Het genereren van gecontroleerde, dynamische chemische landschappen om microbieel gedrag te bestuderen

Samenvatting

Een protocol voor de generatie van dynamische chemische landschappen door fotolyse binnen microfluïde en millifluïde opstellingen wordt gepresenteerd. Deze methodologie is geschikt om diverse biologische processen te bestuderen, waaronder het motile gedrag, de opname van voedingsstoffen of aanpassing aan chemische stoffen van micro-organismen, zowel op eencellig als populatieniveau.

Samenvatting

We demonstreren een methode voor de generatie van gecontroleerde, dynamische chemische pulsen-waar gelokaliseerde chemoattractant plotseling beschikbaar wordt op de microschaal- om micro-omgevingen te creëren voor microbiële chemotaxis experimenten. Om chemische pulsen te maken, ontwikkelden we een systeem om aminozuurbronnen bijna onmiddellijk te introduceren door fotolyse van gekooide aminozuren in een polydimethylsiloxane (PDMS) microfluïde kamer met een bacteriële suspensie. We hebben deze methode toegepast op de chemotactische bacterie, Vibrio ordalii, die actief deze dynamische chemische gradiënten kan beklimmen terwijl ze worden gevolgd door videomicroscopie. Aminozuren, biologisch inert ('gekooid') door chemische modificatie met een fotoverwijderbare beschermende groep, zijn gelijkmatig aanwezig in de suspensie, maar niet beschikbaar voor consumptie tot hun plotselinge release, die optreedt op door de gebruiker gedefinieerde punten in tijd en ruimte door middel van een bijna UV-A gerichte LED-balk. Het aantal moleculen dat vrijkomt in de puls kan worden bepaald door een kalibratierelatie tussen blootstellingstijd en ontwetelste fractie, waarbij het absorptiespectrum na fotolyse wordt gekenmerkt door het gebruik van UV-Vis spectroscopie. Een nanoporeus polycarbonaat (PCTE) membraan kan worden geïntegreerd in het microfluïde apparaat om de continue verwijdering door stroom van de ontgaardde verbindingen en de verbruikte media mogelijk te maken. Een sterke, onomkeerbare binding tussen het PCTE membraan en de PDMS microfluidic structuur wordt bereikt door het membraan te coaten met een oplossing van 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), gevolgd door plasmaactivering van de te binden oppervlakken. Een computergestuurd systeem kan door de gebruiker gedefinieerde sequenties van pulsen genereren op verschillende locaties en met verschillende intensiteiten, om hulpbronnenlandschappen te creëren met voorgeschreven ruimtelijke en temporele variabiliteit. In elk chemisch landschap kan de dynamiek van bacteriële beweging op individuele schaal en hun accumulatie op populatieniveau worden verkregen, waardoor de kwantificering van de chemotactische prestaties en de effecten ervan op bacteriële aggregaties in ecologisch relevante omgevingen mogelijk wordt.

Inleiding

Microben vertrouwen op chemotaxis, het proces van het detecteren van chemische gradiënten en het wijzigen van de beweeglijkheid in reactie^1,om chemische landschappen te navigeren, voedingsbronnen en gastheren te benaderen en schadelijke stoffen te ontsnappen. Deze microschaalprocessen bepalen de macroschaalkinetiek van interacties tussen microben en hun omgeving^2,3. Recente ontwikkelingen in microfluidica en microfabricage technologieën, waaronder zachte lithografie^4,hebben een revolutie teweeggebracht ons vermogen om gecontroleerde micro-omgevingen te creëren waarin de interacties van microben te bestuderen. In het verleden zijn bijvoorbeeld bacteriële chemotaxi's onderzocht door sterk gecontroleerde, stabiele gradiënten van tussenliggende tot hoge nutriëntenconcentraties te genereren^5,6. In natuurlijke omgevingen kunnen chemische gradiënten op microschaal echter van korte duur zijn, verdrijving door moleculaire diffusie en achtergrondomstandigheden zijn vaak sterk verdund⁷. Om de chemotactische respons van microbiële populaties die voor het eerst werden blootgesteld aan onstabiele chemische omgevingen direct te meten, bedachten en beschrijven we hier methoden om microfluïdetechnologie te combineren met fotolyse, waardoor gradiënten nabootsen die wilde bacteriën in de natuur tegenkomen.

