Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie

8.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60550

⸱

7 december 2019

 , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2The Medical Research Council Cancer Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge, 3Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om twee verschillende celtypen te fuseren om hybride cellen te maken. Fluorescentiemicroscopie analyse van gesmolten cellen wordt gebruikt om de cel van oorsprong van cellulaire organellen te volgen. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe cellulaire structuur en functie reageren op perturbatie door celfusie.

Samenvatting

Het leven is ruimtelijk gepartitioneerd binnen lipide membranen om de geïsoleerde vorming van verschillende moleculaire toestanden binnen cellen en organellen mogelijk te maken. Celfusie is de fusie van twee of meer cellen om een enkele cel te vormen. Hier bieden we een protocol voor celfusie van twee verschillende celtypen. Gesmolten hybride cellen worden verrijkt door flow cytometrie-gebaseerde sortering, gevolgd door fluorescentiemicroscopie van hybride celstructuur en-functie. Fluorescerend gelabelde eiwitten gegenereerd door genoom bewerking worden in gesmolten cellen afgebeeld, waardoor cellulaire structuren kunnen worden geïdentificeerd op basis van fluorescentie emissie en waarnaar wordt verwezen terug naar het celtype van oorsprong. Deze robuuste en algemene methode kan worden toegepast op verschillende celtypen of organellen van belang, om de cellulaire structuur en functie over een scala van fundamentele biologische vragen te begrijpen.

Inleiding

Homeostatisch onderhoud van cellulaire structuur is essentieel voor het leven. Cellen hebben karakteristieke morfologieën, sub-cellulaire organel getallen, en interne biochemische samenstelling. Inzicht in hoe deze fundamentele eigenschappen worden gegenereerd en hoe ze gaan mis tijdens de ziekte vereist laboratorium gereedschap om hen te perturb.

Celfusie is het samenvoegen van twee of meer afzonderlijke cellen. Celfusie kan cruciaal zijn geweest voor de opkomst van eukaryotische leven1. In het menselijk lichaam is celfusie relatief zeldzaam, die optreedt tijdens beperkte ontwikkelingsomstandigheden en weefsel typen, zoals tijdens de bevruchting of de vorming van spieren, botten en de placenta2. Dit protocol beschrijft de inductie van celcelfusie in weefselkweek cellijnen met differentieel fluorescently gelabelde organellen, als een instrument om de mechanismen te begrijpen die de celstructuur en-functie beheersen.

In vitro geïnduceerde celcelfusie staat centraal in de productie van monoklonale antilichamen3, een belangrijk hulpmiddel voor biologisch onderzoek en ziekte behandeling. Cell Fusion is ook gebruikt om te vragen veel verschillende fundamentele cel biologische vragen over celcyclus dominantie4, aneuploïdie5,6, cellulaire herprogrammering7,8, de reparatie van beschadigde neuronen9, virale proliferatie10, apoptosis11, tumorvorming12, cytoskelet Dynamics13, en membraan fusie14,15. Laboratorium gebaseerde methoden voor het opwekken van celcelfusie16,17,18,19 induceren lipide membraan coalescentie door de fysieke samenvoeging van twee bilayers in één. Celfusie kan worden geïnduceerd door elektriciteit18, virale gebaseerdemethoden 17, thermsmonic verwarming20, transgen expressie19, en chemicaliën met inbegrip van polyethyleenglycol (PEG)16,21,22.

