Verstrekt hier is een protocol dat details stappen om een diermodel van chronische post-ischemie pijn (CPIP) te vestigen. Dit is een goed herkend model nabootsen van humaan complex regionaal pijnsyndroom type-I. Mechanische en thermische overgevoeligheid worden verder geëvalueerd, evenals capsaïcine-geïnduceerde nocifensieve gedrag waargenomen in de CPIP rat model.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chronische post-ischemie pijn model voor complexe regionale pijnsyndroom type-I bij ratten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Complex regionaal pijnsyndroom type-I (CRPS-I) is een neurologische aandoening die ernstige pijn bij patiënten veroorzaakt en blijft een onopgeloste medische aandoening. Echter, de onderliggende mechanismen van CRP'S-ik moet nog worden onthuld. Het is bekend dat ischemie/reperfusie een van de belangrijkste factoren is die CRP'S-I veroorzaakt. Door middel van langdurige ischemie en reperfusie van de Hind ledemaat, de rat chronische post-ischemie pijn (CPIP) model is opgericht om te imiteren CRPS-I. Het CPIP-model is uitgegroeid tot een goed herkend diermodel voor het bestuderen van de mechanismen van CRPS-I. Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedures die betrokken zijn bij de oprichting van het Rat model van CPIP, met inbegrip van anesthesie, gevolgd door ischemie/reperfusie van de achterledemaat. Kenmerken van het Rat CPIP-model worden verder geëvalueerd door het meten van de mechanische en thermische overgevoeligheden van de achterste ledemaat, alsmede de nocifensieve reacties op acute capsaïcine injectie. De rat CPIP model vertoont verschillende CRPS-I-achtige manifestaties, met inbegrip van Hind ledemaat oedeem en hyperemie in de vroege fase na de oprichting, aanhoudende thermische en mechanische overgevoeligheid, en verhoogde nocifensieve reacties op acute capsaïcine injectie. Deze kenmerken maken het een geschikt diermodel voor verder onderzoek van de mechanismen die betrokken zijn bij CRP'S-I.
Inleiding
Complex regionaal pijnsyndroom (crp's) reprents complexe en chronische pijn symptomen als gevolg van fracturen, trauma, chirurgie, ischemie of zenuw letsel1,2,3. CRP'S is ingedeeld in 2 subcategorieën: CRPS type-I en type-II (CRPS-I en CRPS-II)4. Epidemiologische studies toonden aan dat de prevalentie van CRP'S ongeveer 1:20005was. CRPS-I, die geen duidelijke zenuwbeschadiging vertoont, kan resulteren in chronische pijn en heeft een dramatische invloed op de levenskwaliteit van de patiënten. Huidige beschikbare behandelingen vertonen ontoereikende therapeutische effecten. Daarom blijft CRPS-I nog steeds een belangrijk en uitdagend klinisch probleem dat moet worden aangepakt.
Vaststelling van een preklinische diermodel nabootsen van CRP'S-I is cruciaal voor het verkennen van de mechanismen die onderliggende CRP'S-I. Om dit probleem aan te pakken, ontwierp Coderre et al. een rat-model door langdurige ischemie en reperfusie toe te passen op het achterlijf om CRP'S-I6te recapituleren. Het is bekend dat ischemie/reperfusie letsel behoort tot een van de belangrijkste oorzaken van CRPS-I7. De rat CPIP model vertoont veel CRPS-I-achtige symptomen, waaronder Hind ledemaat oedeem en hyperemie in de vroege fase na de oprichting van het model, gevolgd door aanhoudende thermische en mechanische overgevoeligheid6. Met de hulp van dit model, wordt voorgesteld dat centrale pijn sensibilisatie, perifere TRPA1 kanaal activering en reactieve zuurstof soorten generatie, etc. bijdragen aan CRPS-I8,9,10. We hebben onlangs met succes de CPIP rat model en uitgevoerd RNA-sequencing van de dorsale wortel ganglia (Drg's) die innervate de aangetaste Hind paw11. We ontdekten een aantal mogelijke mechanismen die mogelijk betrokken zijn bij het bemiddelen van de pijn overgevoeligheden van CRPS-I11. We verder geïdentificeerd voorbijgaande receptor potentiële vanilloid 1 (TRPV1) kanaal in DRG neuronen als een belangrijke bijdrage aan de mechanische en thermische overgevoeligheden van CRPS-I12.
