Het gebruik van alle dieren in dit protocol volgde Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) richtlijnen.
1. Oprichting van muisfokkers en het detecteren van vaginale pluggen voor getimede zwangerschappen
- Het opzetten van een muis kweekkooi met wilde type mannelijke en vrouwelijke muizen. Zorg ervoor dat de leeftijd van de broedmuizen tussen 6-8 weken ligt. Stel een paar (1 man en 1 vrouwtje) of als trio (1 mannetje en 2 vrouwtje) op voor de fokkerij.
- Controleer op een vaginale plug de volgende ochtend. Gebruik een schuine metalen sonde om een diepe plug te detecteren door het in de vaginale opening te plaatsen. Wijs de ochtend van een positieve vaginale plug aan als embryonale dag 0,5 (e0,5).
OPMERKING: Een vaginale plug kan oppervlakkig zijn (wat gemakkelijk zichtbaar is, zie figuur 1) of diep (die niet gemakkelijk zichtbaar is). Aanwezigheid van een diepe stekker zal blokkeren volledige invoeging van de sonde, terwijl de afwezigheid van een stekker zal volledige invoeging zonder weerstand mogelijk te maken.
- Houd de getimede zwangerschap in stand totdat de embryo's e11,5 bereiken waarop ze zullen worden geoogst. Om de zwangerschap te bevestigen voordat u embryo's oogst, registreert u het gewicht van vrouwelijke muizen tussen e7,5 en e11.5.
OPMERKING: Dagelijkse toename van het gewicht van de moeder zal wijzen op een succesvolle zwangerschap, terwijl geen verandering in gewicht zal wijzen op een mislukte zwangerschap.
2. Embryo's oogsten van zwangere muizen
LET OP: Zorg er voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: een CO 2-euthanasiekamer, 70% ethanol, papieren handdoeken, regelmatige tangen, fijne tangen, scharen, 1x steriele fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS), 10 cm steriele petrischaaltjes, container met ijs, geperforeerde lepel, dissectiestereomicroscoop.
- Plaats een e11.5 zwangere muis in een schone CO2 euthanasiekamer om het op te offeren. Sluit het deksel van de kamer om te voorkomen dat de muis ontsnapt.
- Nadat de muis in de euthanasiekamer is vastgezet, schakelt u CO2in. Zorg ervoor dat u de stroomsnelheid van CO2 per AANBEVELINGen van het GBCB regelt (d.w.z. 10-30% verplaatsing per minuut). Nadat de muis volledig is geëuthanaseerd, uit te voeren cervicale dislocatie om de dood te garanderen.
- Spray de muis met 70% ethanol. Til de huid over de buik met behulp van tangen, maak een kleine incisie met behulp van een schaar en strek de incisie zijwaarts. Vergroot de incisie anteriorly tot aan het middenrif en stel de baarmoederhoorn bloot die de embryo's bevat (figuur 2).
- Trek de snaar van embryo's (baarmoederhoorn + embryo's) eruit door de baarmoeder te grijpen en vrij te snijden. Plaats de reeks embryo's in ijskoude steriele 1x PBS.
- Ontleed de individuele embryo's uit de baarmoederhoorn door de baarmoederspier, dooierzak en amnion één voor één (figuur 3A-F)onder een stereomicroscoop af te pellen. Breng de gereinigde embryo's met behulp van een geperforeerde lepel naar een petrischaaltje met steriele 1x PBS op ijs. Zorg ervoor dat de embryo's koud te houden.
3. Het isoleren van harten uit e11.5 Embryo's
LET OP: Zorg er voor het begin voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: gewone tangen, fijne tangen, 1x steriele PBS, 10 cm steriele petrischaal, 6 cm steriele petrischaal, container met ijs, geperforeerde lepel, dissectiestereomicroscoop.
- Zet een nieuwe petrischaal met ijskoude steriele 1x PBS onder een stereomicroscoop. Breng een embryo van stap 2,5 in de petrischaal om het hart te ontleden.
- Verwijder het hoofd van het embryo met behulp van tangen. Knijp eerst het hoofd met één hand tussen de tangen en verwijder het hoofd door het met de andere hand weg te schrapen met behulp van gesloten tangen(figuur 4A-C).
- Na het verwijderen van het hoofd, oriënteer het embryo met zijn ventrale kant omhoog door het embryo met tangen op zijn buik met één hand te houden (Figuur 4D).
- Met de andere hand, open de borstwand van het embryo door eerst het maken van een kleine incisie in de borst iets boven het middenrif met behulp van fijne tangen. Vergroot vervolgens de incisie zeer zorgvuldig door gesloten tangen in te voegen en de borstwand te scheuren door de tangen te openen. Zorg ervoor dat u niet te diep stuwkracht, die het hart kan beschadigen. Met behulp van de tangen, houd de borstwand wijd open om het hart en de longen bloot in de borstholte(figuur 4E).
