Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf

Samenvatting

De timing van blootstelling aan liganden kan invloed hebben op hun ontwikkelings gevolgen. Hier laten we zien hoe het beeld vrijkomen van een Drosophila bot morfogenetische eiwit (BMP) genaamd DPP uit cellen van de vleugel schijf.

Samenvatting

De transformerende groei factor-Beta (TGF-β) superfamilie is essentieel voor het vroege embryonale patroon en de ontwikkeling van volwassen structuren in multicellulaire organismen. De TGF-β superfamilie omvat TGF-β, Bone morphogenetische proteïne (BMPs), Activins, groei-en differentiatie factoren, en Nodals. Het is al lang bekend dat de hoeveelheid ligand blootgesteld aan cellen is belangrijk voor de gevolgen ervan. Er werd gedacht dat lange-afstand concentratie gradiënten embryonale patroon instellen. Onlangs is echter duidelijk geworden dat de timing van blootstelling aan deze liganden ook belangrijk is voor hun stroomafwaartse transcriptionele gevolgen. Een TGF-β superfamilie ligand kan geen ontwikkelings consequentie hebben totdat het vrijkomt uit de cel waarin het werd geproduceerd. Tot voor kort was het moeilijk om te bepalen wanneer deze liganden uit cellen werden vrijgelaten. Hier laten we zien hoe de afgifte van een Drosophila BMP met de naam Decapentaplegic (DPP) uit de cellen van de Wing primordium of Wing disc te meten. Deze methode kan worden gewijzigd voor andere systemen of de signalering van liganden.

Inleiding

Botmorfogenetische eiwitten (BMPs) zijn essentieel voor de vroege embryogenese en het patroon van volwassen structuren. Bmp's worden geproduceerd en uitgescheiden om de transcriptie te beïnvloeden van doel genen die nodig zijn voor groei en celdifferentiatie in reagerende cellen. Decapentaplegic (DPP) is een Drosophila homo van BMP4 dat belangrijk is voor de ontwikkeling van embryonale en volwassen structuren zoals de vleugel^1,2,3,4. Verschillende groepen hebben zich geconcentreerd op de rol van DPP in patronen Adult Fly Wings omdat 1) de vleugels bestaan uit twee transparante epitheelia vellen met een consistent venatie patroon dat gemakkelijk kan worden beoordeeld; 2) de vleugel schijven zijn ook redelijk plat, kunnen worden gekweekt buiten de larve, en zijn eenvoudig te beeld en kwantificeren verschillen in patroon; en 3) de vleugel patroon ontwikkeling is gevoelig voor DPP zodanig dat kleine verstoringen in het traject van invloed zijn op het vleugel nerven patroon.

DPP wordt geproduceerd in cellen die zich in de voorste/achterste grens van de vleugel schijf^5,6,7,8bevinden. DPP bindt aan een complex van type 1 en type 2 serine/Threonine kinase receptoren^9,10. Bij DPP binding, de type 2-receptor fosforyleert de type 1-receptor die vervolgens fosforyleert moeders tegen DPP (MAD), een smad 1/5/8 homolog. Gefosforyleerd SMAD rekruteert een extra co-smad (Medea), die het mogelijk maakt om naar de Nucleus te gaan waar het doel genen reguleert, wat leidt tot downstream effecten zoals proliferatie of differentiatie^4,11.

Onlangs heeft het Bates-laboratorium aangetoond dat de onjuiste afgifte van DPP binnen de vleugel schijf kan leiden tot een afname van de Mad fosforylering, vermindering van de doel-genexpressie en vleugel patronen van defecten^12,13. Verschillende ionenkanalen beïnvloeden de ontwikkeling van de Drosophila vleugel en bijbehorende structuren^14,15. Deze ionenkanalen kunnen ook worden betrokken bij de DPP-release. Bij het bepalen van het mechanisme van de morfogen release is het belangrijk dat er een methode is om vrijgave gebeurtenissen te visualiseren.

