsoleerd uit CD4 + T-cellen van elke patiënt versterkt met behulp van HIV-1HXB2 pan ASP-primers. Patiënt specifieke primers werden ontworpen met behulp van de proviral sequentie intern aan de pan ASP primers. Alle primers en sondes die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in tabel 2.

  1. Isoleren van totaal RNA uit cellen
    1. Kwantiseer RNA en Elimineer DNA-besmetting door monsters te behandelen met DNase.
    2. RT-reacties uitvoeren in een volume van 50 μL. Breng 0,1-1 μg totaal RNA over in een passend aantal putjes van een 96-well PCR-plaat. Bereid het RNA-mengsel door de volgende componenten aan het RNA toe te voegen:
      5 μL biotinyleerd ASP reverse primer (20 μM)
      2,5 μL deoxynucleotide-trifosfaten (Dntp's) (10 mM)
      25 μL diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld gedistilleerd water (dH2O).
      Bereid de endogene RT-controles voor door 5 μL Nuclease vrij water toe te voegen in plaats van de biotinyleerd ASP reverse primer.
    3. Plaats de 96 goed PCR-plaat in een thermocycler en verwarm het RNA-mengsel tot 94 °C gedurende 5 minuten.
    4. Onmiddellijk afkoelen van het RNA mengsel in ijskoud water voor ten minste 1 min.
    5. Bereid het reactiemengsel door de volgende componenten toe te voegen aan een tube van 1,5 mL (Bereken het totale aantal monsters plus 1):
      10 μL 5x RT buffer
      2,5 μL 0,1 M, 1,4-dithiothreitol (DTT)
      2,5 μL RNase-uit (40 eenheden/μL)
      2,5 μL RT-enzym (200 eenheden/μL)
    6. Breng 17,5 μL van dit mengsel over in elk van de RNA-bevattende putjes. Bereid de RT-minus Controls ter vervanging van reverse transcriptase met 2,5 μL Nuclease vrij water.
    7. Meng zachtjes en inincuberen de plaat bij 55 °C gedurende 60 minuten met behulp van een Thermocycler.
    8. Inactiveren van de reacties door verwarmen bij 70 °C gedurende 15 minuten.

4. affiniteits zuivering van ASP biotinyleerd cDNA

Opmerking: Reinig de RT-minus reacties niet.

  1. Bereid 1 L 2x was-/bindings buffer met 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 2 M NaCl. Filter de oplossing.
    1. Bereid 50 mL 1x was-/bindings buffer voor met PCR-grade water.
    2. Gebruik voor elke reactie 10 μL streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen. Op basis van het aantal reacties, breng een geschikte hoeveelheid kralen over naar een tube van 1,5 mL.
    3. Was de parels door het toevoegen van een gelijk volume van 2x was/bindende buffer en Vortex voor 15 s.
    4. Plaats de buis in een magnetisch scheidings rek en incuberen gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Verwijder voorzichtig de supernatant zonder de kralen te storen en voeg hetzelfde volume wassen/binden 2x buffer als het aanvankelijke volume van kralen.
    6. Vortex voor 30 s en breng 10 μL van de kralen suspensie over naar een geschikt aantal 1,5 mL tubes.
    7. Plaats de buisjes in een magnetisch scheidings rek en inbroed gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Gooi het supernatant weg en voeg 50 μL wassen/binden 2x buffer toe.
    9. Voeg 50 μL biotinyleerd cDNA toe aan de overeenkomstige buisjes met de parels.
    10. Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur die zachtjes draait.
    11. Scheid de parels van de supernatant door een magneet scheidings rek gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    12. Was de parels door toevoeging van 200 μL 1x was-/bindings buffer. Plaats de buisjes in een magneet scheidings rek gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Herhaal dit twee keer.
    13. Rebreng de parels in 10 μL PCR-klasse water.

5. standaard PCR-

NB: het doel van de standaard PCR is de volledige ORF van het ASP-gen te versterken. De versterkings producten worden vervolgens gekloond in pCR 2.1 plasmide om standaard curves te ontwikkelen voor ASP-RNA-kwantificering door real-time PCR (zie paragraaf real time PCR).

  1. Voer standaard PCRs uit in een totaal volume van 50 μL. bereid een geschikt volume PCR Master mix voor (aantal samples plus 1). Voeg voor elk monster de volgende componenten toe aan een tube van 1,5 mL:
    1 μL van 10 μM ASP-primers (vooruit en achteruit)
    1 μL van 10 mM Dntp's
    Magnesium chloride (MgCl2) (concentratie is afhankelijk van de gebruikte primers)
    dH2O tot een eindvolume van 49 μL
    1. Meng goed, draai de inhoud snel af en breng de 49 μL/put van de PCR-Master mix over naar een 96-well PCR-plaat.
    2. Draai de buizen met de kralen die worden gebruikt voor ASP cDNA-affiniteits zuivering voor 15 sec. zorgvuldig om.
    3. Voeg 1 μL kralen toe aan de overeenkomstige putjes en voer de PCR uit met het volgende programma: 95 °C gedurende 2 min, 40 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 sec. en 68 °C voor 40 s, dan 68 °C gedurende 7 min.
    4. Scheid de PCR-producten op 1% agarose gel, snijd de banden en kloon de versterkte producten in pCR 2.1 plasmide.
    5. Volgorde en analyseer de sequenties van elke kloon.