- Met behulp van fijne tangen, voorzichtig bewegen het hart anteriorly (90°) en bloot de rugaorta / ader. Trek het hart/de longen naar voren door de dorsale aorta/ader aan de basis van het hart vast te leggen(figuur 4F-H).
LET OP: Wees voorzichtig tijdens het trekken van het hart / longen om te voorkomen dat scheuren van de SV, die zich bevindt aan de dorsale kant van het hart.
- Spoel het hart/de longen af met koude 1x PBS om bloedcellen te verwijderen.
- Herhaal stap 3.1-3.6 om het hart/de longen uit de resterende embryo's te verwijderen. Zorg ervoor dat u het geïsoleerde hart / longen op ijs te houden.
4. SVs en Ventrikels isoleren van e11.5 Embryonale muisharten
- Plaats de petrischaal met hart/longen van stap 3.7 onder een stereomicroscoop om de SVs en hele ventrikels te isoleren. Pel de bijgevoegde lobben van de longen een-voor-een van hun wortel met behulp van fijne tangen.
- Oriënteer het hart aan de rugzijde en verwijder atria en het aangrenzende weefsel dat de SV anteriorly omringt zonder de SV te scheuren. Verwijder de linker- en rechteratria uit het hart door aan de basis vast te houden en af te schrapen met behulp van fijne tangen(figuur 5B). Verwijder het aangrenzende weefsel rond de SV met behulp van een soortgelijke techniek(figuur 5C).
LET OP: Houd er rekening mee dat het rechter atrium aan de SV is bevestigd, dus wees voorzichtig om alleen het atrium te verwijderen.
- Om de SV te isoleren, oriënteer je eerst het hart met zijn rugzijde naar boven gericht (omdat de SV aan de rugzijde zit) en houd het hart nog steeds in deze positie door het hart voorzichtig met kracht vast te houden.
OPMERKING: De SV is een instroomorgaan van een embryonaal hart dat tussen de atria aan de rugzijde van het hart ligt.
- Verwijder de SV door het zorgvuldig af te pellen van het hart waar het is bevestigd of door de SV aan de basis van zijn gehechtheid vast te houden met fijne tangen en het af te schrapen met gesloten tangen(figuur 5D,E).
- Breng de geïsoleerde SV over in een nieuwe petrischaal van 6 cm met ijskoude steriele 1x PBS op ijs met behulp van een steriele transferpipet en label de petrischaal als SV.
- Om de hele ventrikels te isoleren, verwijdert u het uitstroomkanaal (aorta en longstam) uit het hart nadat de SV is verwijderd(figuur 5F,G).
- Breng de hele ventrikels in een nieuwe 6 cm petrischaal met steriele 1x PBS op ijs met behulp van een steriele overdracht pipet en label de Petri schotel als ventrikels. Houd de geïsoleerde SV en ventrikels op ijs.
- Herhaal stap 4.1-4.7 om SVs en ventrikels te isoleren van de resterende harten.
5. Het opzetten van weefselkweekplaten met wisselplaten en extracellulaire matrixcoating
LET OP: Zorg er voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: commerciële extracellulaire matrixoplossing (ECM; bijvoorbeeld Matrigel), 8,0 μM polyethyleentereftalaat (PET) kweekinserts, 24 putplaten, 37 °C, 5% CO2 incubator.
- Laat de ECM-oplossing ontdooien op ijs. Houd de ECM-oplossing op ijs om verharding te voorkomen.
- Plaats de PET membraankweekinserts (poriegrootte = 8,0 μm, filtratiegebied = 0,3 cm2,filterdiameter = 6,5 mm) in de putten van niet-weefselkweek behandeld 24 putplaten. Label de platen als SV of ventrikels voor respectievelijk de SV of de endocardiale angiogenesetesten.
OPMERKING: Zet de inzetstukken in aparte platen voor de SV en de ventrikels bij het gelijktijdig uitvoeren van beide culturen. Zorg ervoor dat u voldoende putten instelt voor alle experimentele monsters en controles.
- Nadat de ECM-oplossing ontdooid is, moet u ecm 1:2 onmiddellijk verdunnen in voorgekoeld basaal medium (d.w.z. EBM-2 basale medium, zie Materiaaltabel)tot een voldoende volume (100 μL/insert x aantal wisselplaten).
OPMERKING: Als er bijvoorbeeld zes wisselplaten zijn, dan is het totale volume 100 μL x 6 = 600 μL. Voeg 200 μL ECM toe aan 400 μL basale medium.
- Bestrijk de wisselplaten met 100 μL vers verdunde ECM door deze direct bovenop het membraan toe te voegen. Bebroed de plaat minstens 30 m in bij 37 °C om de ECM te laten stollen.