Centrosomes zijn microtubulus organiserende centra die cellulaire vorm, beweeglijkheid, polarisatie en divisie23beheersen. Centrosomale wortels zijn vezelachtige structuren die zich uitstrekken van nucleotiderende met het eiwit rootletin24 (gecodeerd door het gen crocc). We hebben onlangs gebruikt cel-cel fusie om te begrijpen hoe centrosoom positie en het aantal varieert binnen heterokaryons ten opzichte van ouderlijke cellen24. De beweegreden achter het gebruik van deze methode is om de cel van oorsprong van wortels binnen een heterokaryon te volgen na fusie van differentieel fluorescendig gelabelde ouderlijke cellen, en dus voorbeeld organel fusie en splijting. De fluorescently gelabelde eiwitten rootletin-meGFP of rootletin-mScarlet-ik zijn gemaakt door genoom Editing in afzonderlijke cellijnen die vervolgens worden gesmolten door PEG-gemedieerde celfusie. We beschrijven het gebruik van celkleurstoffen (tabel met materialen) om gesmolten cellen te identificeren door Flowcytometrie en daaropvolgende fluorescentiemicroscopie-identificatie van centroeen cel van oorsprong en morfologie (Figuur 1). Deze aanpak is een robuuste en unieke methode om te bestuderen hoe belangrijke veranderingen in cellulaire toestand, met inbegrip van organel nummer afbreuk aan op cel homeostase.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. differentiële fluorescerende Celetikettering

  1. Gentagging met CRISPR Cas9
    1. Gebruik CRISPR Cas9 genoom Editing te labelen rootletin (of andere genen van belang) met de fluorescerende eiwitten meGFP of mScarlet-I in menselijke kanker cellijnen.
      Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor genoom bewerking worden elders behandeld24,25,26.
  2. Fluorescerende kleurstof etikettering
    1. Groeien Cal51 menselijke kankercellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), L-glutamine, en 100 μg/mL penicillaire/streptomycine bij 37 °C en 5% CO2 in een bevoficeerde incubator.
      Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat cellen regelmatig worden gecontroleerd op de afwezigheid van mycoplasma besmetting, en voor de identiteit van de cellijn. Gebruik geen cellen die op grote schaal zijn doorgangen in de cultuur (> 15 passages). Cellen moeten gezond zijn en exponentieel groeien. Vermijd onderconfluentie of overconfluentie.
    2. Zaai elk celtype (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I en niet-gecodeerde Cal51 cellen van de ouders), zodat ~ 6 x 106 cellen de volgende dag voor elk monster aanwezig zijn, met een confluentie van 70 − 90%.
      Opmerking: Dit is ongeveer één T75 weefselkweek kolf of 1 10 cm schaal per celtype. De niet-gelabelde cellen van ouderlijk toezicht zijn vereist als negatieve controle verderop in het protocol. Dit protocol maakt de productie van ~ 20.000 gesmolten cellen mogelijk, maar dit aantal kan worden verhoogd door het uitbreiden van het protocol met een verhoogd aantal batches.
    3. De volgende dag, prewarme DMEM, trypsine en 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door ze in een waterbad van 37 °C te plaatsen.
    4. Was rootletin-meGFP en rootletin-mScarlet-I cellen 2x in PBS door het gieten of aspireren off medium en vervangen door 10 mL PBS.
    5. Label Cal51 rootletin-meGFP cellen door toevoeging van 500 nM Violet Cell Dye (tabel van de materialen) in PBS gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT).
    6. Label Cal51 rootletin-mScarlet-I cellen door toevoeging van 200 nM Far Red Cell Dye (tabel van de materialen) in PBS gedurende 1 minuut bij RT.
      Opmerking: Houd voorbeelden afgeschermd van licht, waar mogelijk na fluorescerende kleuring, om foto bleken van fluorescentie te voorkomen.
    7. Stop de kleurstof etiketteringreacties door 10 mL DMEM gedurende 5 minuten toe te voegen.
    8. Verwijder niet-gelabelde ouderlijke Cal51 cellen uit de incubator (vanaf stap 1.2.2).
      Opmerking: Deze cellen zullen later worden gebruikt als niet-gelabelde negatieve besturingselementen (stap 3.3.2).
    9. Was alle cellen één keer door groeimedium te gieten en te vervangen door 10 mL PBS.
    10. Giet PBS af en inbroed gedurende 5 minuten bij kweek condities met 1 mL voorverwarmde 1x trypsine.
    11. Breng cellen over naar een plastic conische buis van 15 mL en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 5 minuten.
    12. Verwijder en gooi trypsine voorzichtig uit de celpellet met een pipet.
    13. Breng de Violet en Far Red gelabelde celpellets voorzichtig in 1 mL PBS.
    14. Breng de ouder (niet-fluorescerende) celpellet voorzichtig in 1 mL DMEM aan en keer terug naar de incubator.
      Opmerking: Dit voorbeeld zal geen celcelfusie ondergaan, maar zal later worden gebruikt tijdens de Flowcytometrie.

