Methodenartikel

Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

DOI:

10.3791/60542

⸱

24 april 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Angiogenesis and Ocular Cell Transplantation, University of Lübeck, 2Department of Ophthalmology, University of Lübeck, 3Institute of Biomedical Optics, University of Lübeck

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om hoornvliesendodelialcellen (CEC) los te koppelen van het membraan (DM) van Descemet met behulp van een neodymium:YAG (Nd:YAG) laser als ex vivo ziektemodel voor bullous keratopathie (BK).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nd: YAG lasers zijn gebruikt om niet-invasieve intraoculaire chirurgie uit te voeren, zoals capsulotomy voor meerdere decennia nu. Het indringende effect is afhankelijk van de optische afbraak bij de laserfocus. Akoestische schokgolven en cavitatiebellen ontstaan, waardoor weefselbreuk ontstaat. Belgroottes en drukamplitudes variëren met pulsenergie en positie van het brandpunt. In deze studie werden enucleated varkensogen geplaatst voor een commercieel beschikbare Nd:YAG laser. Variabele puls energieën evenals verschillende posities van de brandpunten posterior naar het hoornvlies werden getest. Resulterende laesies werden geëvalueerd door twee-foton microscopie en histologie om de beste parameters voor een exclusieve onthechting van hoornvlies endotheel cellen (CEC) met minimale bijkomende schade te bepalen. De voordelen van deze methode zijn de precieze ablatie van CEC, verminderde bijkomende schade, en vooral de contactloze behandeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transparantie van het hoornvlies is essentieel voor de overdracht van licht naar het netvlies en de fotoreceptoren1. In dit verband is een relatieve staat van uitdroging van cruciaal belang om de collageenvezels in de hoornvliesstroma correct uitgelijnd te houden. Deze homeostase wordt onderhouden door hoornvliesendotheelcellen (CEC) gelegen op het membraan van de Descemet (DM)2. Het endotheel is de binnenste hoornvlieslaag. Het heeft een belangrijke barrière en pomp functie, die cruciaal is voor hoornvlies transparantie3. In tegenstelling tot het epitheel is het endotheel niet in staat om zichzelf te vernieuwen4. Daarom stimuleert elke celschade veroorzaakt door ziekte of trauma de resterende endotheelcellen om te vergroten en te migreren, resulterende defecten te dekken en hoornvliesfunctionaliteit te behouden5. Als de CEC-dichtheid echter onder een kritische drempel zakt, leidt decompensatie van het endotheel tot een oedeem, wat resulteert in wazig zicht en ongemak of zelfs ernstige pijn4. Ondanks de beschikbaarheid van geneesmiddelen om de symptomen te verlichten, momenteel de enige definitieve behandeling in deze gevallen is hoornvliestransplantatie, die kan worden uitgevoerd in de vorm van een volledige-dikte graft of een lamellen endotheeltransplantatie. Deze laatste procedure is beschikbaar als Descemet's membraan endothelial keratoplastie (DMEK) evenals Descemet's strippen geautomatiseerde endotheel keratoplastie (DSAEK)6. De bescherming van de resterende CEC en het verbeteren van hun overleving zou echter een alternatief doel kunnen zijn, dat een adequaat ziektemodel nodig heeft om potentiële therapeutische geneesmiddelen te testen.

De huidige CEC-verliesziektemodellen richten zich op de vernietiging van het endotheel door de injectie van toxische stoffen (bijvoorbeeld benzalkoniumchloride) in de voorste kamer of door mechanische slijtage van de cellen met behulp van een invasieve descemetorhexistechniek7,8. Hoewel deze modellen goed ingeburgerd zijn, bestaan er nadelen zoals algemene ontstekingsreactie en onnauwkeurige bijkomende schade. Daarom zijn deze modellen meer kans om de laatste stadia van de ziekte te vertegenwoordigen, wanneer de bovengenoemde chirurgische opties onvermijdelijk zijn.

