Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60558

⸱

10 maart 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Department of Biology, Stanford University

In dit artikel

Samenvatting

In vitro modellen van coronaire angiogenese kan worden gebruikt voor de ontdekking van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese. In vitro explantculturen van sinusvenosus- en endocardiumweefsels laten een robuuste groei zien in reactie op VEGF-A en vertonen een vergelijkbaar patroon van COUP-TFII-expressie als in vivo.

Samenvatting

Hier beschrijven we een in vitro cultuurtest om coronaire angiogenese te bestuderen. Coronaire bloedvaten voeden de hartspier en zijn van klinisch belang. Defecten in deze bloedvaten vertegenwoordigen ernstige gezondheidsrisico's, zoals bij atherosclerose, wat kan leiden tot hartinfarcten en hartafwijkingen bij patiënten. Bijgevolg, coronaire hartziekte is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Ondanks het klinische belang, relatief weinig vooruitgang is geboekt op het gebied van het regenereren van beschadigde kransslagaders. Niettemin is er recente vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de cellulaire oorsprong en differentiatietrajecten van coronaire vaatontwikkeling. De komst van tools en technologieën die onderzoekers in staat stellen om fluorescerende label voorlopercellen, volgen hun lot, en visualiseren progenies in vivo zijn instrumenteel in het begrijpen van coronaire schip ontwikkeling. In vivo studies zijn waardevol, maar hebben beperkingen in termen van snelheid, toegankelijkheid en flexibiliteit in experimenteel ontwerp. Als alternatief kunnen nauwkeurige in vitro modellen van coronaire angiogenese deze beperkingen omzeilen en onderzoekers in staat stellen om belangrijke biologische vragen snel en flexibel te ondervragen. Het ontbreken van geschikte in vitro modelsystemen kan de vooruitgang in het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire vaatgroei hebben belemmerd. Hier beschrijven we een in vitro cultuursysteem om kransslagaders te laten groeien uit de sinusvenosus (SV) en endocardium (Endo), de twee voorloperweefsels waaruit veel van de kransslagaders voortkomen. We hebben ook bevestigd dat de culturen nauwkeurig een aantal van de bekende in vivo mechanismen samenvatten. Zo tonen we aan dat de angiogene spruiten in de cultuur van SV downregulate COUP-TFII expressie vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in vivo. Daarnaast tonen we aan dat VEGF-A, een bekende angiogene factor in vivo, angiogenese van zowel de SV- als Endo-culturen robuust stimuleert. Gezamenlijk hebben we een nauwkeurig in vitro cultuurmodel bedacht om coronaire angiogenese te bestuderen.

Inleiding

Bloedvaten van het hart worden vaak coronaire bloedvaten genoemd. Deze vaten bestaan uit slagaders, aders en haarvaten. Tijdens de ontwikkeling worden eerst sterk vertakte haarvaten aangelegd, die vervolgens worden verbouwd tot kransslagaders en aders1,2,3,4,5. Deze eerste haarvaten zijn opgebouwd uit endotheelvoorlopercellen gevonden in het proepicardium, sinus venosus (SV) en endocardium (Endo) weefsels1,6,7,8. SV is het instroomorgaan van het embryonale hart en Endo is de binnenvoering van het hartlumen. Endotheel voorlopercellen gevonden in de SV en Endo bouwen de meerderheid van de coronaire vasculatuur, terwijl het proepicardium bijdraagt aan een relatief klein deel van het2. Het proces waarbij het capillaire netwerk van kransslagaders in het hart uit zijn reeds bestaande voorlopercellen groeit, wordt coronaire angiogenese genoemd. Coronaire hartziekte is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd en toch ontbreekt een effectieve behandeling voor deze ziekte. Inzicht in de gedetailleerde cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese kan nuttig zijn bij het ontwerpen van nieuwe en effectieve therapieën te herstellen en te regenereren beschadigde kransslagaders.