2. Celcelfusie

  1. Meng 3 x 106 Violet gelabelde cellen met 3 x 106 ver rood gelabelde cellen in een buis van 15 ml door zachtjes met een pipet van 1 ml samen 0,5 ml van elk celtype te pipetteren.
  2. Centrifugeer de overgebleven niet-gemengde cellen van stap 2,1 bij 1.000 x g gedurende 5 minuten, giet vervolgens PBS af, hervat de pellet in 1 ml DMEM en keer terug naar de incubator.
    Opmerking: Deze overgebleven niet-gemengde enkelvoudige gelabelde monsters zullen later worden gebruikt als negatieve en compensatie controles in sectie 3 van het protocol.
  3. Centrifugeer de gemengde cellen van stap 2,1 bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en zuig voorzichtig PBS op met een pipet van 1 ml.
  4. Voeg 0,7 ml 50% 1450 Peg-oplossing op druppelsgewijs wijze toe aan de celpellet (stap 2,3) met behulp van een pipet van 1 ml over een periode van 30 sec.
  5. Laat 3,5 min bij RT.
    Opmerking: Incubatietijd met PEG kan worden geoptimaliseerd afhankelijk van het celtype, hoewel merk op dat langere incubatietijd de celtoxiciteit verhoogt.
  6. Voeg 10 ml serum vrije DMEM druppelsgewijs toe voor 30 sec. en laat 10 minuten in de incubator staan.
  7. Spin naar beneden bij 1.000 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en regeer voorzichtig in 1 ml volledig medium (DMEM met FBS).
    Opmerking: Ga rechtstreeks naar sectie 3. Er is toxiciteit in verband met PEG blootstelling gevolgd door flow cytometrie en beeldvorming, dus houd cellen in cultuuromstandigheden zo veel mogelijk door snel te gaan tussen de stappen.

3. fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om gesmolten cellen te verrijken

  1. Maak alle cellen klaar voor Flowcytometrie door elk monster voorzichtig afzonderlijk te pipetteren via een 70 μm filter in een FACS buis.
    Opmerking: Er zijn vier monsters nodig: gesmolten cellen, enkel gelabelde Far Red-cellen, enkelvoudig gelabelde Violette cellen, niet-gelabelde ouderlijke cellen. Eenmaal verwijderd uit de steriele weefselcultuur Hood, cellen hebben de capaciteit om besmet te raken, dus Minimaliseer de blootstellingsduur van monsters naar een niet-steriele omgeving vanaf hier. Cellen worden gesorteerd in volledig DMEM-medium.
  2. Gebruik een cytometer die geschikt is voor het sorteren van één cel.
    1. Stel de celsorteerder in voor een aseptische sortering. Voer de kwaliteitscontrole van het instrument uit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Teken een plot van forward Scatter versus side Scatter en een Doublet discriminatie plot.
  3. Creëer poorten om gesmolten cellen te identificeren.
    1. Prikkelen de fluorescerende kleurstoffen bij golflengten van 405 nm en 635 nm. Detecteren op 450 nm en 660 nm (respectievelijk Violet en verre rode golflengten). Plot Far Red versus Violet golflengten.
    2. Voer ongegelabelde ouderlijke cellen uit via de cytometer en noteer de intensiteit van de fluorescentie.
      Opmerking: Waarden boven deze basislijn definiëren positiviteit voor kleurstof kleuring.
    3. Voer enkele gelabelde Violette cellen uit via de cytometer. Bevestig dat Violet niet in het verre rode kanaal is gemorst.
    4. Voer enkele gelabelde Far Red-cellen uit via de cytometer en bevestig dat er geen morsen van ver rood in het Violet kanaal zit.
      Opmerking: Voor de getoonde representatieve gegevens werden de cellen gesorteerd op 20 psi op een sorteerder uitgerust met een 100 μm nozzle.
    5. Voer kort het fusie monster uit om te bevestigen dat gesmolten cellen zichtbaar zijn met de poorten die in stap 3,3 zijn gemaakt.
  4. Lijn de sorteer stroom centraal uit in een 8-well Imaging Dish.
  5. FACS sorteren gesmolten cellen, presenteren als dubbele positieve Violet en ver rood gelabelde cellen rechtstreeks in een 8-well Imaging Dish met 100 μL groeimedium.
    Opmerking: Het maximaal aanbevolen aantal cellen is ~ 50.000 per 8-well Dish. Zorg voor celstatus tijdens het sorteren. Celconfluentie kan de celstatus beïnvloeden, dus houd cellen tussen 20 − 90% confluentie na sortering door een geschikt aantal cellen voor de beeldvormings schaal te sorteren. Elke gesorteerde druppel bevat ongeveer 3 nL van de mantel vloeistof. Zorg ervoor dat de mantel vloeistof het groeimedium tijdens het sorteren niet significant verdunnen.
  6. Direct na het sorteren, neem de cellen terug naar de incubator en laat > 2 uur of 's nachts.
    Opmerking: Aanhandende cellen zullen geleidelijk aan de dekslip in deze periode, vanaf het sorteren, en dus hun morfologie zal veranderen in de tijd als rechtstreeks naar de Microscoop.