Uncaging technologie maakt gebruik van lichtgevoelige sondes die functioneel biomoleculen in een inactieve vorm inkapselen. Doorstraling komt het gekooide molecuul vrij, waardoor een biologisch proces gericht kan worden verstoord⁸. Als gevolg van de snelle en nauwkeurige controle van cellulaire chemie die de ontwering biedt⁹, fotolyse van gekooide verbindingen is traditioneel gebruikt door biologen, fysiologen en neurowetenschappers om de activering van genen te bestuderen¹⁰, ionkanalen¹¹, en neuronen¹². Meer recent hebben wetenschappers gebruik gemaakt van de aanzienlijke voordelen van fotolyse om chemotaxis¹³te bestuderen , om de flagella switching dynamiek van individuele bacteriële cellen blootgesteld aan een stapsgewijze chemoattractant stimulus^14,15te bepalen en om beweeglijkheidspatronen van enkele zaadcellen in driedimensionale (3D) gradiënten te onderzoeken¹⁶.

In onze aanpak implementeren we fotolyse van gekooide aminozuren in microfluïdische apparaten om de gedragsreactie van een bacteriële populatie te bestuderen op gecontroleerde chemische pulsen, die bijna onmiddellijk beschikbaar worden via fotorelease. Het gebruik van een doelstelling met een lage vergroting (4x) (NA = 0,13, diepte van de focus ongeveer 40 μm) maakt zowel de waarneming van de aggregatieve respons op populatieniveau van duizenden bacteriën over een groot gezichtsveld (3,2 mm x 3,2 mm) als de meting van beweging op eencellige niveau mogelijk. We presenteren twee toepassingen van deze methode: 1) het vrijkomen van een enkele chemische puls om bacteriële accumulatie−dissipatiedynamiek te bestuderen vanaf uniforme omstandigheden, en 2i) het vrijkomen van meerdere pulsen om de bacteriële accumulatiedynamiek te karakteriseren onder tijdsvariërende, ruimtelijk heterogene chemoattractante omstandigheden. Deze methode is getest op de mariene bacteriën Vibrio ordalii die chemotaxis uitvoeren in de richting van het aminozuur glutamaat¹⁷, maar de methode is in grote lijnen van toepassing op verschillende combinaties van soorten en chemoattractants, evenals op biologische processen buiten chemotaxis (bijvoorbeeld, opname van voedingsstoffen, blootstelling aan antibiotica, quorumsensing). Deze aanpak belooft te helpen de ecologie en het gedrag van micro-organismen in realistische omgevingen te verduidelijken en de verborgen afwegingen te ontdekken waarmee individuele bacteriën worden geconfronteerd bij het navigeren in kortstondige dynamische gradiënten.

