Functionele karakterisatie van RING-type E3 Ubiquitin ligases in vitro en in planta

Samenvatting

Het doel van dit manuscript is om een overzicht te presenteren voor de uitgebreide biochemische en functionele studies van de RING-type E3 ubiquitine ligases. Deze pijplijn met meerdere stappen, met gedetailleerde protocollen, valideert een enzymatische activiteit van de geteste eiwitten en laat zien hoe u de activiteit koppelt aan functie.

Samenvatting

Ubiquitination, als een posttranslationele modificatie van eiwitten, speelt een belangrijke regelgevende rol in de homeostase van eukaryotische cellen. De covalente gehechtheid van 76 aminozuur ubiquitine-modificatoren aan een doel proteïne, afhankelijk van de lengte en topologie van de polyubiquitinketen, kan resulteren in verschillende uitkomsten variërend van eiwit degradatie tot veranderingen in de lokalisatie en/of activiteit van gemodificeerd eiwit. Drie enzymen katalyseren sequentieel het Ubiquitination proces: E1 ubiquitine-activerende enzym, E2 ubiquitine-conjugating enzym, en E3 ubiquitine ligase. E3 ubiquitine ligase bepaalt substraat specificiteit en vertegenwoordigt daarom een zeer interessante studieonderwerp. Hier presenteren we een alomvattende benadering om de relatie tussen de enzymatische activiteit en functie van de RING-type E3 ubiquitine ligase te bestuderen. Dit vier stappen protocol beschrijft 1) hoe een E3 ligase deficiënte Mutant te genereren door middel van door de site gestuurde mutagenese die gericht is op het geconmachte RING domein; 2 – 3) hoe de alomtegenwoordige activiteit te onderzoeken, zowel in vitro als in planta; 4) hoe deze biochemische analyse te koppelen aan de biologische significantie van het geteste eiwit. Generatie van een E3 ligase-deficiënte mutant die nog steeds samenwerkt met zijn substraat maar niet langer alomtegenwoordig is voor degradatie vergemakkelijkt het testen van enzym-substraat interacties in vivo. Bovendien verleent de mutatie in het geconcongeerde RING domein vaak een dominant negatief fenotype dat in functionele Knockout-studies kan worden gebruikt als een alternatieve benadering van een RNA-interferentie benadering. Onze methoden werden geoptimaliseerd om te onderzoeken van de biologische rol van de plant parasitaire nematode Effector RHA1B, die kaapt de gastheer Ubiquitination systeem in plantencellen ter bevordering van de parasitisme. Met een geringe wijziging van het in vivo expressie systeem kan dit protocol worden toegepast op de analyse van elke RING-type E3 ligase, ongeacht de oorsprong ervan.

Inleiding

De overgrote meerderheid van de E3 ubiquitine ligasen behoren tot ring (Rhet Interesting NEW Gene)-type eiwitten. De RING-Finger domein werd oorspronkelijk geïdentificeerd door Freemont et al. ¹ en functioneel omschreven als een domein bemiddelende eiwit-eiwit interactie². De canonieke RING vinger is een speciaal type zink coördinerend domein gedefinieerd als een consensussequentie van acht geconcongeerde CYS (C) en zijn (H) specifiek verdeeld over andere aminozuurresiduen (X), C-X₂-c-_{x 9 – 39}-c-x_{1 – 3}-h-x_{2 – 3}-c/h-x₂-c-x_{4 – 48}-c-x₂-c. Twee Zn^{2 +} -ionen worden gestabiliseerd door kern c-en H-residuen door middel van unieke "cross-brace"-topologie met c₁/c₂ en c/H₅/c₆ die de eerste Zn^{2 +} Ion coördineren, terwijl c₃/u₄ en c₇/c₈ de tweede binden (Figuur 1A)^3,4. Afhankelijk van de aanwezigheid van C of H in de vijfde Zn^{2 +}-coördinatie site, werden twee canonieke subklassen van Ring-Finger-eiwitten gedefinieerd: C3HC4 en C3H2C3 (ring-HC en ring-H2, respectievelijk). Omdat de ring domein van de E3 ubiquitine ligase bemiddelt de interactie tussen E2 hydroxylatie enzymen en substraten, mutatie van deze essentiële C en H residuen is aangetoond dat de ligase activiteit⁵verstoren. Een extra vijf minder voorkomende subklassen van ring E3 ligasen zijn beschreven (ring-v, ring-C2, ring-D, ring-S/T en ring-G)⁶. De ring-type E3 ubiquitine ligasen kunnen verder worden onderverdeeld in eenvoudige en complexe E3 enzymen. De enkelvoudige enkelvoudige subeenring E3-ligasen bevatten zowel de herkennings site voor substraat als het E2-bindings ring domein. Daarentegen, de multisubunit RING-type E3 complex ofwel rekruteren substraat of bemiddelt binding van de E2-ubiquitin intermediair naar de E3 complex. Het RING domein Lys residu (s) dat dient als primaire ubiquitine Attachment site (s) voor zelf-ubiquitisatie kan ook belangrijk zijn voor de E3 ligase activiteit.