In deze studie, we beschreven de gedetailleerde procedures die betrokken zijn bij de oprichting van de rat model van CPIP. We evalueerden verder het Rat CPIP-model door het meten van de mechanische en thermische overgevoeligheid, alsmede de responsiviteit op acute capsaïcine Challenge. Wij stellen voor dat het Rat CPIP-model een betrouwbaar diermodel kan zijn voor verder onderzoek naar de mechanismen die betrokken zijn bij CRP'S-I.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dieren protocollen werden goedgekeurd door de Zhejiang Chinese Medical University dierenethiek Commissie.
1. dieren
- Verkrijg mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten (280 – 320 g, 8-10 weken oud) uit Shanghai Laboratory Animal Center. Huis de dieren in Zhejiang Chinese medische universiteit laboratorium Animal Center. Houd er rekening mee dat de kweekomstandigheden 12 uur/2H licht/donker cycli moeten omvatten en de temperatuur constant moeten houden bij 24 °C. Geef water en voedsel ad libitum. Merk op dat in deze studie in totaal 48 ratten worden gebruikt. Eén noot, in dit model moeten we de pijn reactie tijdens het hele proces observeren. Als pijnmedicatie wordt toegepast, dan kunnen we niet met succes het pijn model vast te stellen. Na de experimenten worden de ratten geofferd.
2. CPIP model inrichting
- Anesthetiseer alle ratten (inclusief Sham-en CPIP-model groepen) met natrium fenobarbital (50 mg/kg, intraperitoneale injectie [i.p.]). Onderhoud anesthesie met maximaal 20 mg/kg/h fenobarbital [i.p.], indien nodig. Controleer de reflexen van elk dier door de achterste poot of staart tip met behulp van een tang te knijpen. Zorg ervoor dat de ratten niet responsief zijn voordat model inrichting. Plaats dierenarts zalf op de ogen om droogheid tijdens de procedure te voorkomen. Plaats de verdoofd ratten op een verwarmde pad gehandhaafd op 37 ° c voor de volgende procedure.
-
Ischemie en reperfusie van de Hind poot
- Smeer de rechter achterpoot en enkel met glycerol zodra de rat is verdoemde.
- Schuif een nitril 70 Durometer O-ring met een inwendige diameter van 7/32 "(5,5 mm) in de grotere kant van een 1,5 mL Eppendorf buis (met de snap-Cap afgesneden voor gebruik). Steek de achterpoot voorzichtig in de holle Eppendorf-buis tot de bodem bereikt is.
- Schuif de O-ring geleidelijk van de buis naar de rechter achterledemaat in de buurt van het enkelgewricht en plaats voor 3 h. Breng dezelfde behandeling aan op een schijn groep van ratten, behalve dat een gebroken O-ring, die is afgesneden en niet moet induceren ischemie, moet worden geplaatst rond de enkel.
- Afgesneden van de O-ring 3 h na de ischemie stap. Let goed op de rat totdat het voldoende bewustzijn herstelt om borstbeen recumbency te behouden. Merk op dat de rat die anesthesie heeft ontvangen, niet terug moet worden gebracht naar het gezelschap van andere ratten totdat het volledig is hersteld.
3. nocifensieve gedragstesten
- Plaats de rat in een transparante plexiglas kamer die op een gaas vloer zit. Gewennen de rat voor 0,5 h voor een gedrags test.
-
Mechanische allodynie
- Gebruik von Frey filamenten (0,4, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 15,0 en 26,0 g filamenten) voor de test. Begin de test vanaf de middelste gloeidraad (4,0 g). Breng de filamenten verticaal aan op het middelste plantaire-oppervlak van de achterpoot. Breng een licht passende kracht aan om de gloeidraad tot 5 sec. te buigen. Een plotselinge terugtrekking van de achterpoot in reactie op de stimuli wordt beschouwd als een nocifensief gedrag. Voer de mechanische allodynie-test uit op dagen-3,-2,-1 en om de dag tot dag 13.
- Pas de up-down testmethode toe om de drempel te testen. Toepassing van de Dixon methode voor het berekenen van 50% paw terugtrekking drempelwaarde (PWT)13,14,15.
-
Thermische hyperalgesia
- Gebruik de methode van Hargreaves om thermische hyperalgesie te onderzoeken. Direct richten de lichtstraal uitgezonden van een lamp (50 W) aan de achterpoot voor het meten van de Paw terugtrekking latency (PWL). Stel 20 sec. als de cut-off drempel om overmatig letsel door de verwarming te voorkomen.