Protocol

1. Fabricage van het microfluïde apparaat voor het single chemical-pulse experiment

1. Ontwerp het kanaal met behulp van computer-aided design (CAD) software en print het op een transparantie film om de foto masker(Figuur 1A)te maken.
2. Fabriceer de meester door zachte lithografie (onder clean-room omstandigheden).
   1. Reinig een silicium wafer (4 inch) in snelle opeenvolging met aceton, methanol en isopropanol, dan droog met behulp van stikstof. Bak de wafel 5 min in de oven op 130 °C.
   2. Plaats de wafer in het midden van een spin-coater en giet SU-8 fotoresist op de wafer. Verhoog de snelheid van de spin-coater tot 500 tpm over 5 s, en houd bij 500 rpm voor 10 s. Ramp tot de uiteindelijke snelheid van meer dan 10 s en handhaven op deze snelheid voor 30 s.
      OPMERKING: De exacte waarde van de uiteindelijke snelheid is afhankelijk van de beoogde coatingdikte en de gebruikte SU-8.
   3. Bak na het spincoatingproces de wafer op 65 °C en vervolgens bij 95 °C. Laat de wafer minstens 5 min afkoelen bij kamertemperatuur (RT).
      LET OP: De baktijd is afhankelijk van de beoogde dikte en het type fotoresist gebruikt. In het algemeen moet de wafer voor elke laag van 100 μm gedurende 5 min bij 65 °C en 45 min bij 95 °C worden gebakken.
   4. Plaats het fotomasker op de wafer om ervoor te zorgen dat alleen het gebied van belang wordt blootgesteld en gepolymeriseerd. Bloot stellen aan UV-licht voor de aanbevolen tijd in de SU-8 handleiding.
      LET OP: Hier, met blootstellingsenergie van 200 mJ cm^-2 op een golflengte van 350 nm, werd de wafer blootgesteld voor 150 s.
   5. Bak de wafer op 65 °C en 95 °C voor de aanbevolen tijd in de SU-8 handleiding.
      OPMERKING: Voor elke laag van 100 μm moet de wafer voor elke laag van 100 μm gedurende 5 min bij 65 °C en 45 min bij 95 °C worden gebakken.
   6. Dompel de wafer onder in een beker gevuld met polymethyl methacrylaat (PMMA) ontwikkelaar om de meester te verkrijgen. Schud het bekerglas voorzichtig om ervoor te zorgen dat de ongepolymeriseerde fotoresist wordt uitgewassen. Bak de master op 200 °C om de SU-8 laag verder te verbinden.
3. Bereid een polydimethylsiloxaan (PDMS) mengsel door het combineren van de elastomer met zijn uithardingsmiddel(Tabel met materialen)op een 10:1 verhouding in een beker (hier, 40 mL). Meng krachtig tot de vloeistof homogeen is.
   OPMERKING: Het PDMS-mengsel ziet er ondoorzichtig uit omdat er tijdens het mengproces bellen worden gegenereerd.
   LET OP: Om te voorkomen dat de huid in contact komt met potentieel gevaarlijke chemische stoffen of biologisch materiaal, draag u altijd een labjas en wegwerpplastic handschoenen gedurende het protocol en volg u specifieke veiligheidsprotocollen volgens het materiaal Veiligheidsgegevensblad (MSDS).
4. Ontgassen het PDMS mengsel in een vacuümkamer gedurende 45 min bij RT. Om het proces te versnellen, laat u het vacuüm periodiek los om de bellen die zich vormen op de interface te laten barsten.
   OPMERKING: Het ontgassingsproces moet binnen 1 uur worden uitgevoerd om te voorkomen dat het PDMS-mengsel begint te genezen.
5. Verwijder stof van het oppervlak van de meester met een reiniger onder druk, giet het ontgasste PDMS-mengsel op de meester en bak in een oven op 80 °C gedurende 2 uur.
   OPMERKING: Als alternatief zou het bakken 's nachts (of voor ten minste 12 uur) bij 60 °C dezelfde geharde PDMS bereiken.
6. Snijd de PDMS met een mes rond de microstructuren (op een afstand van ongeveer 5 mm) en pel de PDMS voorzichtig van de master.
7. Punch gaten te dienen als inlaat en uitlaat van het microkanaal (hier, een inlaat en een uitlaat, zie Figuur 1A). Zorg ervoor dat niets de onderkant van de PDMS raakt waar de functies zich bevinden.
   LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Het microkanaal moet worden verzegeld met plakband om ophoping van stof en andere deeltjes tijdens de opslag te voorkomen.
8. Bind het PDMS-microkanaal op een glazen schuif.
   1. Maak een glazen glijbaan grondig schoon met zeep, isopropanol en gedeïoniseerd water. Laat het glas drogen of gebruik perslucht om het proces te versnellen.
   2. Verwijder stofdeeltjes door te deppen met plakband. Bind het PDMS-microkanaal op de schone glazen schuif, onmiddellijk na de behandeling van beide oppervlakken met plasma (met behulp van een coronasysteem of een plasmazuurstofkamer) gedurende 2 min.
   3. Plaats het microfluïde apparaat om minstens 1 uur op een hete plaat te verwarmen op 80 °C om de chemische binding met het glas te versterken.