Niet alle RING-bevattende eiwitten functioneren als E3 ligases. Zo moet de bioinformatische voorspelling van RING-Finger domein en de capaciteit voor E2-afhankelijke eiwit Ubiquitination biochemisch gevalideerd zijn en gekoppeld aan de biologische rol van het geteste eiwit. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol waarin wordt beschreven hoe u de enzymatische activiteit van RING-type E3 ubiquitine-ligases, zowel in vitro als in Planta, op te sporen en functioneel te karakteriseren via een door de site geleide mutagenese benadering. De representatieve resultaten van deze pijplijn worden weergegeven voor de RING-type E3 ligase RHA1B. RHA1B is een Effector eiwit geproduceerd door de plant parasitaire cyste nematode Globodera pallida om de immuniteit van de plant te onderdrukken en de morfologie van plantenwortel cellen te manipuleren. Om zichzelf te beschermen tegen pathogenen/parasiet invasie, planten hebben geëvolueerd nucleotide-bindende domein en Leucine-rijke REPEAT (nb-lrr) type immuun receptoren die de aanwezigheid van een pathogeen of parasiet detecteren en, als gevolg daarvan, ontwikkelen van de overgevoelige respons (HR), dat is een vorm van snelle en gelokaliseerde celdood die zich op de infectie plaats te arresteren van ziekteverwekkers. Een dergelijke immuunreceptor is het aardappel Gpa2 eiwit dat resistentie toekent aan sommige isolaten van G. pallida (veld populaties D383 gedurende en D372)⁷.

Met behulp van de gepresenteerde protocollen, het is onlangs gevonden dat RHA1B interfereert met plant immuun signalering in een E3-afhankelijke manier door het richten van de plant Gpa2 immunoreceptor voor Ubiquitination en afbraak⁸.

Protocol

1. op de site gerichte mutagenese (Figuur 1)

1. Identificeer de behouden CYS en zijn aminozuren in het RING domein (Figuur 1A) en ontwerp primers met de substitutie codon van belang geflankeerd door 15 baseparen aan weerszijden van de mutatie plaats (Figuur 1B).
2. Introduceer de gewenste mutatie door PCR-gebaseerde versterking van het plasmide dat het gen van belang verveelt met behulp van mutagene primers en High-Fidelity DNA-polymerase met Pfu in 50 μL van het totale PCR-reactievolume, zoals weergegeven in tabel 1 en tabel 2 volgens het Protocol van de fabrikant.
3. Verteren de door de Escherichia coliafgeleide ouderlijke gemethyleerd en semi-gemethyleerd DNA door 3 μL DPNI restrictie enzym rechtstreeks toe te voegen aan de PCR-reactie (stap 1,2) en te incuberen bij 37 °c gedurende 2 uur.
   Opmerking: methylatie is een posttranscriptionele eiwit modificatie die wordt toegevoegd aan het door bacteriën geproduceerde en geïsoleerde plasmide. Nieuwe kopieën van PCR-gegenereerde plasmide ontbreken methylatie, daarom zullen de nieuwe kopieën intact blijven tijdens de behandeling met DPNI .
4. Reinig de gemutageniseerde plasmiden met behulp van een commerciële DNA-extractie Kit op basis van spin kolom technologie en elueer het DNA met 50 μL water.
5. Transformeer DH5α E. coli chemisch competente cellen met 0,5 μL van het teruggewonnen gemutageniseerde plasmide DNA volgens het Protocol van de fabrikant. In het kort, inincuberen competente cellen met DNA op ijs voor 30 min, dan hitte-schok ze voor 20 s bij 42 ° c, en plaats de buisjes opnieuw op ijs voor 2 min. Inbroed cellen met 500 μL LB media bij 37 °C gedurende 1 uur bij 250 TPM en verdeel ze vervolgens over selectieve Paten.
6. Controleer de gewenste mutatie door Sanger sequencing de DNA plasmiden geïsoleerd van E. coli.