Drs. Aurelio Teleman en Stephen Cohen creëerde een DPP-GFP fusie-eiwit dat in staat is om verlies van DPP te redden, wat betekent dat het biologisch actief is en wordt vrijgegeven op een biologisch relevante manier¹⁶. Hier beschrijven we hoe we DPP release Events visualiseren met behulp van deze DPP-GFP. Dit fusie-eiwit is vooral nuttig omdat GFP pH-gevoelig is, zodat wanneer het in zure blaasjes is, de fluorescentie¹⁷wordt geblust. Daarom, wanneer een eiwit gelabeld met GFP is vrijgelaten uit een blaasje in de meer neutrale extracellulaire omgeving, GFP fluorescentie intensiteit stijgt¹⁷. We maakten gebruik van de pH-gevoeligheid van GFP om te bepalen of DPP-GFP zich in zure blaasjes bevindt. We afbeelding gemaakt vleugel schijven uitdrukken DPP-GFP voor en na de toevoeging van ammoniumchloride, die neutraliseert intracellulaire compartimenten blaasjes¹⁸. We vonden een significante toename van de fluorescentie van puncta na de toevoeging van ammoniumchloride, wat suggereert dat intracellulaire DPP-GFP wordt opge-blust vóór de toevoeging van ammoniumchloride¹⁸. We concluderen dat intracellulaire DPP-GFP zich in zure membraan-gebonden compartimenten bevindt, zoals blaasjes, en wordt ongeblust bij toevoeging van ammoniumchloride om de pH van intracellulaire compartimenten¹⁸te neutraliseren. Dit maakt live beeldvorming van DPP-GFP een bruikbare techniek om de dynamiek van DPP in de Drosophila-vleugel schijf te visualiseren, omdat deze uit zure compartimenten in de extracellulaire omgeving wordt vrijgegeven.

Hier beschrijven we de methode die we gebruiken om DPP-release-gebeurtenissen te visualiseren met behulp van DPP-GFP. DPP-GFP kan worden uitgedrukt in het oorspronkelijke patroon in Drosophila vleugel schijven met behulp van het UAS-GAL4 systeem¹⁹. Dit is de methode die werd gebruikt om te bepalen dat IRK kanalen invloed DPP release¹⁸. We hebben de methode gevalideerd door Live-Imaging z-stacks. We zien niet DPP-GFP puncta verplaatsen binnen het vlak van focus in time series als we in één vlak van focus verworven. We zien ook geen beweging van DPP-GFP puncta als we in een z-stack hebben gefotografeerd. We concluderen dat de DPP-GFP puncta gezien met behulp van deze methode release-gebeurtenissen in plaats van beweging van blaasjes intracellularly. Deze methode van Live-Imaging van DPP-GFP kan mogelijk worden gebruikt voor het testen van andere putatieve modifiers van DPP vrijlating voor hun impact op DPP dynamiek of kan worden aangepast om te kijken naar de dynamiek van andere liganden