2. Fabricage van het 3D-geprinte Millifluidic Device voor het experiment met meerdere pulsen

1. Ontwerp de 3D-vorm met behulp van 3D-ontwerpsoftware en print de master voor de PDMS-mal met een 3D-printer met hoge resolutie(figuur 1B).
   OPMERKING: Zie Tabel met materialen voor de 3D-printer en matrijsmateriaal dat wordt gebruikt om de master te maken.
2. Herhaal stap 1.3−1.4 en maak het oppervlak van de master schoon door te deppen met plakband. Zet de meester op een schaal, dan, terwijl het vermijden van de centrale regio van de meester die zal worden bezet door het membraan, giet op de exacte hoeveelheid niet-genezen PDMS mengsel (hier, 23,4 g) om de gewenste hoogte van PDMS te verkrijgen door het afstemmen van de hoogte van de meester (hier, 0,5 mm). Verwijder de resterende bellen met behulp van perslucht.
3. Plaats de PDMS-cast op de meester in een oven op 45 °C om minstens 12 uur te bakken.
4. Bond de 3D PDMS mal aan een petrischaaltje.
   1. Pel voorzichtig de geharde PDMS-laag en ponsinlaat- en uitlaatgaten af voor de injectie van de bacteriële suspensie(figuur 1C).
   2. Activeer zowel het oppervlak van een petrischaal (90 mm x 15 mm) als de PDMS-mal met zuurstofplasma gedurende 2 min. Bond de PDMS-mal op de petrischaal. Druk voorzichtig op de mal naar de petrischaal, maar druk niet op waar de functies zich bevinden, omdat dit de verhoorkamer kan instorten.
   3. Plaats de petrischaal die aan de PDMS 3D-mal is bevestigd in een oven op 45 °C gedurende ten minste 12 uur om de chemische binding te versterken.
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
5. Membraanoppervlakfunctionalisatie¹⁸
   1. Activeer het nanoporeuze polycarbonaat (PCTE) membraan gedurende 1 min in een zuurstofplasmakamer bij RT.
      LET OP: Vermijd het gebruik van een corona systeem voor de plasma activering, omdat het het membraan zal beschadigen.
   2. Onder een chemische kap, verdun een commerciële oplossing van 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) in gedeïoniseerd water tot 1% in volume (hier, 40 mL), met behulp van een polypropyleen buis.
      LET OP: De APTES-oplossing is acuut giftig (MSDS-gezondheidsrisicoscore 3) en moet uitsluitend onder een chemische kap met handschoenen met uiterste zorg worden behandeld. Verander handschoenen onmiddellijk na het hanteren van APTES-oplossing. APTES dampen zijn destructief voor de slijmvliezen en de bovenste luchtwegen. De doelorganen van APTES zijn zenuwen, lever en nieren. Als er geen rookkap beschikbaar is, moeten een gezichtsschild en een full-face respirator worden uitgevoerd.
   3. Breng de verdunde APTES-oplossing over in een petrischaaltje en dompel het geactiveerde membraan gedurende 20 min onder in de APTES-oplossing.
   4. Verwijder het membraan uit de APTES-oplossing met een pincet en leg het op een cleanroomdoek om te drogen.
6. Voor de fabricage van de PDMS microfluïde kanalen die op het membraan zullen liggen en het wassen van de bacteriële arena mogelijk maken, herhaalt u stap 1.1−1.7.
7. Bind de PDMS waskanalen aan het gefunctionaliseerde membraan.
   1. Activeer zowel het PDMS waskanaal als het PCTE membraan gedurende 2 min met een zuurstofplasmakamer.
      OPMERKING: Het membraan, dat wordt ingeklemd tussen twee PDMS-lagen, moet kleiner zijn dan het PDMS-waskanaal.
   2. Breng onmiddellijk na de plasmabehandeling het gefunctionaliseerde membraan en het PDMS-waskanaal in contact door het PDMS-waskanaal voorzichtig op het membraan te drukken.
      OPMERKING: Breng in dit stadium geen overmatige druk uit, omdat het (onomkeerbare) bevestiging van het membraan aan het dak van het kanaal kan veroorzaken, waardoor het kanaal wordt geblokkeerd.
8. Sandwich het membraan tussen twee PDMS lagen(figuur 1E).
   1. Activeer zowel het gebonden laminaat PDMS waskanaal−PCTE membraan als de 3D PDMS mal die eerder met een zuurstofplasmakamer gedurende 2 min aan de petrischaal is gebonden. Breng ze 2 min in contact en druk samen.
   2. Plaats de petrischaal die ten minste 12 uur aan de sandwichstructuur in een oven is gebonden op 45 °C om de chemische binding te versterken.
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