2. recombinant-eiwit zuivering en in vitro ubiquitinatie test

1. Kloon de wild typering en gemuleerde RING genen van belang in de pMAL-C2 vector (volg het Protocol van de fabrikant; Tabel 3) om deze genen te fuseren met de MBP epitoop tag die één-stap zuivering met behulp van amylose Resin toestaat. Introduceer de resulterende constructies in de E. coli BL21 stam zoals beschreven in stap 1,5.
2. Kweek de E. coli stam BL21 verhard de gewenste constructie in 50 ml lb vloeibaar medium bij 37 °c gedurende 2 – 3 uur totdat het de logaritmische fase bereikt (OD₆₀₀ van 0,4 – 0,6).
3. Voeg IPTG toe aan een eindconcentratie van 0,1 – 1 mM om de expressie van met MBP gelabelde recombinant proteïne te induceren en de E. coli -cultuur te inbroed voor 2 – 3 uur bij 28 °c. Plaats de cultuur na incubatie op ijs.
   Opmerking: Voer stappen 2.4 – 2.13 op ijs uit om eiwitten te beschermen tegen degradatie.
4. Om te controleren op de inductie-efficiëntie, verzamelen 1,5 ml geïnduceerde cellen, spin ze op 13.000 x g gedurende 2 minuten, verwijder de supernatant en regeer de cellen in 20 μL van 2x SDS-page laad buffer (24 mm tris-HCl pH 6,8, 0,8% SDS, 10% (v/v) glycerol, 4 mm DTT, 0,04% (w/v) broomfenolblauw).
5. Kook de monsters 5 min en voer ze uit op een 10% SDS-PAGE gel. Voor het visueel evalueren van accumulatie van MBP-fusie-eiwit (moleculair gewicht van eiwit van belang + 42,5 kDa MBP), vlek de gel gedurende 20 minuten door roeren met Coomassie-kleurings buffer (50% methanol, 10% azijnzuur, 0,1% Coomassie blauw) en dekleuring 's nachts met de ontkleurings buffer (20% methanol, 10% azijnzuur).
6. Oogst de resterende E. coli cellen door centrifugeren bij 1.350 x g gedurende 6 minuten, gooi het supernatant weg en regeer de celpellet met 5 ml kolom buffer (20 mM tris HCl, 200 mm NaCl, 1 mm EDTA, bacteriële proteaseremmer).
   Opmerking: dit is een goede plek om het protocol 's nachts te stoppen. De bevroren cellen kunnen tot 1 week bij-20 °C worden bewaard.
7. Afbreken E. coli cellen door het plaatsen van de buis met de bacteriën in een ijswaterbad en het toepassen van 10 sonicatie cycli: 10 s sonicatie bij 30% amp gevolgd door 20 s pauzes.
8. Centrifugeer het monster met 13.000 x g bij 4 °c gedurende 10 minuten en sla het supernatant (ruw extract) op.
9. Bereid 500 μL amylose Resin in een buis van 15 mL. Was de hars door toevoeging van 10 mL koude kolom buffer en centrifugeren bij 1.800 x g, 4 °c gedurende 5 min. Doe dit 2x.
10. Voeg 5 mL ruw extract toe aan de buis met het amylose-hars en incuberen 's nachts bij 4 °C.
11. Centrifugeer op 1.800 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
12. Voeg 10 mL kolom buffer toe aan de hars pellet en inincuberen gedurende 20 min. Vervolgens Centrifugeer op 1.800 x g bij 4 °c gedurende 5 min. Herhaal deze stap 2x.
13. Elute het fusie-eiwit met 0,5 mL kolom buffer met 10 mM maltose door een monster voor 2 uur op 4 °C te bebroed. Centrifugeer op 1.800 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten en verzamel het eluteerde eiwit. Herhaal deze stap 2x.
14. Dialyze 1 mL van de eiwitfractie tegen de koude PBS. Aliquot-eiwit in buisjes voor eenmalig gebruik (10 – 20 μL) om Vries ontdooien te voorkomen en bij-80 °C te bewaren tot het nodig is.
15. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford assay⁹.
16. Stel de in vitro ubiquitinatie-reactie in een totaal volume van 30 μL in door menging van 40 ng van E1 (bijv. AtUBA1), 100 ng van E2 (bijv. AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1 μg MBP-RING type eiwit, en 2 μg FLAG-UB (of HA-UB) in de alomtegenwoordige buffer (50 mM tris-HCl pH 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl₂, 30 mm creatine fosfaat, 50 μg/ml Creatine fosfokinase). Inbroed het mengsel bij 30 °C gedurende 2 uur.
    Opmerking: Maak een buffer van 20x Ubiquitination en bewaar deze tot 6 maanden bij-20 °C in kleine aliquots voor eenmalig gebruik. De creatine fosfokinase verliest gemakkelijk zijn enzymatische activiteit wanneer de buffer herhaaldelijk wordt ontdooid en bevroren.
17. Beëindig de reactie door het mengen van de 30 μL monsters met 7,5 μL van 5x SDS-page laad buffer (60 mm tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 25% (v/v) glycerol, 10 mm DTT, 0,1% (w/v) broomfenolblauw) en koken gedurende 5 min.
18. Scheid de eiwitten met 7,5% SDS-polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE), breng vervolgens over naar het PDVF-membraan en Detecteer alomtegenwoordig door Western blotting met behulp van de anti-FLAG (of anti-HA).
19. Beits het PVDF-membraan met Coomassie Blue om de gelijke belasting van het geteste MBP-RING-type eiwit te controleren.

