In vitro modellen van coronaire angiogenese kan worden gebruikt voor de ontdekking van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese. In vitro explantculturen van sinusvenosus- en endocardiumweefsels laten een robuuste groei zien in reactie op VEGF-A en vertonen een vergelijkbaar patroon van COUP-TFII-expressie als in vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier beschrijven we een in vitro cultuurtest om coronaire angiogenese te bestuderen. Coronaire bloedvaten voeden de hartspier en zijn van klinisch belang. Defecten in deze bloedvaten vertegenwoordigen ernstige gezondheidsrisico's, zoals bij atherosclerose, wat kan leiden tot hartinfarcten en hartafwijkingen bij patiënten. Bijgevolg, coronaire hartziekte is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Ondanks het klinische belang, relatief weinig vooruitgang is geboekt op het gebied van het regenereren van beschadigde kransslagaders. Niettemin is er recente vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de cellulaire oorsprong en differentiatietrajecten van coronaire vaatontwikkeling. De komst van tools en technologieën die onderzoekers in staat stellen om fluorescerende label voorlopercellen, volgen hun lot, en visualiseren progenies in vivo zijn instrumenteel in het begrijpen van coronaire schip ontwikkeling. In vivo studies zijn waardevol, maar hebben beperkingen in termen van snelheid, toegankelijkheid en flexibiliteit in experimenteel ontwerp. Als alternatief kunnen nauwkeurige in vitro modellen van coronaire angiogenese deze beperkingen omzeilen en onderzoekers in staat stellen om belangrijke biologische vragen snel en flexibel te ondervragen. Het ontbreken van geschikte in vitro modelsystemen kan de vooruitgang in het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire vaatgroei hebben belemmerd. Hier beschrijven we een in vitro cultuursysteem om kransslagaders te laten groeien uit de sinusvenosus (SV) en endocardium (Endo), de twee voorloperweefsels waaruit veel van de kransslagaders voortkomen. We hebben ook bevestigd dat de culturen nauwkeurig een aantal van de bekende in vivo mechanismen samenvatten. Zo tonen we aan dat de angiogene spruiten in de cultuur van SV downregulate COUP-TFII expressie vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in vivo. Daarnaast tonen we aan dat VEGF-A, een bekende angiogene factor in vivo, angiogenese van zowel de SV- als Endo-culturen robuust stimuleert. Gezamenlijk hebben we een nauwkeurig in vitro cultuurmodel bedacht om coronaire angiogenese te bestuderen.
Inleiding
Bloedvaten van het hart worden vaak coronaire bloedvaten genoemd. Deze vaten bestaan uit slagaders, aders en haarvaten. Tijdens de ontwikkeling worden eerst sterk vertakte haarvaten aangelegd, die vervolgens worden verbouwd tot kransslagaders en aders1,2,3,4,5. Deze eerste haarvaten zijn opgebouwd uit endotheelvoorlopercellen gevonden in het proepicardium, sinus venosus (SV) en endocardium (Endo) weefsels1,6,7....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het gebruik van alle dieren in dit protocol volgde Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) richtlijnen.
1. Oprichting van muisfokkers en het detecteren van vaginale pluggen voor getimede zwangerschappen
- Het opzetten van een muis kweekkooi met wilde type mannelijke en vrouwelijke muizen. Zorg ervoor dat de leeftijd van de broedmuizen tussen 6-8 weken ligt. Stel een paar (1 man en 1 vrouwtje) of als trio (1 mannetje en 2 vrouwtje) op voor de fokkerij.
- Controleer op een vaginale plug de volgende ochtend. Gebruik een schuine metalen sonde om een diepe plug te detecteren door het in de vagina....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een van de meest opvallende kenmerken van SV angiogenese in vivo is dat het een specifiek traject volgt en celdedifferentiatie en redifferentiatiegebeurtenissen omvat die zich voordoen op stereotiepe tijden en posities1. Als de eerste SV-cellen op de hartkamer groeien, stoppen ze met het produceren van veneuze markers zoals COUP-TFII (Figuur 7). Vervolgens nemen coronaire spruiten twee migratiepaden, hetzij over het oppervlak van het h.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Enkele van de meest kritische stappen voor het succesvol kweken van kransslagaders van de SV en Endo voorloperweefsels zijn: 1) Het correct identificeren en isoleren van het SV-weefsel voor sv-cultuur; 2) het gebruik van ventrikels uit embryo's tussen de leeftijden van e11−11.5 voor een nauwkeurige Endo-cultuur; 3) het handhaven van steriele omstandigheden gedurende de gehele dissectieperiode en het te allen tijde koud houden van de weefsels; en 4) het houden van de explants aan het ecm gecoate membraan om te voorkomen d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de leden van het Sharma laboratorium voor het verstrekken van een ondersteunende onderzoeksomgeving. Wij willen graag speciale dank aan Diane (Dee) R. Hoffman die onderhoudt en zorgt voor onze muis kolonie. We willen ook Drs. Philip J. Smaldino en Carolyn Vann bedanken voor het grondig nalezen van het manuscript en het verstrekken van nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door fondsen van Ball State University Provost Office en Department of Biology naar B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondsen aan B.S, en NIH (RO1-HL128503) en The New York Stem Cell Foundation fondsen aan K.R.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100 x 20 MM weefselkweekschaaltje | Fisher Scientific | 877222 | Verwezen naar in het protocol als petrischaaltje |
| 24-well platen | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8,0 uM PET membraan kweekinserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Ezel anti-konijn 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secundaire antilichaam |
| Alexa Fluor Ezel anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secundaire antilichaam |
| Hoekige metalen sonde | Fine science tools | 10088-15 | Hoekige 45 graden, gebruikt voor het detecteren van diepe pluggen |
| Anti-ERG 1/2/3 antilichaam | Abcam | Ab92513 | Primair antilichaam |
| Anti-VE-Cadherin antilichaam | Fisher Scientific | BDB550548 | Primair antilichaam, fabrikant BD BioSciences |
| CO2 gastank | Verschillende leveranciers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | Voor 37 °C, 5% CO2 incubatie |
| Dissectie stereomicroscoop | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscoop |
| EBM-2 basaal medium | Lonza | CC-3156 | Basaal medium voor endotheliale celgroei |
| ECM oplossing | Corning | 354230 | Commercieel bekend als Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvasculair endotheelcelsupplement kit; Dit wordt gemengd met de EBM-2 om het EGM-2 complete medium te maken |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Beeldverwerkingssoftware (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fijne pincet | Fine science tools | 11412-11 | Gebaten voor embryodissectie |
| Fisherbrand Rechtbladige operatie schaar | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Fosfaat Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminaire stroom weefselkweekkap | Fisher Scientific | verschillende modellen beschikbaar | |
| Montage Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield met DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | Dit is verkrijgbaar bij 32%; moet worden verdund tot 4% |
| Geperforeerde lepel | Fine science tools | 10370-18 | Bruikbaar bij het verwijderen van embryo/weefsels uit een oplossing |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standaard pincet, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Muis/Rat kamer | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasie kamer |
Referenties
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