3. Celcultuur

1. Laat een populatie van V. ordalii (stam 12B09 of 12B09pGFP) 's nachts groeien voor 20 uur in 2216 medium¹⁹ op een orbitale shaker (600 rpm) bij 30 °C en oogst cellen in de late exponentiële fase. Voor isolaten die pGFP herbergen, voegt u spectinomycine (50 μg mL^-1)toe om de plasmid te behouden.
2. Centrifugeer een 1 mL aliquot van cellen bij 2500 x g gedurende 3 min, verwijder de supernatant en breg de cellen opnieuw op in 1 mL gefilterd kunstmatig zeewater. Herhaal deze stap.
3. Verhonger de populatie V. ordalii op een orbitale shaker (600 tpm) bij 30 °C gedurende 3 uur.
4. Bereid een stock kunstmatige zeewater oplossing van 10 mM (hier, 1 mL) van 4-methoxy-7-nitroindoline-gekooid- L-glutamaat (MNI-gekooid-L-glutamaat) en op te slaan op -20 °C.
   OPMERKING: Bescherm de MNI-gekooide- L-glutamaatoplossing tegen omgevingslicht om fotolyse te voorkomen.
5. Verdun de cellen 50x door de uitgehongerde cellen opnieuw op te schorten in eenkunstmatige zeewateroplossing van 1 mM MNI-gekooid- L-glutamaat.
   OPMERKING: Dit zal zorgen voor een laatste bacteriële concentratie lager dan 5 x 10⁷ mL^-1 (de exacte waarde is afhankelijk van de initiële concentratie van cellen in de late exponentiële, die meestal ~ 10⁹ mL^-1). Bacteriële concentratie werd geschat met behulp van een spectrofotometer bij optische dichtheid (OD) van 600 nm.

4. Kalibratie van het uncagingprotocol

1. Plaats een druppel (20 μL) van een kunstmatige zeewateroplossing van MNI-gekooide- L-glutamaat²⁰ bij een concentratie C₀ = 10 mM op een glazen glijbaan. Vat de druppel in door deze af te dekken met een cirkelvormige PDMS-kamer (diameter d = 5 mm, hoogte h = 250 μm).
2. Plaats de glazen schuif op een microscoopfase en stel de hele kamer voor 20 ms bloot aan een LED-balk met een golflengte van 395 nm (vermogen 295 mW) met behulp van een 4x-doelstelling (numeriek diafragma [NA] = 0,13).
3. Open de PDMS-kamer en haal een druppel (1 μL) eruit voor analyse met een UV-Vis spectrofotometer.
4. Herhaal stap 4.1−4.3 voor verschillende duur van LED-verlichting van 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (of tot verzadiging van de chemische reactie) en 0 s (om de achtergrond te verkrijgen). Repliceren van de procedure stappen 4.1−4.4 ten minste 3x (hier, 4x).
5. Uit het absorptiespectrum, extract van de waarde op 405 nm, die de piek in het absorptiespectrum van de kooi molecuul²¹vertegenwoordigen. Om de snelheid k van de chemische uncaging reactie door de LED-blootstelling¹⁴te bepalen, gebruikt u de volgende eerste-orde kinetiekvergelijking voor de numerieke pasvorm van de experimentele gegevens¹⁷
   