3. Agrobacterium-gemedieerde voorbijgaande eiwit expressie in Nicotiana benthamiana bladeren en in planta Ubiquitination assay

1. Streak geschikte Agrobacterium tumefaciens stammen met de epitope-Tagged gen van belang (bijv., ha-RHA1B, ha-RHA1B^C135S, ha-RHA1B^K146R, ha-UB) en lege vector als een controle op de LB medium met de juiste selectie antibiotica.
2. Na 2 dagen van de groei op 28 ° c, pick-up enkele kolonies en groeien ze in LB vloeibaar medium met de juiste antibiotica bij 28 °C/250 rpm voor nog eens 24 uur.
3. Breng 100 μL agrobacteriële cultuur over naar 3 mL verse LB met de juiste antibiotica en inincuberen de cultuur voor een extra 4 – 6 uur bij 28 °C met rotatie (250 rpm) tot de late exponentiële groeifase.
4. Spin agrobacteriële cellen bij 1.800 x g gedurende 6 minuten, gooi het supernatant weg en regeer cellen met 3 ml wasbuffer (50 mm MES pH 5,6, 28 mm glucose, 2 mm Nah₂po₄). Herhaal deze stap 2x.
5. Na de tweede wasbeurt respendeer de cellen in de inductie buffer (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glucose, 2 mM NaH₂po_4, 200 μM acetosyringone, 37 mm NH₄cl, 5 mm MgSO₄. 7H₂O, 4 mm KCl, 18 μM Feso₄. 7h₂o, 2 mm CACL₂). Inbroed de cellen met inductie buffer voor een extra 10 – 12 h bij 28 °C.
   Opmerking: Acetosyringone induceert T-DNA-overdracht.
6. Centrifugeer de cellen op 1.800 x g gedurende 6 minuten, gooi het supernatant weg en refiltreer de cellen met 2 ml infiltratie buffer (10 mm MES pH 5,5, 200 μM acetosyringone).
   Opmerking: als Agrobacteriën samen na incubatie met inductie buffer, laat de geaggregeerde cellen zinken naar de bodem van de buis door het verlaten van het op de Bank voor een paar minuten, en breng de heldere Agrobacterium suspensie naar een nieuwe buis voordat u doorgaat met stap 3,6.
7. Meet de concentratie van bacteriën met behulp van de OD₆₀₀ -waarde (de extinctie bij absorptie van 600 nm). Pas de OD₆₀₀ waarden aan de gewenste aan.
   Opmerking: meestal werkt een OD₆₀₀ -waarde tussen 0,2 – 0,4 het beste voor een enkele agrobacteriële vlek expressie. Als een combinatie van verschillende agrobacteriële stammen wordt toegepast, mogen de totale OD₆₀₀ waarden van agrobacteriële stammen niet hoger zijn dan 1.
8. Agroinfiltrate 4 weken oude N. bethamiana bladeren door zachtjes prikken ze met een naald, gevolgd door met de hand injecteren Agrobacterium met een spuit zonder de naald. Cirkel het geïnfiltreerde blad gebied met de marker (meestal 1 – 2 cm in diameter).
9. Verzamel de geïnfiltreerde blad weefsels 36 h na infiltratie. Slijp het weefsel tot een fijn poeder met vloeibare stikstof.
10. Geresuspendeerd weefsel poeder met 300 μL EiwitExtractie buffer (50 mM tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% polyvinylpolypyrrolidon, 1 mM PMSF, cocktail van de plant proteaseremmer) en centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.
11. Breng de supernatant over naar een nieuwe buis. Voeg 5x SDS-PAGE laad buffer toe aan een uiteindelijke concentratie van 1x en kook gedurende 5 minuten.
12. Scheid ruwe eiwitten op 10% SDS-PAGE gels, breng over op PVDF-membranen en sonde met anti-HA om te detecteren in planta-Ubiquitination.