4. immunofluorescentie kleuring en beeldvorming van Celcelfusies

Opmerking: Gesmolten cellen kunnen live of na fixatie en verdere fluorescerende kleuring (of beide) worden afgebeeld, afhankelijk van de vereiste experimenten en metingen.

  1. Live-celbeeldvorming
    1. Vervang het groeimedium door Imaging medium zonder fenolrood (tabel met materialen) en ga direct naar Imaging.
  2. Fixatie en kleuring
    1. Bereid verse 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS.
    2. Repareer cellen door ze in 100 μL van 4% PFA gedurende 15 minuten bij RT te inbroed. Verwijder PFA na 15 min.
      Let op: PFA is giftig bij inademing, dus deze stap moet worden uitgevoerd in een rook afzuigkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
      Opmerking: Na fixatie kan het experiment worden onderbroken en later opnieuw worden gestart, indien nodig. Bewaar het monster bij 4 °C, indien nodig beschermd tegen licht.
    3. Was cellen 3x in 200 μL PBS bij RT.
    4. Permeabilize cellen gedurende 10 min bij RT in 200 μL van 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof (tabel met materialen) en 0,1% nonionisch reinigingsmiddel (tabel metmaterialen), verdund in PBS.
    5. In 200 μL van 3% boviene serumalbumine in PBS gedurende 30 min bij RT.
    6. Inbroed met antilichamen in 150 μL PBS met 3% boviene serumalbumine en 0,1% nonionisch oppervlakteactieve stof en 0,05% nonionisch reinigingsmiddel gedurende 1 uur bij RT.
      Opmerking: De primaire antilichamen die worden gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten zijn fluorescendig geconjugeerd anti-GFP nanobody (gebruikt bij 1:400 verdunning), en fluorescently geconjugeerde anti-mScarlet-I nanobody (gebruikt bij 1:500 verdunning). Deze versterken het signaal van de reeds fluorescerende eiwitten.
    7. Was 2x gedurende 5 minuten in 300 μL PBS en laat vervolgens in 200 μL PBS.
      Opmerking: Voorbeelden worden in PBS afgebeeld. Monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C beschermd tegen licht.
  3. Image Acquisition
    1. Verkrijg afbeeldingen met een geschikte fluorescentiemicroscoop die geschikt is voorbeeld vorming in vier kleuren (bijv. confocale, Widefield, gestructureerde belichting).
    2. Excite meGFP-en mScarlet-I-kanalen met respectievelijk 488 nm en 561 nm-golflengte lasers. Stel detectoren in om op ~ 505 − 550 nm en ~ 590 − 650 nm te detecteren. Excite Violet en Far Red Dye kanalen met 405 nm en 633 nm lasers, respectievelijk. Stel detectoren in op detectie bij ~ 430 − 500 nm en ~ 660 − 750 nm.
    3. Empirisch bepalen de laserintensiteit zodanig dat significante photobleaching niet optreedt en dat cellen gezond blijven (als Live-celbeeldvorming).
    4. Empirisch bepalen Gain zodanig dat signaal wordt verkregen zonder verzagende of kunstmatig knippen pixelwaarden.
    5. Verzamel Z-stack gegevens, zodat afbeeldingen driedimensionaal zijn, met een bereik van 20 − 60 μm met een stapgrootte van ~ 500 μm.
      Opmerking: De afbeeldingen getoond in representatieve gegevens werden verkregen door ofwel confocale(figuur 2B), airyscan (Figuur 2C) of gestructureerde verlichtings microscopie (Figuur 2D). Elke cel is een bonafide heterokaryon als het zowel Violet als veel rode kleurstoffen bevat die elkaar overlappen in het cytoplasma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Correct gelabelde cellen zijn zichtbaar tijdens de stromings cytometrie door een fluorescentie signaal dat hoger is dan de niet-gelabelde controle cellen (Figuur 2A). Gates zijn ingesteld voor het sorteren van dubbele positieve cellen, die deze populatie rechtstreeks verrijken in beeldvormings gerechten voor verdere microscopische analyses. Gesmolten cellen zijn detecteerbaar als verschillende dubbele fluorescentienpositieve cellen en vormen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We demonstreren een faciele en kosteneffectieve protocol voor het fusing cellen en visualiseren van de daaropvolgende architectuur van celhybriden met microscopie, het nemen van ongeveer twee dagen van start tot finish. Kritieke delen van dit protocol zijn de verrijking van gesmolten cellen door celsortering (protocol sectie 3), en zorgvuldige validatie van gesmolten cellen door microscopie (protocol sectie 4). Deze secties zorgen ervoor dat gesmolten cellen gemakkelijk worden verkregen en bonafide heterokaryonen zijn. C...