OPMERKING: Dit moet worden uitgevoerd onder een laminaire stroomweefsel kweekkap om besmetting te voorkomen.
6. SVs en hele ventricles culturen
OPMERKING: Zorg er voor het begin voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: 70% ethanol, overdrachtspipet, stereomicroscoop, tangen, laminaire stroomweefselkweekkap, microvasculaire endotheelcelsupplementkit(Tabel met materialen), basale medium, 1xste PBS). Figuur 6 toont de workflow van sv- en ventrikelcultuur.
- Ontdooi de inhoud van de supplementkit op ijs. Bereid het volledige medium door het toevoegen van alle inhoud van het supplement kit in 500 mL van basale medium onder een gecertificeerde laminaire stroomweefsel kweekkap. Meng het medium goed en verdeel in 50 mL aliquots.
- Steriliseer de basis van de stereomicroscoop en het omliggende werkgebied met 70% ethanol.
- Verkrijg de weefselkweekplaten uit stap 5.4. Breng met behulp van een transferpipet de explants voorzichtig over van stap 4.7 bovenop het wisselplaatmembraan. Onder een stereomicroscoop en met behulp van schone tangen, plaats de explants in het midden van de inserts om ervoor te zorgen dat ze niet vast zitten in de hoek van de wisselplaten of bevestigd aan de zijwanden.
- Nadat de explants op de wisselplaten zijn geplaatst en gecentreerd, verwijder voorzichtig eventuele extra PBS uit de wisselplaten en sluit u de deksels van de platen.
- Voeg onder een laminaire stroomweefselkweekkap 100 μL van het voorverwarmde volledige medium bovenop de wisselplaten toe en 200 μL in de putten om de explants op de lucht-vloeibare interface zodanig te kweken dat het basale oppervlak van de insert in contact komt met het medium , maar het bovenste oppervlak wordt blootgesteld aan de lucht.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het volume aanpast om een lucht-vloeibare interface te verkrijgen als u inserts/putplaten van verschillende grootte gebruikt.
- Voeg 300 μL PBS toe aan de ongebruikte putten van de 24 putplaten en dek af met het deksel. Incubeer de plaat in een 37 °C, 5% CO2 incubator en kweek de culturen gedurende 5 dagen.
- In de volgende dagen, routinematig observeren van de culturen onder een omgekeerde lichtmicroscoop om de status van de explant culturen te beoordelen. Zorg ervoor dat de explants contractile slaan vertonen en dat alle explants zijn bevestigd aan de bodem van het membraan ingebed met ECM. Let op alle drijvende explants.
OPMERKING: De periodieke samentrekking van de explants geeft aan dat ze nog leven. Zwevende explants moeten worden weggelaten uit de analyse.
- Na het beoordelen van de cultuurstatus, zet de cultuurplaat terug in de couveuse en blijf de cultuur tot 5 dagen groeien.
7. Behandeling van culturen met VEGF-A (Positieve Controle)
OPMERKING: Zorg er voor het begin voor dat u de volgende apparatuur en reagentia hebt: laminaire stroomweefselkweekkap, 1x PBS, basale medium + 1% foetaal runderserum (FBS), basale medium + VEGF-A, pipetten en pipettips.
- Bereid het basale medium + 1% FBS en het basale medium + VEGF-A voor.
- Om het basale medium + 1% FBS voor te bereiden, bepaal eerst het aantal benodigde controleputten. Als er bijvoorbeeld drie controleputten zijn, dan is 300 μL/put x 3 = 900 μL het totale benodigde volume. Voeg 9 μL FBS toe aan 891 μL basaal medium om het basale medium + 1% FBS te maken.
- Om het basale medium + VEGF-A voor te bereiden, bepaal eerst het totale aantal putten dat VEGF-A-medium nodig heeft. Als er drie putten zijn, dan is 300 μL/put x 3 = 900 μL het totale volume en 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A. Voeg 150 ng VEGF-A toe aan 900 μL basaal medium om het basale medium + VEGF-A te maken.
OPMERKING: Monteer deze oplossing op een groter volume dan berekend om een voldoende aantal kleinere aliquots voor elk experiment te verzekeren.
- Verwijder op dag 2 de media uit beide kamers (de inzetstukken en de putten). Was culturen met 300 μL 1x PBS door 100 μL toe te voegen aan de wisselplaten en 200 μL in de putten. Draai de platen een paar keer stevig en verwijder de PBS.
- Voeg 300 μL basale medium + 1% FBS (100 μL in de insert en 200 μL in de putten) toe om de culturen 24 uur te verhongeren.
- Voeg op dag 3, na de honger, 300 μL basaal medium + 1% FBS (100 μL toe aan de wisselplaat en 200 μL in de putten) in de controleputten en basaal medium + VEGF-A (50 ng/well) in de behandelingsputten.