4. vaststelling van het verband tussen enzymatische activiteit en functie in planta

Opmerking: bijvoorbeeld, RHA1B bevordert afbraak van resistente eiwit Gpa2 te onderdrukken HR celdood. Deze stap laat zien hoe om te controleren of die virulente activiteiten van RHA1B E3-afhankelijke zijn.

1. Streak geschikte Agrobacterium tumefaciens stammen dragen gelabelde genen van belang (in dit voorbeeld ha-RHA1B, ha-RHA1B^C135S, ha-RHA1B^K146R, Myc-Gpa2, RBP1) en lege vector als een besturingselement. Volg de stappen 3.1 – 3.8 voor de voorbereiding van Agrobacterium en injectie op N. bethamiana bladeren.
2. Volg de stappen 3.9 – 3.12 voor de E3-afhankelijke substraat proteïne degradatie en voer de westerse blotting uit met geschikte antilichamen om de eiwit accumulatie in plantencellen te detecteren (bijv. anti-HA en anti-MYC).
3. Voor de E3-afhankelijke overgevoelige respons (HR) gemedieerde celoverlijdens remming, monitor de agroinfiltrated bladeren voor HR celdood symptomen 2 – 4 dagen na infiltratie.

Resultaten

In dit deel worden representatieve resultaten gegeven voor het protocol dat wordt gebruikt voor het onderzoek van één enkele subeenheid E3 ubiquitine ligase RHA1B met een PROSITE-voorspelde RING-H2-type domein (132 – 176 aminozuren)¹⁰. Zoals weergegeven in Figuur 1, moet voor het verkrijgen van een E3-deficiënte Mutant eiwit ten minste één van de acht geconmaelde CS of HS in het ring domein (Figuur 1A) worden mutageen (Figuur 1B). Zo werden, als eerste stap, twee Mutante versies van RHA1B, RHA1B^C135S (een vervanging van CYS door ser in het Geconeerde C₃ van ring domein) en RHA1B^K146R (een vervanging van Lys door arg in de enige in RHA1B aanwezige Leie) gegenereerd. Hoewel enkele subeenheid E3 ligasen van bemiddelen ubiquitine Transfer van ubiquitine harkotteren E2 naar het substraat in plaats van direct interactie met ubiquitine, kan zelf-alomtegenwoordige E3 bij Lys nodig zijn voor zijn maximale enzymatische activiteit.

De westerse blotting resultaten in Figuur 2a tonen een typisch positief in vitro Ubiquitination assay resultaat, met een multibanding uitstrijkje beginnend bij het molecuulgewicht van het geteste eiwit (e. g., MPB-gesmolten RHA1B ~ 100 kDa) en vordert opwaarts. De anti-HA antilichaam erkende HA-Tagged UB opgenomen in de poly-Ubiquitination keten van verschillende lengtes, het creëren van deze typische ubiquitin-geassocieerde ladder-achtige uitstrijkje. Voor het valideren van de positieve resultaten, Figuur 2A presenteert ook alle belangrijke negatieve controles ontbrekende afzonderlijke componenten (E1, E2, UB, of MBP-RHA1B) of met behulp van MBP als controle en ontbreekt het besmeurd Ubiquitination signaal. Bovendien toonde de Coomassie blauwe kleuring van het PVDF-membraan gelijke belasting van MBP-RHA1B of MBP in alle besturingselementen.

Figuur 2B toont hoe in vitro de resultaten van de ubiquitatie varieerden, afhankelijk van de specifieke E2/E3-combinatie. In dit voorbeeld werden 11 verschillende E2s die 10 verschillende E2-families vertegenwoordigden getest. De gedetecteerde alomtegenwoordige activiteit varieerde van geen signaal (geen uitstrijkje) tot een multibanding uitstrijkje beginnend bij verschillende molecuulgewichten, wat duidt op verschillende ubiquitinatie patronen.