Onlangs is een toename in ons begrip van hoe coronaire schepen ontwikkelen gedeeltelijk is bereikt door de ontwikkeling van nieuwe instrumenten en technologieën. Met name in vivo zijn de etikettering seinage-etikettering en geavanceerde beeldvormingstechnologieën zeer nuttig geweest bij het blootleggen van de cellulaire oorsprong s- en differentiatietrajecten van kransslagaders9,10,11,12. Ondanks de voordelen van deze in vivo tools, zijn er beperkingen op het gebied van snelheid, flexibiliteit en toegankelijkheid. Daarom kunnen robuuste in vitro modelsystemen in vivo systemen aanvullen om de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese op een hoge doorvoermanier op te helderen.

Hier beschrijven we een in vitro model van coronaire angiogenese. We hebben een in vitro explant kweeksysteem ontwikkeld om kransslagaders te kweken uit twee voorloperweefsels, SV en Endo. Met dit model laten we zien dat de in vitro weefselexplantculturen coronaire vaatspruiten kweken wanneer ze worden gestimuleerd door groeimedium. Bovendien groeien de explantculturen snel in vergelijking met controle wanneer ze worden gestimuleerd door vasculaire endotheelgroeifactor A (VEGF-A), een zeer krachtig angiogeen eiwit. Verder vonden we dat de angiogene spruiten uit de SV-cultuur veneuze dedifferentiatie ondergaan (verlies van COUP-TFII-expressie), een mechanisme vergelijkbaar met SV angiogenese in vivo1. Deze gegevens suggereren dat het in vitro explantcultuursysteem angiogene gebeurtenissen die in vivo voorkomen getrouw herstelt. Collectief, in vitro modellen van angiogenese die hier worden beschreven zijn ideaal voor het indringende cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese in een hoge doorvoer en toegankelijke manier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik van alle dieren in dit protocol volgde Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) richtlijnen.

1. Oprichting van muisfokkers en het detecteren van vaginale pluggen voor getimede zwangerschappen

  1. Het opzetten van een muis kweekkooi met wilde type mannelijke en vrouwelijke muizen. Zorg ervoor dat de leeftijd van de broedmuizen tussen 6-8 weken ligt. Stel een paar (1 man en 1 vrouwtje) of als trio (1 mannetje en 2 vrouwtje) op voor de fokkerij.
  2. Controleer op een vaginale plug de volgende ochtend. Gebruik een schuine metalen sonde om een diepe plug te detecteren door het in de vaginale opening te plaatsen. Wijs de ochtend van een positieve vaginale plug aan als embryonale dag 0,5 (e0,5).
    OPMERKING: Een vaginale plug kan oppervlakkig zijn (wat gemakkelijk zichtbaar is, zie figuur 1) of diep (die niet gemakkelijk zichtbaar is). Aanwezigheid van een diepe stekker zal blokkeren volledige invoeging van de sonde, terwijl de afwezigheid van een stekker zal volledige invoeging zonder weerstand mogelijk te maken.
  3. Houd de getimede zwangerschap in stand totdat de embryo's e11,5 bereiken waarop ze zullen worden geoogst. Om de zwangerschap te bevestigen voordat u embryo's oogst, registreert u het gewicht van vrouwelijke muizen tussen e7,5 en e11.5.
    OPMERKING: Dagelijkse toename van het gewicht van de moeder zal wijzen op een succesvolle zwangerschap, terwijl geen verandering in gewicht zal wijzen op een mislukte zwangerschap.

2. Embryo's oogsten van zwangere muizen

LET OP: Zorg er voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: een CO 2-euthanasiekamer, 70% ethanol, papieren handdoeken, regelmatige tangen, fijne tangen, scharen, 1x steriele fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS), 10 cm steriele petrischaaltjes, container met ijs, geperforeerde lepel, dissectiestereomicroscoop.

  1. Plaats een e11.5 zwangere muis in een schone CO2 euthanasiekamer om het op te offeren. Sluit het deksel van de kamer om te voorkomen dat de muis ontsnapt.
  2. Nadat de muis in de euthanasiekamer is vastgezet, schakelt u CO2in. Zorg ervoor dat u de stroomsnelheid van CO2 per AANBEVELINGen van het GBCB regelt (d.w.z. 10-30% verplaatsing per minuut). Nadat de muis volledig is geëuthanaseerd, uit te voeren cervicale dislocatie om de dood te garanderen.
  3. Spray de muis met 70% ethanol. Til de huid over de buik met behulp van tangen, maak een kleine incisie met behulp van een schaar en strek de incisie zijwaarts. Vergroot de incisie anteriorly tot aan het middenrif en stel de baarmoederhoorn bloot die de embryo's bevat (figuur 2).
  4. Trek de snaar van embryo's (baarmoederhoorn + embryo's) eruit door de baarmoeder te grijpen en vrij te snijden. Plaats de reeks embryo's in ijskoude steriele 1x PBS.
  5. Ontleed de individuele embryo's uit de baarmoederhoorn door de baarmoederspier, dooierzak en amnion één voor één (figuur 3A-F)onder een stereomicroscoop af te pellen. Breng de gereinigde embryo's met behulp van een geperforeerde lepel naar een petrischaaltje met steriele 1x PBS op ijs. Zorg ervoor dat de embryo's koud te houden.