   waarbij C(t) is de waarde van het absorptiespectrum van de oplossing op 405 nm (na verwijdering van de achtergrond) met een ontwemuur tijd van t seconden. Voor kleine uncaging tijd t zodanig dat kt 1, Eq. 1 kan worden vereenvoudigd tot de lineaire formulering
   

5. Single Chemical-pulse Experiment

1. Houd het microfluïde kanaal 20 min onder vacuüm om de gasconcentratie in de PDMS te verminderen, zodat er minder kans is op bellen tijdens het vulproces.
2. Haal het kanaal uit de vacuümpomp en introduceer onmiddellijk deverdunde bacteriële suspensie in 1 mM MNI-gekooide- L-glutamaat in kunstmatig zeewater voorzichtig met behulp van een micropipetom om flagellarschade door mechanische schuifkrachten te voorkomen (hier duurde het hele vulproces 5-10 s). Na het vullen van het kanaal met de bacteriële suspensie, zuigen de oplossing in overmaat met papieren handdoek, en verzegelen inlaat en uitlaat met PDMS stekkers door zachtjes te drukken ze in de gaten.
   LET OP: Op deze manier wordt de vloeistofstroom in de kamer voorkomen.
3. Plaats het microkanaal op een microscoopfase en verplaats het podium om het gezichtsveld in het middenkanaal te plaatsen. Stel de microscoop in om beeldvorming in fasecontrast (4x doelstelling) uit te voeren met een framesnelheid van 12 fps.
   OPMERKING: Deze waarde kan worden gevarieerd, maar mag niet minder dan 10 fps zijn om de reconstructie van de bacteriële trajecten door middel van beeldanalyse mogelijk te maken (zie protocol sectie 7).
4. Stel het gaatje van de LED-balk op het minimale diafragma. Door de belichtingstijd van de camera op 5 s in te stellen, neemt u enkele frames op om nauwkeurige metingen te verkrijgen van de ruimtelijke locatie en grootte van de LED-balk.
   OPMERKING: De LED-lichtbron maakt verbinding met de epifluorescentie-verlichting van de microscoop via een vloeistoflichtgeleiderverbinding. De LED-balk heeft geen invloed op het vastleggen van video's, omdat video-acquisitie en LED-stimulatie onafhankelijk via software worden bevolen.
5. Voer continue beeldvorming uit gedurende een totale duur van 10 min (20 min voor de grootste chemische puls) en activeer tegelijkertijd de gerichte LED-balk op 395 nm voor de gewenste duur (in dit experiment, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) op een door de gebruiker gedefinieerd tijdpunt (hier, 10 s na het begin van de video-acquisitie) via microscoopsoftware. Om meerdere replicaties van hetzelfde proces te verkrijgen, verplaatst u het podium om de bacteriële respons over verschillende posities van het microfluïde kanaal vast te leggen. Repliceer deze procedure voor elke pulsgrootte, met behulp van een nieuw microkanaal.
   OPMERKING: Het uncagingproces genereert een asymmetrische cilindrische puls die radiaal naar buiten verspreidt in het beeldvormingsvlak.
6. Voer afzonderlijke experimenten uit zonder chemische ontwenning bij hogere vergroting (20x objectief, NA = 0,45) bij een hogere framerate (50 fps) om de onpartijdige zwembeweging van de bacterie vast te leggen.