Met vooruitgang in cellulaire behandelingsstrategieën zoals stamcellen en gentherapie, zou de toepassing van deze cellulaire therapieën in vroege stadia van verlies CEC9nuttig kunnen zijn. Vervolgens hebben we een model nodig dat deze eerdere stadia van de ziekte beter vertegenwoordigt. In dit verband zijn celkweekmodellen de afgelopen tien jaar verbeterd, maar zijn ze nog steeds beperkt in hun geldigheid, omdat cellen in vitro niet in de buurt kunnen komen van het repliceren van de complexe interacties die optreden tussen de verschillende celtypen binnen het hoornvlies10. Daarom zijn ex vivo en in vivo ziektemodellen nog steeds in trek en het verbeteren van de bestaande modellen is van het grootste belang.

Niet-invasieve, intraoculaire chirurgie door fotoverstoring met behulp van een neodymium: YAG (Nd:YAG) laser is uitgegroeid tot een routineprocedure voor oogartsen wereldwijd sinds de invoering ervan in de late jaren 197011. Fotoverstoring is afhankelijk van niet-lineaire lichtabsorptie die leidt tot de vorming van plasma, het genereren van akoestische schokgolven en het ontstaan van cavitatiebellen, wanneer de toepassingsplaats zich in een vloeibare omgeving bevindt12. In het algemeen dragen deze processen bij aan het beoogde effect van nauwkeurig weefselsnijden. Echter, ze kunnen ook de bron van onnodige bijkomende schade beperken van de lokale opsluiting van laserchirurgie13.

De voorspelling van de resulterende mechanische effecten is aanzienlijk verbeterd door karakterisering van de schokgolf voortplanting en cavitatie cursus. Het is ons doel om CEC te richten met zo weinig mogelijk schade aan omliggende weefsel om een niet-invasieve, laser-ondersteunde experimentele ziekte model voor de vroege stadia van CEC verlies te bieden. Hiervoor is het noodzakelijk om de optimale pulsenergieën en posities van de brandpunten van de laser te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures met betrekking tot dierlijk weefsel volgen de richtlijnen van de plaatselijke Commissie dierverzorging en ethiek.

1. Voorbereiding van de orgaancultuur en laserbehandeling

  1. Verkrijg vers opgesomde varkensogen van het plaatselijke slachthuis. Houd ze koel (4 °C) in dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met hoge glucose, aangevuld met L-glutamine, natriumpyruvaat, penicilline/streptomycine (1%) en varkensserum (10%), voortaan in dit artikel als volledig medium aangeduid.
  2. Verwijder extracellulaire weefsels met een schaar en week de ogen in 5% povidone-jodium oogheelkundige oplossing voor 5 min voor het plaatsen van hen in gesteriliseerde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot gebruik.
  3. Scherm ogen voor belangrijke voorste segment pathologieën, zoals hoornvlies littekens, oedeem, en andere opacities met een spectral-domein optische coherentie tomografie apparaat (Tabel van materialen).
  4. Plaats de ogen voor een spleet-lamp unit uitgerust met een Nd:YAG laser (Tabel van materialen), die een golflengte van 1.064 nm en een brandpuntspuntsafstand diameter van 10 μm in de lucht heeft.
    OPMERKING: Voor een optimale positionering wordt een 3D-geprint e-apparaat gebruikt, dat is ontworpen om het oog stevig vast te houden, zonder er te veel druk op te leggen (figuur 1).
  5. Gebruik een vergroting van 12x en buig de verlichting af om de individuele hoornvlieslagen te visualiseren.
  6. Stel de pulsenergie (bijvoorbeeld 1,6 mJ) en het focuspunt (bijvoorbeeld 0,16 mm) in voor selectieve ablatie van endotheelcellen.
  7. Plaats een helder hoornvlies paracentesis dicht bij de limbus en injecteer visco-elastische(Tabel van materialen)om de voorste kamer te stabiliseren.
  8. Accijns het laserbehandelde centrale hoornvlies uit met een trephine van 8 mm.
  9. Plaats het uitgesneden hoornvlies in een put van een 12-put plaat met de endotheel site naar boven gericht en uitbroed het monster in 3 mL van volledig medium bij 37 °C gedurende maximaal 3 dagen.
    OPMERKING: Tijdens deze stap kunnen potentiële cytoprotectiemiddelen aan het medium worden toegevoegd.