3. Het isoleren van harten uit e11.5 Embryo's

LET OP: Zorg er voor het begin voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: gewone tangen, fijne tangen, 1x steriele PBS, 10 cm steriele petrischaal, 6 cm steriele petrischaal, container met ijs, geperforeerde lepel, dissectiestereomicroscoop.

  1. Zet een nieuwe petrischaal met ijskoude steriele 1x PBS onder een stereomicroscoop. Breng een embryo van stap 2,5 in de petrischaal om het hart te ontleden.
  2. Verwijder het hoofd van het embryo met behulp van tangen. Knijp eerst het hoofd met één hand tussen de tangen en verwijder het hoofd door het met de andere hand weg te schrapen met behulp van gesloten tangen(figuur 4A-C).
  3. Na het verwijderen van het hoofd, oriënteer het embryo met zijn ventrale kant omhoog door het embryo met tangen op zijn buik met één hand te houden (Figuur 4D).
  4. Met de andere hand, open de borstwand van het embryo door eerst het maken van een kleine incisie in de borst iets boven het middenrif met behulp van fijne tangen. Vergroot vervolgens de incisie zeer zorgvuldig door gesloten tangen in te voegen en de borstwand te scheuren door de tangen te openen. Zorg ervoor dat u niet te diep stuwkracht, die het hart kan beschadigen. Met behulp van de tangen, houd de borstwand wijd open om het hart en de longen bloot in de borstholte(figuur 4E).
  5. Met behulp van fijne tangen, voorzichtig bewegen het hart anteriorly (90°) en bloot de rugaorta / ader. Trek het hart/de longen naar voren door de dorsale aorta/ader aan de basis van het hart vast te leggen(figuur 4F-H).
    LET OP: Wees voorzichtig tijdens het trekken van het hart / longen om te voorkomen dat scheuren van de SV, die zich bevindt aan de dorsale kant van het hart.
  6. Spoel het hart/de longen af met koude 1x PBS om bloedcellen te verwijderen.
  7. Herhaal stap 3.1-3.6 om het hart/de longen uit de resterende embryo's te verwijderen. Zorg ervoor dat u het geïsoleerde hart / longen op ijs te houden.

4. SVs en Ventrikels isoleren van e11.5 Embryonale muisharten

  1. Plaats de petrischaal met hart/longen van stap 3.7 onder een stereomicroscoop om de SVs en hele ventrikels te isoleren. Pel de bijgevoegde lobben van de longen een-voor-een van hun wortel met behulp van fijne tangen.
  2. Oriënteer het hart aan de rugzijde en verwijder atria en het aangrenzende weefsel dat de SV anteriorly omringt zonder de SV te scheuren. Verwijder de linker- en rechteratria uit het hart door aan de basis vast te houden en af te schrapen met behulp van fijne tangen(figuur 5B). Verwijder het aangrenzende weefsel rond de SV met behulp van een soortgelijke techniek(figuur 5C).
    LET OP: Houd er rekening mee dat het rechter atrium aan de SV is bevestigd, dus wees voorzichtig om alleen het atrium te verwijderen.
  3. Om de SV te isoleren, oriënteer je eerst het hart met zijn rugzijde naar boven gericht (omdat de SV aan de rugzijde zit) en houd het hart nog steeds in deze positie door het hart voorzichtig met kracht vast te houden.
    OPMERKING: De SV is een instroomorgaan van een embryonaal hart dat tussen de atria aan de rugzijde van het hart ligt.
  4. Verwijder de SV door het zorgvuldig af te pellen van het hart waar het is bevestigd of door de SV aan de basis van zijn gehechtheid vast te houden met fijne tangen en het af te schrapen met gesloten tangen(figuur 5D,E).
  5. Breng de geïsoleerde SV over in een nieuwe petrischaal van 6 cm met ijskoude steriele 1x PBS op ijs met behulp van een steriele transferpipet en label de petrischaal als SV.
  6. Om de hele ventrikels te isoleren, verwijdert u het uitstroomkanaal (aorta en longstam) uit het hart nadat de SV is verwijderd(figuur 5F,G).
  7. Breng de hele ventrikels in een nieuwe 6 cm petrischaal met steriele 1x PBS op ijs met behulp van een steriele overdracht pipet en label de Petri schotel als ventrikels. Houd de geïsoleerde SV en ventrikels op ijs.
  8. Herhaal stap 4.1-4.7 om SVs en ventrikels te isoleren van de resterende harten.