Protocol

1. eieren verzamelen om larven voor dissectie te genereren

1. Cross 30-40 Maagd vrouwelijke DPP-GAL4/TM6 TB hu vliegt naar 10-15 mannelijke SP/CyO-GFP; UAS-DPP-GFP/TM6 TB hu.
   Opmerking: Elke twee genotypen die DPP-GAL4 en UAS-DPP-GFP bevatten, mogen worden gebruikt zolang de load balancers larvale markers hebben die de geschikte nakomelingen tijdens de larvale fase kunnen selecteren.
2. Om eieren te verzamelen, draai de gekruiste vliegen in een frisse flacon met voedsel en laat ze 3 – 4 uur leggen voordat ze uit de injectieflacon worden gehaald. Om het leggen van eieren aan te moedigen, kan een kleine hoeveelheid gist pasta gemaakt van gegranuleerde gist vermengd met een kleine hoeveelheid water aan de bovenkant van het voedsel worden toegevoegd voordat de vliegen worden geïntroduceerd in de injectieflacon. Dezelfde reeks gekruiste vliegen kan worden gehouden en gebruikt voor maximaal 7 dagen van ei collecties.
   Opmerking: Elk standaard Drosophila maïsmeel voedsel recept moet aanvaardbaar zijn. Hier wordt het voedsel recept beschreven door Hazegh en reis²⁰.
3. Bewaar de Eier collectie flesjes bij 25 °C gedurende ongeveer 144 uur totdat larven zich in het derde INSTAR (zwervende) stadium bevinden.
4. Om de geschikte larven voor dissectie te selecteren (die zowel DPP-GAL4 als UAS-DPP-GFP uitdrukken) Kies eerst larven die niet-TB zijn. Deze larven zijn normale lengte in plaats van kort en vet.
5. Onder de niet-TB larven zijn er larven die CyO-GFP uitdrukken en larven die DPP-GFP uitdrukken. Om de DPP-GFP uit te kiezen die larven uitdrukt, Bekijk ze onder een fluorescentie stereomicroscoop. Hoewel zowel DPP-GFP als CyO-GFP die larve uitdrukt een zekere GFP-fluorescentie zal hebben, kan de DPP-GFP die larven uitdrukt, worden onderscheiden doordat de GFP beperkt is tot de vleugel schijven en de fluorescentie veel minder helder is dan de CyO-GFP die larven uitdrukt. Selecteer deze minder heldere larven voor dissectie.

2. oplossing voorbereiden voor larvale beeldvorming en dissectie

1. Voor Live beeldvorming van vleugel schijven, bereid gemodificeerde HL3 media²¹ (70 mm NaCl, 5 mm kcl, 1,5 mm CACL₂ Dyhydraat, 4 mm MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 5 mM trehalose DYHYDRAAT, 115 mm sucrose, 5 mm Hepes). Met deze media kan de vleugel schijf in leven worden gehouden voor Imaging²¹.
2. Pas de pH op 7,1 met behulp van HEPES en filter met een 0,22 μm filter. Gebruik deze media voor zowel de dissecties van de vleugel schijf als de montage media voor Live Imaging.

3. Dia's voorbereiden voorvleugel schijf montage

1. Plaats twee stukjes kleurloze dubbelzijdige tape in de breedte van een Microscoop-dia, waardoor er een ruimte van ongeveer 5 mm tussen zit. De stukken tape moet lang genoeg zijn dat de uiteinden van de tape liggen vlak met de randen van de Microscoop-dia.
2. Gebruik een platte rand (zoals het handvat-uiteinde van een paar ontleden Tang) om de tape stevig op de dia te drukken, zodat er geen media eronder kunnen sijpelen.
3. Plaats 25 μL gemodificeerde HL3 media tussen de twee stukken tape. De vleugel schijf wordt in deze druppel media tussen stukjes tape gemonteerd, zodat de tape voorkomt dat de afdekplaat de schijf verpletterd (Figuur 1a).