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship naar R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant Number 100090/12/Z). De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript. We danken Ashok Venkitaraman en Paul French voor kritisch advies en begeleiding bij het project. We danken Chiara Cossetti en Gabriela Grondys-Kotarba in het Cambridge Institute for Medical Research flow Cytometry faciliteit voor uitstekende ondersteuning. We danken Liam Cassiday, Thomas Miller, en Gianmarco Contino voor het naleden van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL tubeSarstedt62554502
37% formaldehyde solutionSigma-AldrichF8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan MicroscopeCarl Zeiss
8-well imaging dishesIbidi80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobodyChromotekgba-488
BD Influx Cell SorterBD Biosciences
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906
Cell Filters (70 μm)BiofilCSS010070
CellTrace Far RedThermoFisher ScientificC34572
CellTrace VioletThermoFisher ScientificC34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvateThermoFisher Scientific31966021
Fetal Bovine SerumSigma-Aldrich10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobodyNanoTag BiotechnologiesN1302-At565
L15 CO2 independent imaging mediumSigma-Aldrich21083027
Penicillin/streptomycinSigma-Aldrich15140122
Phenol red free DMEM, high glucoseThermoFisher Scientific21063029
Phosphate buffered saline (1x PBS)8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O tot 1 L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450Sigma-AldrichP7181
Polypropylene tubesBD Falcon352063
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151nonionogene oppervlakteactieve stof
TrypsinSigma-AldrichT4049
Tween 20Fisher BioReagentsBP337nonionogene detergent

Referenties

  1. Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
  2. Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
  5. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
  6. Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
  7. Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
  8. Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
  9. Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
  10. Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
  11. Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
  12. Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
  13. Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
  14. Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
  15. Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
  16. Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
  17. Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
  18. Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
  19. Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
  20. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211(2016).
  21. Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
  22. Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
  23. Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
  24. Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998(2018).
  25. Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
  26. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  27. Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
  28. Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
  29. Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61(2018).
  30. Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
  31. Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
  32. Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
  33. Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

FlowcytometriefluorescentiemicroscopiegenoommodificatieorganelhomeostaseheterokaryonvormingPEG gemedieerde fusiefluorescent eiwitmarkeringcel sorteringcentrosoomduplicatie
Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.