6. Meervoudig experiment met chemische puls

1. Houd de millifluïde kamer 20 min onder vacuüm.
2. Plaats de petrischaal met de millifluïde kamer op een microscoopstadium. Vul de kamer onder het membraan met de verdunde bacteriële suspensie (hier duurde het hele vulproces 10−15 s) gfp-fluorescerende V. ordalii in 1 mM MNI-gekooide- L-glutamaatoplossing in kunstmatig zeewater. Na het vullen van het kanaal met de bacteriële suspensie, zuigen de oplossing in overmaat met papieren handdoek, en verzegelen inlaat en uitlaat met PDMS stekkers door zachtjes te drukken ze in de gaten.
   LET OP: Op deze manier wordt de vloeistofstroom in de kamer voorkomen. Om een betere visualisatie van bacteriën in deze setup mogelijk te maken waar de beeldvorming plaatsvindt via het nanoporeuze membraan, wordt het sterk aanbevolen om fluorescerende stammen te gebruiken in plaats van het wilde type (zoals gebruikt in het enkele chemische pulsexperiment).
3. Vul een spuit met een kunstmatige zeewateroplossing van 1mM MNI-gekooide- L-glutamaat en bevestig buizen aan de inlaat en uitlaat van het waskanaal boven het membraan.
4. Sluit de slang aan op een afvalreservoir en zorg ervoor dat de slang volledig in het vloeistofafvalreservoir wordt ondergedompeld om drukschommelingen te voorkomen.
5. Stel de juiste stroomsnelheid in op de spuitpomp (hier, 50 μL min^-1)om de gewenste gemiddelde stroomsnelheid in het waskanaal te verkrijgen, die afhankelijk is van de kanaalgeometrie.
6. Start de spuitpomp om de stroom in het waskanaal boven het membraan vast te stellen.
7. Voer de software uit die de LED-straal en microscoopfase regelt om door de gebruiker gedefinieerde sequenties van pulsen te genereren op verschillende locaties en met verschillende intensiteiten.
   OPMERKING: De continue stroom van de kunstmatige zeewateroplossing van 1mM MNI-gekooide- L-glutamaat in het waskanaal boven het membraan vult de gekooide samengestelde oplossing aan en wast het verbruikte medium uit de bacteriële arena.
8. Neem video op met behulp van een 4x-doelstelling op regelmatige tijdsintervallen over een periode van enkele uren en over meerdere aaneengesloten locaties om een groot oppervlak te bedekken (hier, 1 cm x 1 cm, figuur 1F).

7. Beeldanalyse en gegevensanalyse

1. Reconstructie van de bacteriële trajecten
   1. Uit de films opgenomen met de 4x doelstelling, reconstrueren de bacteriële trajecten met behulp van tracking software¹⁷.
      OPMERKING: Deze trajecten vertegenwoordigen de 2D-projecties van de 3D bacteriële beweging in het microkanaal.
   2. Bepaal vanuit de gereconstrueerde bacteriële trajecten de radiale driftsnelheid van elk zwemmend individu door zijn zwemsnelheid over de richting naar het midden van de chemische puls te projecteren (figuur 2D). Gebruik voor de visualisatie van de spatio-temporele dynamiek van de radiale driftsnelheid een binning-raster met een ruimtelijke grootte van 75 μm x 75 μm en tijdelijk venster van 5−10 s interval(figuur 2D,E).
      OPMERKING: Vanwege de cilindrische symmetrie van het proces kunnen gegevens worden geanalyseerd in polaire coördinaten en gemiddeld over de hoekdimensie(figuur 3).
   3. Bepaal vanuit de gereconstrueerde bacteriële trajecten de spatio-temporele dynamiek van de verdeling van bacteriën als ze reageren op de chemische pulsen(figuur 2E).
   4. Uit de films met een hogere resolutie die tijdens de single-pulse-experimenten met de 20x-doelstelling zijn opgenomen, wordt de verdeling van de zwemsnelheid geëxtraheerd en de looptijd van de bacteriële populatie als ze reageren op de chemische puls (figuur 4).
2. Schat de diffusiecoëfficiënt van bacteriën door rekening te houden met de dissipatiedynamiek van de bacteriële populatie nadat chemotaxis is voltooid¹⁷ (hier, voor t > 300 s; Figuur 3).
3. Schat de diffusiecoëfficiënt van glutamaat door de Stokes-Einstein vergelijking toe te passen
   