6. real-time kwantitatieve PCR (qPCR)

Opmerking: ontwikkel patiënt-specifieke primers en probes met behulp van de aanpak beschreven in stap 3 "reverse transcriptie". Voor qPCR zijn ASP-plasmide verdunningen voor standaard curven. Plasmiden die patiëntspecifieke wisselplaten bevatten, worden ontwikkeld zoals vermeld in de notitie aan het begin van stap 5 "standaard PCR".

  1. Bereid de standaard curve met 1:10 ASP plasmide seriële verdunningen vanaf 3 x 106 kopieën/μl tot 3 kopieën/μl.
    1. Eerste ronde PCR (pre-amp). Voer reacties uit in een totaal volume van 25 μL. bereid een geschikt volume PCR Master mix voor (aantal samples plus 1). Voeg voor elk monster de volgende componenten toe aan een tube van 1,5 mL:
      0,5 μL ASP-of env primer mix (eindconcentratie 0,2 μM per stuk) (vooruit en achteruit)
      0,5 μL dNTPs mix (eindconcentratie 0,2 mM per stuk)
      MgCl2 (concentratie hangt af van de primer paren)
      dH2O tot een eindvolume van 24 μL
    2. Breng 24 μL PCR-Master mix over naar een geschikt aantal putjes van een 96-well PCR-plaat.
    3. Draai de buisjes met de parels voorzichtig om met de cDNA voor 15 sec.
    4. Voeg 1 μL kralen toe aan de bijbehorende putjes. Doe hetzelfde voor plasmide verdunningen.
    5. Voer de PCR uit met het volgende algoritme: denaturatie gedurende 2 min bij 95 °C; 30 s bij 95 °C, 30 s bij 55 °C, 40 s bij 68 °C gedurende 18 cycli; verlenging bij 68 °C gedurende 7 minuten.
    6. Verdun de eerste ronde PCRs-Reacties 1:5 met PCR-grade water.
    7. Tweede ronde qPCR. Voer reacties uit in een totaal volume van 20 μL. bereid een geschikt volume PCR Master mix voor (aantal samples plus 1). Voeg voor elk monster de volgende componenten toe aan een tube van 1,5 mL:
      1,8 μL 10 μM primers (vooruit en achteruit)
      1 μL van 5 μM sonde
      6,2 μL dH2O
    8. Breng 19 μL qPCR Master mix over in een passend aantal putjes van een 96-well qPCR-plaat en voeg 1 μL van de verdunde eerste ronde PCR-reacties toe aan de corresponderende putjes. Doe hetzelfde voor de plasmide verdunningen.
    9. Voer de qPCR uit met het volgende algoritme: denaturatie gedurende 10 min bij 95 °C; 15 s bij 95 °C, 1 minuut bij 60 °C voor 40 cycli.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hoge temperatuur RNA denaturatie gekoppeld aan affiniteit zuivering van biotinyleerd cDNA voorkomt versterking van niet-specifieke ASP-producten tijdens PCR in PBMCs geïnfecteerd in vitro en in CD4 + T-cellen geïsoleerd van patiënten. RT zelfaanzuigend is aangetoond tijdens omgekeerde transcriptie van antisense RNAS10,14,15,16,17. Om dit fenomeen te v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit rapport beschrijven we een streng-specifieke RT assay toegepast op de detectie van ASP-RNA in CD4 + T-cellen geïsoleerd van personen geïnfecteerd met HIV-1. Het optreden van niet-specifieke priming tijdens RT belemmert de detectie van RNA-transcripten met de juiste polariteit, wat leidt tot een verkeerde interpretatie van de resultaten. Eerdere groepen hebben verschillende strategieën ontwikkeld die gericht zijn op het voorkomen van primer-onafhankelijke cDNA-synthese tijdens de RT-reactie. Het taggen van de omgek...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn.

Dankbetuigingen

We danken Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick en Matthieu Perreau om altijd beschikbaar te zijn om ons werk en alle mensen in het laboratorium voor AIDS-immunopathogenese te bespreken voor hun kostbare technische hulp. We willen ook John en Aaron Weddle van VSB Associated Inc. bedanken die hebben bijgedragen aan uitstekende kunstwerken. Tot slot, veel speciale dank aan alle patiënten, zonder wie dit werk niet mogelijk zou zijn geweest. Dit werk ontving geen specifieke subsidie van een financierings instantie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing KitApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4337450
dNTP Set (100 mM)Invitrogen, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation KitStemcell Technologies19052
Fetal Bovine SerumBiowestS1010-500
Fixation/Permeabilization Solution KitBecton Dickinson554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITCBeckman Coulter6604665
Human IL-2Miltenyi Biotec130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)Sigma-Aldrich61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
Mouse Anti-Human CD28Becton Dickinson55725
Mouse Anti-Human CD3Becton Dickinson55329
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-StreptomycinBioConcept4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High FidelityInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11304011
Polybrene Infection / Transfection ReagentSigma-AldrichTR-1003-G
RNeasy Mini KitQiagen74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific11875093
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4376600
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen, Thermo Fisher Scientific18080044
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cellsInvitrogen, Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNase (2 U/µL)Invitrogen, Thermo Fisher ScientificAM2238
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4375786

Referenties

  1. Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
  2. Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
  3. Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
  4. Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74(2011).
  5. Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71(2007).
  6. Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38(2012).
  7. Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
  8. Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
  9. Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
  10. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043(2015).
  11. Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
  12. Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, Pt 4 1019-1027 (2010).
  13. Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
  14. Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
  15. Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221(2009).
  16. Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
  17. Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
  18. Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Biotinylated primersRNA denaturatieStreptavidine magnetische beadsASP RNA detectieCD4 T cellenpreventie van aspecifiek cDNAqPCR analysegelelektroforese
Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.