5. Het opzetten van weefselkweekplaten met wisselplaten en extracellulaire matrixcoating

LET OP: Zorg er voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: commerciële extracellulaire matrixoplossing (ECM; bijvoorbeeld Matrigel), 8,0 μM polyethyleentereftalaat (PET) kweekinserts, 24 putplaten, 37 °C, 5% CO2 incubator.

  1. Laat de ECM-oplossing ontdooien op ijs. Houd de ECM-oplossing op ijs om verharding te voorkomen.
  2. Plaats de PET membraankweekinserts (poriegrootte = 8,0 μm, filtratiegebied = 0,3 cm2,filterdiameter = 6,5 mm) in de putten van niet-weefselkweek behandeld 24 putplaten. Label de platen als SV of ventrikels voor respectievelijk de SV of de endocardiale angiogenesetesten.
    OPMERKING: Zet de inzetstukken in aparte platen voor de SV en de ventrikels bij het gelijktijdig uitvoeren van beide culturen. Zorg ervoor dat u voldoende putten instelt voor alle experimentele monsters en controles.
  3. Nadat de ECM-oplossing ontdooid is, moet u ecm 1:2 onmiddellijk verdunnen in voorgekoeld basaal medium (d.w.z. EBM-2 basale medium, zie Materiaaltabel)tot een voldoende volume (100 μL/insert x aantal wisselplaten).
    OPMERKING: Als er bijvoorbeeld zes wisselplaten zijn, dan is het totale volume 100 μL x 6 = 600 μL. Voeg 200 μL ECM toe aan 400 μL basale medium.
  4. Bestrijk de wisselplaten met 100 μL vers verdunde ECM door deze direct bovenop het membraan toe te voegen. Bebroed de plaat minstens 30 m in bij 37 °C om de ECM te laten stollen.
    OPMERKING: Dit moet worden uitgevoerd onder een laminaire stroomweefsel kweekkap om besmetting te voorkomen.

6. SVs en hele ventricles culturen

OPMERKING: Zorg er voor het begin voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: 70% ethanol, overdrachtspipet, stereomicroscoop, tangen, laminaire stroomweefselkweekkap, microvasculaire endotheelcelsupplementkit(Tabel met materialen), basale medium, 1xste PBS). Figuur 6 toont de workflow van sv- en ventrikelcultuur.