Figuur 3 toont de resultaten van de Ubiquitination-assay voor de ring-en K-Mutant versies van geteste eiwitten. Gebrek aan enzymatische activiteit voor RHA1B^C135S wordt ondersteund door het onvermogen om ofwel een multibanding uitstrijkje in vitro te genereren (Figuur 3a) of het poly-alomtegenwoordige signaal in planta te bevorderen (Figuur 3B). Het is opmerkelijk dat de overexpressie van HA-Tagged UB in planta op eigen wijze het basale niveau Ubiquitination in alle geteste monsters, inclusief de vector controle, in tegenstelling tot het sterke Ubiquitination-signaal dat wordt verleend door de enzymatische activiteit van wild type RHA1B. Bovendien suggereert de analyse van de RHA1B^K146R Mutant dat het K146 residu ook essentieel is voor de E3-activiteit van RHA1B. Hoewel in vitro een marginaal zelfalomtegenwoordig signaal werd gedetecteerd (Figuur 3a), werd in de Planta-test bepaald dat het Mutante E3-deficiënte is (Figuur 3B, alleen het alomtegenwoordige signaal van de achtergrond gedetecteerd).

Na het genereren en biochemisch valideren van de E3-deficiënte Mutant, functionele studies kunnen worden ontworpen om te bepalen van de E3-geassocieerde biologische rol van de geteste RING E3 ubiquitine ligase. In het geval van RHA1B, deze nematode Effector onderdrukt plant immuun signalering, zoals gemanifesteerd door onderdrukking van de Gpa2-geactiveerde HR celdood. Zoals weergegeven in Figuur 4A, in tegenstelling tot de wild type RHA1B, de RHA1B^C135S Mutant ontbreekt E3 ligase activiteit niet interfereren met HR celdood. Gezien het feit dat de meest voorkomende uitkomst van het gebruik van eiwitten de proteasome-gemedieerde afbraak is, kunnen mutaties die zich in het RING domein bevinden ook worden gebruikt om een E3-afhankelijke mogelijkheid te controleren om degradatie van hun directe en/of indirecte substraten te activeren. Zo, significant, Western blotting resultaten in Figuur 4B bevestigen dat Gpa2 niet accumuleren in de aanwezigheid van wild type RHA1B maar RHA1B^C135S had geen invloed op Gpa2 eiwit stabiliteit.

Figuur 1: schematische weergave van het beginsel en de stappen in de door de site geleide mutagenese. A) ring-CH/H2-domein met geconcongeerde CYS en zijn aminozuren gemarkeerd. B) een voorbeeld van het ontwerp van mutagene primers. C) stappen van door de site geleide mutagenese. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: representatief in vitro ubiquitinatie test. (A) top gel toont Ubiquitination assay inclusief alle negatieve controles, en bottom gel toont gelijke belasting. B) het bereik van de verwachte resultaten, afhankelijk van de E2-enzymen. Dit cijfer is gewijzigd van Kud et al⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Ubiquitinatie testresultaten voor RING-en K-mutanten (RHA1B^C135S en RHA1B^K146R). A) in vitro resultaten van de ubiquitatie voor RHA1B^C135S en RHA1B^K146R. B) in de resultaten van Planta Ubiquitination ASSAY voor RHA1B^C135S en RHA1B^K146R. Dit cijfer is gewijzigd van Kud et al⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: representatieve functionele studie voor E3 afhankelijke biologische functies. Een voorbeeld van functionele studies waaruit de E3-afhankelijke biologische functie blijkt. A) E3-afhankelijke afdood onderdrukking van HR-cellen en (B) afbraak van een plant-immunoreceptor Gpa2. Dit cijfer is gewijzigd van Kud et al⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

PCR-opstelling
1 μL	plasmide (~ 100 ng)
1,5 μL	F mutagene primer (10 μM)
1,5 μL	R mutagene primer (10 μM)
1 μL	dNTPs (10 mM)
5 μL	buffer (10x)
1 μL	Ultra Pfu polymerase (2,5 U/μl)
39 μL	ddH2O
50 μL	TOTAAL VOLUME

Tabel 1: PCR-reactie instellen

Thermo cycler-programma
1	95 °C	30 s
2	95 °C	30 s
3	60 °C	30 s
4	72 °C	5 min.	Herhaal 2-4 30 keer
5	72 °C	5 min.