4. ontleden en monteren van vleugel schijven voorbeeld vorming

1. Dissect larven in de voorbereide gemodificeerde HL3 media²⁶.
2. Voorzichtig scheuren larven in tweeën met behulp van twee paren van de Tang en gooi de achterste helft van de larve.
3. Pak het midden van de voorste helft van de larve met één paar tang en gebruik een ander paar gesloten tang om de mond haken terug in de larve te duwen totdat de larve volledig is omgekeerd.
4. De vleugel schijven kunnen gemakkelijk worden gevonden door te zoeken naar de scherpe bochten in de twee donkerdere gekleurde primaire takken van de tracheae die langs beide zijden van de larven lopen. De vleugel schijven liggen direct onder deze bochten in de tracheae in een omgekeerde larve.
5. Verwijder de vleugel schijven voorzichtig en breng ze over naar de 25 μL van HL3 media op de voorbereide Microscoop-dia. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen stukjes luchtpijp aan de ontleed vleugel schijven worden bevestigd, omdat dit de schijven kan laten zweven, waardoor beeldvorming moeilijk wordt.
6. Plaats de vleugel schijf zodanig dat de peripodial zijde van het vleugel zakje naar boven is gericht, weg van de Microscoop glijbaan met de schijf plat (Zie Figuur 1A, B).
7. Bedek de vleugel schijf en tape met een dekslip en sluit de afdekplaat af met nagellak. Zodra de Polish droog is, gaat u onmiddellijk verder met de onderstaande beeldvormings stappen.

5. Imaging DPP release

1. Beeld de gemonteerde vleugel schijf met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 40x olie doelstelling en 488 nm laser. De DPP-GFP moet verschijnen als een streep van GFP fluorescentie in het midden van de vleugel schijf met kleine puncta van DPP-GFP wordt vrijgelaten uit deze middelste streep van cellen.
2. Verzamel beelden met een snelheid van 2 Hz gedurende 2 minuten om de DPP-release te visualiseren. Voor de beste resultaten stelt u de laser in op een instelling die alleen sterk genoeg is om een duidelijk beeld te krijgen van de DPP-Releasing cellen om te voorkomen dat ze overbleken tijdens de beeld verzameling. De beelden kunnen worden verzameld als een tijdreeks die vervolgens kan worden geëxporteerd als AVI-bestanden (geen compressie, 3 frames/s) om videobestanden van de DPP-release te verkrijgen.

Resultaten

Afbeelding 2 toont representatieve Live-Imaging resultaten van dit protocol. Wanneer het protocol succesvol is, kan DPP-GFP worden gezien als een streep in het midden van de vleugel schijf met kernen die zichtbaar zijn als niet-fluorescerende cirkels binnen de DPP-GFP-regio (Figuur 2). DPP-GFP-release is zichtbaar als fluorescerende puncta die verschijnen en verdwijnen. We hebben waargenomen DPP-GFP fluorescentie verschijnen en verdwijnende in de cellichamen en ...

Discussie

BMPs zoals DPP maken hun aanzienlijke impact wanneer ze een complex van membraan gebonden receptoren binden aan een cascade van intracellulaire signalering in naburige of schijnbaar verre cellen veroorzaken. Het lab van Dr. Thomas Kornberg heeft aangetoond dat cellen die de DPP-signaal contact cellen produceren die het signaal ontvangen met behulp van actine-gebaseerde dunne filapodia-achtige structuren genaamd cytonemes^15,24,25...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Baker's yeast	Red Star
CaCl2 dyhydrate	Fisher Scientific	C79-500
Coverslips	VWR	484-457
Double-sided tape	Scotch
Drosophila Agar Type II	Apex	66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu			Deze voorraad zal binnenkort beschikbaar zijn bij Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu			Deze voorraad zal binnenkort beschikbaar zijn bij Bloomington Drosophila Stock Center
Dumont Tweezers #5	World Precision Instruments	500233	Forceps voor dissectie
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
KCl	Fisher Scientific	AC193780010
Light Corn Syrup	Karo
Malt Extract	Breiss
MgCl2	Fisher Scientific	AC223210010
Microscope slides	Sigma Aldrich	S8400
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
NaHCO3	RPI	S22060-1000.0
Nail polish	Electron Micsroscopy Sciences	72180
Propionic Acid	VWR	U330-09
Soy Flour	ADM Specialty Ingredients	062-100
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Sucrose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Trehalose dyhydrate	Chem-Impex International, Inc.	00766
Yellow Corn Meal	Quaker
Zeiss LSM 780 confocal microscope	Zeiss		Microscoop voor live imaging
Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope	Zeiss		Microscoop voor dissecties