  1. Ontdooi de inhoud van de supplementkit op ijs. Bereid het volledige medium door het toevoegen van alle inhoud van het supplement kit in 500 mL van basale medium onder een gecertificeerde laminaire stroomweefsel kweekkap. Meng het medium goed en verdeel in 50 mL aliquots.
  2. Steriliseer de basis van de stereomicroscoop en het omliggende werkgebied met 70% ethanol.
  3. Verkrijg de weefselkweekplaten uit stap 5.4. Breng met behulp van een transferpipet de explants voorzichtig over van stap 4.7 bovenop het wisselplaatmembraan. Onder een stereomicroscoop en met behulp van schone tangen, plaats de explants in het midden van de inserts om ervoor te zorgen dat ze niet vast zitten in de hoek van de wisselplaten of bevestigd aan de zijwanden.
  4. Nadat de explants op de wisselplaten zijn geplaatst en gecentreerd, verwijder voorzichtig eventuele extra PBS uit de wisselplaten en sluit u de deksels van de platen.
  5. Voeg onder een laminaire stroomweefselkweekkap 100 μL van het voorverwarmde volledige medium bovenop de wisselplaten toe en 200 μL in de putten om de explants op de lucht-vloeibare interface zodanig te kweken dat het basale oppervlak van de insert in contact komt met het medium , maar het bovenste oppervlak wordt blootgesteld aan de lucht.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het volume aanpast om een lucht-vloeibare interface te verkrijgen als u inserts/putplaten van verschillende grootte gebruikt.
  6. Voeg 300 μL PBS toe aan de ongebruikte putten van de 24 putplaten en dek af met het deksel. Incubeer de plaat in een 37 °C, 5% CO2 incubator en kweek de culturen gedurende 5 dagen.
  7. In de volgende dagen, routinematig observeren van de culturen onder een omgekeerde lichtmicroscoop om de status van de explant culturen te beoordelen. Zorg ervoor dat de explants contractile slaan vertonen en dat alle explants zijn bevestigd aan de bodem van het membraan ingebed met ECM. Let op alle drijvende explants.
    OPMERKING: De periodieke samentrekking van de explants geeft aan dat ze nog leven. Zwevende explants moeten worden weggelaten uit de analyse.
  8. Na het beoordelen van de cultuurstatus, zet de cultuurplaat terug in de couveuse en blijf de cultuur tot 5 dagen groeien.

7. Behandeling van culturen met VEGF-A (Positieve Controle)

OPMERKING: Zorg er voor het begin voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: laminaire stroomweefselkweekkap, 1x PBS, basale medium + 1% foetaal runderserum (FBS), basale medium + VEGF-A, pipetten en pipettips.

  1. Bereid het basale medium + 1% FBS en het basale medium + VEGF-A voor.
    1. Om het basale medium + 1% FBS voor te bereiden, bepaal eerst het aantal benodigde controleputten. Als er bijvoorbeeld drie controleputten zijn, dan is 300 μL/put x 3 = 900 μL het totale benodigde volume. Voeg 9 μL FBS toe aan 891 μL basaal medium om het basale medium + 1% FBS te maken.
    2. Om het basale medium + VEGF-A voor te bereiden, bepaal eerst het totale aantal putten dat VEGF-A-medium nodig heeft. Als er drie putten zijn, dan is 300 μL/put x 3 = 900 μL het totale volume en 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A. Voeg 150 ng VEGF-A toe aan 900 μL basaal medium om het basale medium + VEGF-A te maken.
      OPMERKING: Monteer deze oplossing op een groter volume dan berekend om een voldoende aantal kleinere aliquots voor elk experiment te verzekeren.
  2. Verwijder op dag 2 de media uit beide kamers (de inzetstukken en de putten). Was culturen met 300 μL 1x PBS door 100 μL toe te voegen aan de wisselplaten en 200 μL in de putten. Draai de platen een paar keer stevig en verwijder de PBS.
  3. Voeg 300 μL basale medium + 1% FBS (100 μL in de insert en 200 μL in de putten) toe om de culturen 24 uur te verhongeren.
  4. Voeg op dag 3, na de honger, 300 μL basaal medium + 1% FBS (100 μL toe aan de wisselplaat en 200 μL in de putten) in de controleputten en basaal medium + VEGF-A (50 ng/well) in de behandelingsputten.
  5. Na de behandeling, blijven groeien de culturen in de incubator.

8. Fixatie en immunovlekken

OPMERKING: Zorg er voor het begin voor dat u over de volgende apparatuur en reagentia beschikt: 4% paraformaldehyde (PFA), 1x PBS, primaire en secundaire antilichamen, een shaker, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof in PBS (PBT).