- Herhaal elke test 3x in 5 min intervallen voor elke achterpoot. Neem het gemiddelde van deze drie tests als de PWL van elke rat16. Het uitvoeren van de thermische hyperalgesia test op dagen-3,-2,-1, en om de andere dag tot dag 13.
-
Capsaïcine-geïnduceerde acute nocifensieve gedrag
- Bereid capsaïcine Stock Solution (200 mM) met behulp van dimethylsulfoxide (DMSO) en verder verdunnen tot 1:1000 in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor Hind paw injectie. De laatste DMSO-concentratie in PBS is 0,1% (voertuig bevat 0,1% DMSO in PBS alleen). Injecteer capsaïcine of voertuig in de achterpoot (intraplantar injectie) bij een volume van 50 μL met een 30 G naald aan 1 mL spuit.
- Noteer het nocifensieve gedrag (d.w.z. likken, bijten of te stoppen van de geïnjecteerde poot) met behulp van een videocamera gedurende 10 minuten direct na de injectie en daarna gekwantificeerd zoals eerder beschreven17,18,19.
- Hind paw-oedeem evaluatie: Evalueer het achterpoot oedeem door de toename van de pootdiameter te meten. Meet met een digitale remklauw en bereken het verschil tussen de basale waarde en de testwaarde die op verschillende tijdstippen wordt waargenomen. Evalueer de veranderingen in de dikte van de poot op 15 min, 24 uur, 48 uur en 72 uur na de model instelling.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na het plaatsen van de O-ring op de enkel, toonde de ipsilaterale Hind paw huid cyanose, een indicatie van weefselhypoxie (Figuur 1A). Na het knippen van de O-ring begon de ipsilaterale Hind poot met bloed te vullen en toonde een robuuste zwelling, die een intens teken van hyperemie demonstreerde (Figuur 1A). De zwelling van de poot geleidelijk afgenomen en keerde terug naar normaal 48 h na de ischemische/reperfusie procedure (t...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methoden voor het vaststellen van een rat CPIP-model door het toepassen van ischemie/reperfusie op achterpoten van de ratten. Het gaat om de evaluatie van het uiterlijk van de achterledematen, oedeem, mechanische/thermische overgevoeligheid en acuut nocifensief gedrag in reactie op capsaïcine injectie.
Ledemaat ischemie/reperfusie is een gemeenschappelijke factor die bijdraagt aan CRPS-I bij menselijke patiënten12. Dit protocol ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten in dit werk.
Dankbetuigingen
Dit project werd gesponsord door National Natural Science Foundation of China (81873365 en 81603676), Zhejiang provinciale natuurwetenschappelijke fondsen voor eminente jonge geleerden (LR17H270001) en onderzoeksfondsen van de Zhejiang Chinese Medical University ( Q2019J01, 2018ZY37, 2018ZY19).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml Eppendorf tube | Eppendorf | 22431021 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D1435 | |
| Capsaicin | APEXBIO | A3278 | |
| Digitale schuifmaat | Meinaite | NA | |
| O-ring | O-Rings West | Nitrile 70 Durometer | 7/32 inch binnendiameter |
| Plantaars testapparaat | UGO Basile, Italië | 37370 | |
| von Frey filamenten | UGO Basile, Italië | NC12775 |
Referenties
- Goh, E. L., Chidambaram, S., Ma, D. Complex regional pain syndrome: a recent update. Burns, Trauma. 5 (1), 2(2017).
- Birklein, F., Ajit, S. K., Goebel, A., Rsgm, P., Sommer, C. Complex regional pain syndrome - phenotypic characteristics and potential biomarkers. Nature Reviews Neurology. 14 (5), (2018).
- Shim, H., Rose, J., Halle, S., Shekane, P. Complex regional pain syndrome: a narrative review for the practising clinician. British Journal of Anaesthesia. , (2019).
- Urits, I., Shen, A. H., Jones, M. R., Viswanath, O., Kaye, A. D. Complex Regional Pain Syndrome, Current Concepts and Treatment Options. Current Pain, Headache Reports. 22 (2), 10(2018).
- Helyes, Z., et al. Transfer of complex regional pain syndrome to mice via human autoantibodies is mediated by interleukin-1-induced mechanisms. Proceedings of National Academy Sciences of the United States of America. 116 (26), 13067-13076 (2019).
- Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-Type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112 (1), 94-105 (2004).