2. Voorbereiding van de histologie

  1. Bereid de buffer van Sorensen voor met een pH van 7,4 met 19,6 mL van 133 mM KH2PO4 en 80,4 mL van 133 mM Na2HPO4.
  2. Verwijder het medium uit het hoornvlies houdende put en fixer het weefsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur (RT) met methanolvrije paraformaldehyde (4%) in de buffer van Sorensen.
  3. Plaats weefsel in 20% sacharose in PBS tot weefsel zinkt (1 uur) en vervolgens in 30% sacharose in PBS 's nachts bij RT. Zorg ervoor dat u contact met bellen en de interface van het luchtoppervlak vermijdt. Sluit weefsel in in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en bewaar op -80 °C.
  4. Snijd secties 10 μm dik met behulp van een cryostat bij -27 °C.
    OPMERKING: Een kameel haarborstel is handig om te helpen begeleiden de opkomende sectie over het mes.
  5. Breng de sectie naar een microscoopdia door de dia aan te raken in het weefsel binnen 1 min van het snijden om te voorkomen dat het weefsel invriesdroogt. Bewaar de dia's op -80 °C.

3. Hematoxylin en eosine (H&E) kleuring

  1. Lucht droge secties gedurende enkele minuten om vocht te verwijderen.
  2. Vlek met gefilterde 0,1% Mayers hematoxylin gedurende 10 min in een 50 mL buis.
  3. Spoel in een Coplin pot in koel lopende ddH2O gedurende 5 min en dompel in 0,5% eosine 10x.
  4. Dip in ddH2O totdat de eosine stopt strepen en duik dan in 50% (10x) evenals 70% (10x) EtOH.
  5. Equilibrate in 95% EtOH (30 s) en 100% EtOH (60 s) alvorens in xyleen meerdere keren te dompelen.
  6. Monteer en bedek het monster ten slotte voordat u foto's maakt met een lichtmicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure behandelden we ogen met een Nd:YAG-laser, waarbij we verschillende puls-energieën (1,0−4,6 mJ) en posities van brandpunten (afstand tot het achterste oppervlak van het hoornvlies: 0,0−0,2 mm) evalueerden om de optimale parameters te vinden. Meerdere replica's (n = 3) werden geëvalueerd voor elke constellatie van de laserparameters (12 x 21).

In aanvulling op de bovengenoemde protocol, monster werd geanalyseerd met een twee-foton microscoop voor f...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De resultaten van deze pilot studie geven aan dat een Nd:YAG laser kan worden gebruikt om selectief ablate hoornvlies endotheel cellen wanneer de juiste parameters voor energie dosis en focus punt positie worden gekozen.

Aangezien de endotheliale functie belangrijk is voor de transparantie van het hoornvlies en het beschermen van het hoornvlies tegen stronaal oedeem, spelen modellen van endotheeldisfunctie een belangrijke rol bij de ontwikkeling van anti-oedematousgeneesmiddelen of chirurgisch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Christine Örün en Jan A. M. Sochurek voor hun hulp bij experimentele methoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BARRON VACUUM TREPHINEKatenaK20-2058
CryostatLeicaCM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucosePAAE-15009
Eye holderZelfN/A
Inverted MicroscopeLeicaDMI 6000 B
KH2PO4Merck529568
Na2HPO4Merck1065860500
Nd:YAG laserZeiss MeditecvisuLAS YAG II plus
OCT Tissue TekSakura Finetechnical4583
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco10010056
Porcine serumSigma-Aldrich12736C
Spectral-domain optical coherence tomographHeidelberg EngineeringSpectralis
Tissue culture plate 12-wellSarstedt833921
Two-Photon MicroscopeJenLabDermaInspect
ViscoelasticOmniVisionMethocel

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
  3. Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
  4. Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
  5. He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047(2016).
  6. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  7. Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
  8. Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
  9. Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
  10. Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
  11. Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
  12. Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
  13. Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
  14. Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
  15. Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
  16. Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
  17. Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
  18. Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).
  19. Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
  20. Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
  21. McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
  22. Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nd YAG laserablatieniet invasieve intraoculaire chirurgievarkensoogmodeltweefotonmicroscopiehistologische analyseselectieve celablatieoptimalisatie van laserparametersweefselfixatieprotocolcryostaatsnijden

Gerelateerde artikelen