Tabel 2: PCR-Thermocycler-programma

ligatie reactie ingesteld voor het RHA1B-voorbeeld
1,5 μL	pMAL-C2:: MBP gelineariseerde vector door spijsvertering met BamHI en SalI (60 ng)
7 μL	RHA1B/RHA1BC135S of RHA1BK146R insert verteerd met BamHI en SalI (25 ng)
1 μL	T4 ligase buffer (10x)
0,5 μL	T4 ligase (400 U/μL)
10 μL	TOTAAL VOLUME

Tabel 3: Ligatie reactie ingesteld voor het RHA1B-voorbeeld.

Discussie

Elucidating de biochemische en mechanistische basis van ring type E3 ubiquitine ligasen kunnen sterk bijdragen tot ons begrip van hun biologische betekenis in ontwikkeling, stress signalering, en het onderhoud van homeostase. Het hier beschreven protocol paren een mutagenese benadering met in vitro en in functionele studies van Planta. Door de invoering van één enkele aminozuur substitutie in de behouden residuen van het RING domein door middel van site-directe mutagenese, kan de resulterende E3-deficiënte Mutant parallel met wild type proteïne worden getest om enzymatische activiteit te koppelen aan functionaliteit.

Het is van cruciaal belang om het RING domein goed te identificeren, met name de gekonveerde CYS en zijn residuen. Online tools zoals PROSITE kan worden gebruikt om dit te doen¹⁰. Om het ring domein dat verantwoordelijk is voor het werven van het E2-enzym te destabiliseren, wordt CYS normaalgesproken vervangen door ser, wat de dichtstbijzijnde structurele vervanging is, zonder de mogelijkheid om een bisulfide-binding te creëren die wordt gebruikt voor zink coördinatie. Lorick et al. toonde aan dat de mutatie in een van die kritische CYS-residuen de alomtegenwoordige activiteit van de enkelvoudige subeenring-type E3-ligasen⁵zou afschaffen. Hoewel sommige CYS-residuen ook belangrijk zijn voor multi unit E3 ligase-complexen met RING-type eiwitten, vanwege de veelzijdige en dynamische driedimensionale structuur van die alomtegenwoordige complexen en de verschillende rol van RING-type eiwitten, zijn enkelvoudige substituties van gecongeerde residuen in het RING domein in multi unit E3 ligase niet succesvol geweest bij het genereren van een ligase deficiënte fenotype¹¹.

Voor de site gerichte mutagenese vonden we dat het gebruik van kleinere plasmide vectoren en lagere versterkings cycli meestal een hogere efficiëntie voor mutagenese leverde. Het Pfu-enzym kan worden vervangen door elke andere high-fidelity en hoge processiviteit DNA-polymerase. Bovendien, als het gen van belang zeldzame Codons bevat, kan een andere E. coli vlek, Rosetta, worden gebruikt om een hogere opbrengst van het recombinant eiwit te bereiken. Bovendien kunnen zowel de incubatietijd als de temperatuur voor IPTG-inductie verder worden geoptimaliseerd. Lagere temperaturen verminderen E. coli delings snelheid, wat gunstig kan zijn voor de expressie van bepaalde eiwitten. Hoewel hogere concentratie van IPTG eiwit expressie kan verbeteren, het remt ook E. coli divisie processen en wordt niet aanbevolen.

Enkele subeenheid ring type E3 ligasen functioneren niet alleen als een moleculaire steiger die de E2-UB-intermediair in de nabijheid van het substraat positioneert, maar ook de ubiquitine-overdrachtsactiviteit van hun verwant E2s stimuleert. Bovendien, gezien het feit dat een combinatie van E2/E3 belangrijk is voor de lengte en de verbanden van de polyubiquitinketen die het lot van een gemodificeerd substraat bepaalt, moet elke overweging van het RING type E3s hun enzymatische partners, E2s¹², omvatten. Zoals weergegeven in Figuur 3B, zijn niet alle geteste E2S compatibel met de RHA1B ligase. Daarom moet in vitro alomtegenwoordige assays parallel worden gedragen met meerdere E2-enzymen die verschillende E2-klassen vertegenwoordigen om vals-negatieve resultaten te voorkomen.