  1. Verwijder op de zesde dag van het kweken het medium en was culturen met 1x PBS bij kamertemperatuur (RT).
    1. Fix de culturen door 200 μL van 4% PFA-oplossing toe te voegen aan de putten en 100 μL in de wisselplaten. Fix culturen in 4 °C gedurende 20 min tijdens het rocken.
    2. Verwijder NA 20 min fixatie PFA uit de culturen in een rookkap en was de culturen met 1x PBS door 200 μL in de putten en 100 μL in de wisselplaten toe te voegen.
    3. Herhaal wasbeurten 3x, 10 min elk, tijdens het schommelen. Ga dan over tot het uitvoeren van immunostaining.
      OPMERKING: Alle wasstappen worden uitgevoerd op een benchtop bij RT.
  2. Verdun primaire antilichamen (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) in blokkeringsoplossing (5% ezelsserum, 0,5% PBT). Voeg 300 μL primaire antilichaamoplossing (200 μL in de onderste putten en 100 μL toe aan de wisselplaten). Broed culturen in primaire antilichamen 's nachts op 4 °C tijdens het schommelen.
    OPMERKING: Anti-VE-Cadherin wordt gebruikt om het endotheelcelmembraan te etiketteren en anti-ERG 1/2/3 wordt gebruikt om de endotheelcelkern te labelen om de angiogene spruiten van endotheelcellen te visualiseren.
  3. De volgende dag, wassen en rock en rock de cultuur platen 10x in 0,5% PBT, het veranderen van PBT om de 10 min.
  4. Verdun de secundaire antilichamen (ezel anti-rat Alexa Fluor 488 en ezel anti-konijn Alexa Fluor 555) in blokkerenoplossing. Voeg 300 μL van het secundaire antilichaam toe als in stap 8.2 en broed de culturen 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen uit. De volgende dag, was de secundaire antilichamen 10x in PBT, het veranderen van PBT om de 10 min.
    LET OP: Was een minimum van 10x, maar meer wasbeurten zijn beter. Nadat de wasbeurten zijn voltooid, kunnen de culturen worden opgeslagen met 1x PBS totdat ze op dia's zijn gemonteerd.

9. Montage culturen op dia's, beeldvorming en analyse

OPMERKING: Voordat u begint, zorg ervoor dat de volgende apparatuur en reagentia: fijne tangen, dia's, montage medium met 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), coverslips, en confocale microscoop. Na secundaire antilichaamkleuring, monteer de culturen op dia's voor beeldvorming met behulp van de volgende stappen.