- Na de behandeling, blijven groeien de culturen in de incubator.
8. Fixatie en immunovlekken
OPMERKING: Zorg er voor het begin voor dat u over de volgende apparatuur en reagentia beschikt: 4% paraformaldehyde (PFA), 1x PBS, primaire en secundaire antilichamen, een shaker, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof in PBS (PBT).
- Verwijder op de zesde dag van het kweken het medium en was culturen met 1x PBS bij kamertemperatuur (RT).
- Fix de culturen door 200 μL van 4% PFA-oplossing toe te voegen aan de putten en 100 μL in de wisselplaten. Fix culturen in 4 °C gedurende 20 min tijdens het rocken.
- Verwijder NA 20 min fixatie PFA uit de culturen in een rookkap en was de culturen met 1x PBS door 200 μL in de putten en 100 μL in de wisselplaten toe te voegen.
- Herhaal wasbeurten 3x, 10 min elk, tijdens het schommelen. Ga dan over tot het uitvoeren van immunostaining.
OPMERKING: Alle wasstappen worden uitgevoerd op een benchtop bij RT.
- Verdun primaire antilichamen (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) in blokkeringsoplossing (5% ezelsserum, 0,5% PBT). Voeg 300 μL primaire antilichaamoplossing (200 μL in de onderste putten en 100 μL toe aan de wisselplaten). Broed culturen in primaire antilichamen 's nachts op 4 °C tijdens het schommelen.
OPMERKING: Anti-VE-Cadherin wordt gebruikt om het endotheelcelmembraan te etiketteren en anti-ERG 1/2/3 wordt gebruikt om de endotheelcelkern te labelen om de angiogene spruiten van endotheelcellen te visualiseren.
- De volgende dag, wassen en rock en rock de cultuur platen 10x in 0,5% PBT, het veranderen van PBT om de 10 min.
- Verdun de secundaire antilichamen (ezel anti-rat Alexa Fluor 488 en ezel anti-konijn Alexa Fluor 555) in blokkerenoplossing. Voeg 300 μL van het secundaire antilichaam toe als in stap 8.2 en broed de culturen 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen uit. De volgende dag, was de secundaire antilichamen 10x in PBT, het veranderen van PBT om de 10 min.
LET OP: Was een minimum van 10x, maar meer wasbeurten zijn beter. Nadat de wasbeurten zijn voltooid, kunnen de culturen worden opgeslagen met 1x PBS totdat ze op dia's zijn gemonteerd.
9. Montage culturen op dia's, beeldvorming en analyse
OPMERKING: Voordat u begint, zorg ervoor dat de volgende apparatuur en reagentia: fijne tangen, dia's, montage medium met 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), coverslips, en confocale microscoop. Na secundaire antilichaamkleuring, monteer de culturen op dia's voor beeldvorming met behulp van de volgende stappen.
- Pel het membraan voorzichtig uit de wisselplaat met behulp van fijne tangen en breng het op de glijbanen door het membraan kant naar beneden en het plaatsen van de explant culturen omhoog. Plaats de replicerende monsters in dezelfde dia's en label de dia's als besturingselement of VEGF-A. Voeg een paar druppels montagemedium met DAPI direct op het membraan en bedek de glijbanen met dekselslips.
LET OP: Zorg ervoor dat luchtbellen te vermijden tijdens het plaatsen van de coverslips.
- Sluit de randen van de glijbanen af met heldere nagellak en laat drogen.
OPMERKING: Dia's kunnen worden opgeslagen in -20 °C voor langdurige opslag.
- Beelddia's met behulp van een confocale microscoop.
- Voer analyses uit om de lengte van angiogene uitgroei te meten. Kwantificeren angiogene uitgroeilengte door het meten van de afstand van de endotheelcellen (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) uitgebreid vanaf de binnengrens van de ERG 1/2/3+ cellen in de ventrikelculturen en vanuit het centrum van de SV-explants in de SV-culturen.
- Download eerst FIJI-software om kwantificering uit te voeren met FIJI/ImageJ.
- Afbeeldingsbestanden openen in FIJI: ga naar Bestand | Open | Map | Bestandsnaam | Open.
- Ga naar Analyseren | Metingen vaststellen | Selecteer Omtrek.
- Selecteer het gereedschap Rechte lijn in het hoofdvenster.
- Trek een lijn over de lengte van een spruit zoals voorgesteld in stap 9.4.
- Ga naar Analyseren | Meting.
OPMERKING: Lengtemetingen worden weergegeven in het nieuwe venster.
- Kwantificering uitvoeren in afbeeldingen die ten minste drie willekeurig geselecteerde gezichtsvelden vertegenwoordigen. Gemiddelde de kiemlengte metingen en meld ze als gemiddelde ± standaarddeviatie.