Hier gepresenteerd is de in vitro enzymatische assay die het zelf-alomtegenwoordige vermogen van geteste RING-achtige eiwitten detecteert. Met kleine aanpassingen kan dit protocol echter eenvoudig worden aangepast om in vitro Ubiquitination van substraten te detecteren. Daartoe moet het in vitro ubiquitinatie mengsel uit stap 2,15 worden aangevuld met het recombinant eiwit van het potentiële E3 ligase substraat (500 ng). Na een incubatie van 2 uur bij 30 °C moet het alomtegenwoordige eiwit worden opgevangen met 15 μL anti-HA-affiniteits matrix (als HA-UB wordt gebruikt, of een anti-FLAG-affiniteits matrix als FLAG-UB wordt gebruikt) door roeren gedurende 2 uur bij 4 °C. Na het wassen van de kralen 4x keer met de Cold UB Wash buffer (20 mM tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), gooi alle maar 40 μL van de buffer weg en ga naar stap 2,16. Het alomtegenwoordige signaal, gedetecteerd door antilichamen die specifiek zijn voor de epitope-Tagged UB en substraat, die ontstaan uit moleculair gewicht van het substraat eiwit, bevestigt het substraat/enzym specificiteit.

Bovendien wordt de identificatie van E3 ligase substraten in vivo meestal geassocieerd met meerdere uitdagingen als gevolg van voorbijgaande enzym-substraat interactie en snelle afbraak van alomtegenwoordige doel eiwitten. Met behulp van een E3 ligase deficiënte Mutant, die nog steeds samenwerkt met zijn doelwit maar niet langer alomtegenwoordig is¹³, is een zeer nuttig alternatief voor de toevoeging van proteasomale inhibitor MG132, die niet altijd voldoende interfereert met 26s proteasoom functie.

Een gemeenschappelijk kenmerk van ring-type E3 ligasen is de neiging om te vormen en te functioneren als homo-en/of heterodimers. Interessant is dat de substitutie in de behouden residuen van het RING domein meestal wordt geassocieerd met een dominant negatief fenotype waar gemuleerd RING-type E3 ligase de enzymatische activiteit van een inheems wild type eiwit¹³blokkeert. Dus, overexpressie van RING mutanten in planta kan een alternatieve benadering zijn om het E3 ligase gen uit te kloppen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Azijnzuur	Sigma-Aldrich	A6283
Acetosyringon	Sigma-Aldrich	D134406
Amylosehars	NEB	E8021S
ATP	Sigma-Aldrich	A1852
Bacterieel proteaseremmer	Sigma-Aldrich	P8465
Broomfenolblauw	VWR	97061-690
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
Centrifuge	Beckman Coulter	model: Avanti J-25
Commassieblauw	VWR	97061-738
Creatinefosfaat	Sigma-Aldrich	P7936
Creatinefosfokinase	Sigma-Aldrich	C3755
DNA clean & concentrator Kit	ZYMO RESEARCH	D4029
DpnI	NEB	R0176S
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
E. coli BL21	Thermo Fisher Scientific	C600003
E. coli DH5α competent cellen	Thermo Fisher Scientific	18265017
EDTA	Sigma-Aldrich	324504
FeSO4 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002
FLAG-Ub	BostonBiochem	U-120
Glucose	VWR	188
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HA-Ub	BostonBiochem	U-110
Heat block	VWR	model: 10153-318
Incubator	VWR	model: 1525 Digital Incubator
Incubator shaker	Thermo Fisher Scientific	model: MaxQ 4000
IPTG	Roche	10724815001
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
LB Broth	Sigma-Aldrich	L3022
Vloeibare stikstof	universiteitschemicus
Maltose	Sigma-Aldrich	63418
MES	Sigma-Aldrich	M3671
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
MgCl2	Sigma-Aldrich	63138
MgSO4 7H2O	Sigma-Aldrich	63138
Microcentrifuge	Eppendorf	model: 5424
Miniprep plasmidzuiveringskit	ZYMO RESEARCH	D4015
monoklonaal anti-FLAG-antilichaam	Sigma-Aldrich	F3165
monoklonaal anti-HA-antilichaam	Sigma-Aldrich	H9658
monoklonaal anti-MYC-antilichaam	Sigma-Aldrich	WH0004609M2
Mortier	VWR	89038-144
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	model: 2000 Spectrophotometer
Naald	Thermo Fisher Scientific	14-826-5C
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
PCR-machine	Bio-Rad	model: C1000
Kolf	VWR	89038-160
Pfu Ultra	Agilent Technologies	600380
Plant proteaseremmercocktail	Sigma-Aldrich	P9599
pMAL-c2	NEB	N8076S
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Polyvinylpolypyrrolidon	Sigma-Aldrich	P6755
SDS	Sigma-Aldrich	1614363
Sonicator	Qsonica Sonicators	model: Q125
Spuit	Thermo Fisher Scientific	22-253-260
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
T4 ligase	NEB	M0202S