- Coderre, T. J., Bennett, G. J. A hypothesis for the cause of complex regional pain syndrome-type I (reflex sympathetic dystrophy): pain due to deep-tissue microvascular pathology. Pain Medicine. 11 (8), 1224-1238 (2010).
- Klafke, J. Z., et al. Acute and chronic nociceptive phases observed in a rat hind paw ischemia/reperfusion model depend on different mechanisms. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 468 (2), 229-241 (2015).
- Tang, Y., et al. Interaction between astrocytic colony stimulating factor and its receptor on microglia mediates central sensitization and behavioral hypersensitivity in chronic post ischemic pain model. Brain Behavioral Immunology. 68, 248-260 (2018).
- Kim, J. H., Kim, Y. C., Nahm, F. S., Lee, P. B. The Therapeutic Effect of Vitamin C in an Animal Model of Complex Regional Pain Syndrome Produced by Prolonged Hindpaw Ischemia-Reperfusion in Rats. International Journal of Medical Sciences. 14 (1), 97-101 (2017).
- Yin, C., et al. Transcriptome profiling of dorsal root ganglia in a rat model of complex regional pain syndrome type-I reveals potential mechanisms involved in pain. Journal of Pain Research. 12, 1201-1216 (2019).
- Hu, Q., et al. TRPV1 Channel Contributes to the Behavioral Hypersensitivity in a Rat Model of Complex Regional Pain Syndrome Type 1. Frontiers in Pharmacology. 10, 453(2019).
- Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 20, 441-462 (1980).
- Chai, W., et al. Electroacupuncture Alleviates Pain Responses and Inflammation in a Rat Model of Acute Gout Arthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2018, 2598975(2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Fang, J. Q., et al. Parameter-specific analgesic effects of electroacupuncture mediated by degree of regulation TRPV1 and P2X3 in inflammatory pain in rats. Life Sciences. 200, 69-80 (2018).
- Tai, Y., et al. Involvement of Transient Receptor Potential Cation Channel Member A1 activation in the irritation and pain response elicited by skin-lightening reagent hydroquinone. Scientific Reports. 7 (1), 7532(2017).
- Liu, B., et al. TRPM8 is the principal mediator of menthol-induced analgesia of acute and inflammatory pain. Pain. 154 (10), 2169-2177 (2013).
- Liu, B., et al. Oxidized Phospholipid OxPAPC Activates TRPA1 and Contributes to Chronic Inflammatory Pain in Mice. PLoS One. 11 (11), 0165200(2016).
- Terkelsen, A. J., Gierthmuhlen, J., Finnerup, N. B., Hojlund, A. P., Jensen, T. S. Bilateral hypersensitivity to capsaicin, thermal, and mechanical stimuli in unilateral complex regional pain syndrome. Anesthesiology. 120 (5), 1225-1236 (2014).
- Drummond, P. D., Morellini, N., Finch, P. M., Birklein, F., Knudsen, L. F. Complex regional pain syndrome: intradermal injection of phenylephrine evokes pain and hyperalgesia in a subgroup of patients with upregulated alpha1-adrenoceptors on dermal nerves. Pain. 159 (11), 2296-2305 (2018).
- Minert, A., Gabay, E., Dominguez, C., Wiesenfeld-Hallin, Z., Devor, M. Spontaneous pain following spinal nerve injury in mice. Experimental Neurology. 206 (2), 220-230 (2007).
- Kingery, W. S., et al. Capsaicin sensitive afferents mediate the development of heat hyperalgesia and hindpaw edema after sciatic section in rats. Neuroscience Letters. 318 (1), 39-43 (2002).
- Xu, J., et al. Activation of cannabinoid receptor 2 attenuates mechanical allodynia and neuroinflammatory responses in a chronic post-ischemic pain model of complex regional pain syndrome type I in rats. European Journal of Neuroscience. 44 (12), 3046-3055 (2016).
- Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112 (1-2), 94-105 (2004).
- Weissmann, R., Uziel, Y. Pediatric complex regional pain syndrome: a review. Pediatric Rheumatology Online Journal. 14 (1), 29(2016).
- Kim, H., Lee, C. H., Kim, S. H., Kim, Y. D. Epidemiology of complex regional pain syndrome in Korea: An electronic population health data study. PLoS One. 13 (6), 0198147(2018).
- Tang, C., et al. Sex differences in complex regional pain syndrome type I (CRPS-I) in mice. Journal of Pain Research. 10, 1811-1819 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