  1. Pel het membraan voorzichtig uit de wisselplaat met behulp van fijne tangen en breng het op de glijbanen door het membraan kant naar beneden en het plaatsen van de explant culturen omhoog. Plaats de replicerende monsters in dezelfde dia's en label de dia's als besturingselement of VEGF-A. Voeg een paar druppels montagemedium met DAPI direct op het membraan en bedek de glijbanen met dekselslips.
    LET OP: Zorg ervoor dat luchtbellen te vermijden tijdens het plaatsen van de coverslips.
  2. Sluit de randen van de glijbanen af met heldere nagellak en laat drogen.
    OPMERKING: Dia's kunnen worden opgeslagen in -20 °C voor langdurige opslag.
  3. Beelddia's met behulp van een confocale microscoop.
  4. Voer analyses uit om de lengte van angiogene uitgroei te meten. Kwantificeren angiogene uitgroeilengte door het meten van de afstand van de endotheelcellen (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) uitgebreid vanaf de binnengrens van de ERG 1/2/3+ cellen in de ventrikelculturen en vanuit het centrum van de SV-explants in de SV-culturen.
    1. Download eerst FIJI-software om kwantificering uit te voeren met FIJI/ImageJ.
    2. Afbeeldingsbestanden openen in FIJI: ga naar Bestand | Open | Map | Bestandsnaam | Open.
    3. Ga naar Analyseren | Metingen vaststellen | Selecteer Omtrek.
    4. Selecteer het gereedschap Rechte lijn in het hoofdvenster.
    5. Trek een lijn over de lengte van een spruit zoals voorgesteld in stap 9.4.
    6. Ga naar Analyseren | Meting.
      OPMERKING: Lengtemetingen worden weergegeven in het nieuwe venster.
    7. Kwantificering uitvoeren in afbeeldingen die ten minste drie willekeurig geselecteerde gezichtsvelden vertegenwoordigen. Gemiddelde de kiemlengte metingen en meld ze als gemiddelde ± standaarddeviatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een van de meest opvallende kenmerken van SV angiogenese in vivo is dat het een specifiek traject volgt en celdedifferentiatie en redifferentiatiegebeurtenissen omvat die zich voordoen op stereotiepe tijden en posities1. Als de eerste SV-cellen op de hartkamer groeien, stoppen ze met het produceren van veneuze markers zoals COUP-TFII (Figuur 7). Vervolgens nemen coronaire spruiten twee migratiepaden, hetzij over het oppervlak van het h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Enkele van de meest kritische stappen voor het succesvol kweken van kransslagaders van de SV en Endo voorloperweefsels zijn: 1) Het correct identificeren en isoleren van het SV-weefsel voor sv-cultuur; 2) het gebruik van ventrikels uit embryo's tussen de leeftijden van e11−11.5 voor een nauwkeurige Endo-cultuur; 3) het handhaven van steriele omstandigheden gedurende de gehele dissectieperiode en het te allen tijde koud houden van de weefsels; en 4) het houden van de explants aan het ecm gecoate membraan om te voorkomen d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de leden van het Sharma laboratorium voor het verstrekken van een ondersteunende onderzoeksomgeving. Wij willen graag speciale dank aan Diane (Dee) R. Hoffman die onderhoudt en zorgt voor onze muis kolonie. We willen ook Drs. Philip J. Smaldino en Carolyn Vann bedanken voor het grondig nalezen van het manuscript en het verstrekken van nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door fondsen van Ball State University Provost Office en Department of Biology naar B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondsen aan B.S, en NIH (RO1-HL128503) en The New York Stem Cell Foundation fondsen aan K.R.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 x 20 MM weefselkweekschaaltjeFisher Scientific877222Verwezen naar in het protocol als petrischaaltje
24-well platenFisher Scientific08-772-51
8,0 uM PET membraan kweekinsertsMillipore SigmaMCEP24H48
Alexa Fluor Ezel anti-konijn 555Fisher ScientificA31572Secundaire antilichaam
Alexa Fluor Ezel anti-rat 488Fisher ScientificA21206Secundaire antilichaam
Hoekige metalen sondeFine science tools10088-15Hoekige 45 graden, gebruikt voor het detecteren van diepe pluggen
Anti-ERG 1/2/3 antilichaamAbcamAb92513Primair antilichaam
Anti-VE-Cadherin antilichaamFisher ScientificBDB550548Primair antilichaam, fabrikant BD BioSciences
CO2 gastankVerschillende leveranciersN/A
CO2 IncubatorFisher Scientific13998223Voor 37 °C, 5% CO2 incubatie
Dissectie stereomicroscoopLeicaS9iLeica S9i Stereomicroscoop
EBM-2 basaal mediumLonzaCC-3156Basaal medium voor endotheliale celgroei
ECM oplossingCorning354230Commercieel bekend als Matrigel
EGM-2 MV Singlequots KitLonzaCC-4147Microvasculair endotheelcelsupplement kit; Dit wordt gemengd met de EBM-2 om het EGM-2 complete medium te maken
Fetaal bovien serum (FBS)Fisher ScientificSH3007003IR
FiJiNIHNABeeldverwerkingssoftware (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fijne pincetFine science tools11412-11Gebaten voor embryodissectie
Fisherbrand Rechtbladige operatie schaarFisher Scientific13-808-4
Hyclone Fosfaat Buffered Saline (1X)Fisher ScientificSH-302-5601LR
Laminaire stroom weefselkweekkapFisher Scientificverschillende modellen beschikbaar
Montage MediumVector LaboratoriesH-1200Vectashield met DAPI
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy/Fisher50-980-494Dit is verkrijgbaar bij 32%; moet worden verdund tot 4%
Geperforeerde lepelFine science tools10370-18Bruikbaar bij het verwijderen van embryo/weefsels uit een oplossing
Recombinant Murine VEGF-A 165PeproTech450-32
Standaard pincet, Dumont #5Fine science tools11251-30
Sure-Seal Muis/Rat kamerEasysystemincEZ-1785Euthanasie kamer
```

Referenties

  1. Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  2. Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
  3. Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
  4. Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
  5. Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
  6. Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
  7. Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  8. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
  9. Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
  10. Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
  11. Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
  12. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  13. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
  14. Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
  15. Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
  16. Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
  17. Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
  18. Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
  19. Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
  20. Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Sinus venosusendocardiumVEGF A behandelingconfocale microscopieweefselkweekembryonaal hartprogenitorcellenextracellulaire matrixcelkweek
In Vitro Model of Coronary Angiogenesis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.