   waarbij wordt aangenomen dat de aminozuurmoleculen bolvormige deeltjes zijn met een hydrodynamische straal²²r_G, k_B is de Boltzmann-constante (1,38 x 10^-23 m² kg s^-2 K^-1), T is de temperatuur (296 K), en η is de dynamische viscositeit van het kunstmatige zeewater (zoutgehalte 36 g kg^-1) bij 23 °C (10^-3 Pa s)²³

Resultaten

We gebruikten de microfluïde en millifluïde apparaten(figuur 1)om bacteriële accumulatieprofielen te bestuderen onder dynamische voedingscondities. Bacteriële trajecten werden geëxtraheerd uit opgenomen video's die werden verkregen door fasecontrastmicroscopie van de accumulatie-dissipatiedynamiek van een bacteriële populatie na een chemische puls die werd vrijgegeven door fotolyse (figuur 2 en figuur 3). Door het gemiddeld van milj...

Discussie

Deze methode stelt onderzoekers in staat om bacteriële chemotaxis te bestuderen onder gecontroleerde, dynamische gradiënten in micro- en millifluïdische apparaten, waardoor reproduceerbare gegevens kunnen worden verkregen. De bijna ogenblikkelijke creatie van chemische pulsen op microschaal door fotolyse heeft tot doel de soorten voedingspulsen te reproduceren die bacteriën in het wild tegenkomen uit een reeks bronnen, bijvoorbeeld de verspreiding van pluimen achter zinkende mariene deeltjes²⁵, of...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(3-Aminopropyl) triethoxysilaan (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% zuiverheid, zeer giftig
CELLSTAR buis	Greiner Bio-One	210261	50 ml
Centrifuge	Eppendorf	5424R	om afgewerkt media uit de bacteriecultuur te elimineren
Digitale incubatoren Incu-Line	VWR-CH	390-0384	om 3D master te bakken
Duster	VWR-CH	16650-22	om de wafer en microkanalen schoon te maken
Heet plaatje	VWR-CH	444-0601	om de microkanalen te verbinden
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe micro centrifuge buizen	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		voor beeldanalyse en bacterietraceerbaarheid
Microcentrifuge buis	Eppendorf	30120086	1.5 ml
Microscoopglasplaatje	VWR-CH	631-1552
Microscoop Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	met gemotoriseerde stage
MNI-Glutamaat	Tocris Bioscience	1490	>98 % zuiverheid, lichtgevoelig
Matrijsprintapparatuur	Stratasys		Objet30 3D-printer
Matrijsprintservice	3D Printing Studios	Aangepast	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	om de uncaging te kalibreren
NIS Elements	Nikon Instruments		Microscoopbeeldsoftware
Oven Venti-Line	VWR-CH	466-3516	om PDMS te bakken (met geforceerde convectie)
Fotoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Plasmakamer Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	om de oppervlakken te functionaliseren voordat ze worden verbonden
Polycarbonaatmembraan	Sterlitech	PCT0447100	0,4 µm poriegrootte, 19 % open gebied, 24 µm dikte
Polyethyleen microbuis	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	I.D. x O.D.: 0,015" x 0,043" / 0,38mm x 1,09mm
Polystyreen petrischaal	VWR-CH	25373-100	onderzijde (90 mm x 15 mm) om het millifluidisch apparaat te verbinden
Schaal	VWR-CH	611-2605	om PDMS-mengsel te wegen
sCMOS-camera Andor Zyla	Oxford Instruments		voor fasecontrast en fluorescentiemicroscopie (max 100 fps)
Zeezoutje	Instant Ocean	Productnr. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		Gebruikt om de mal te ontwerpen
Spectra X-lichtmotor	Lumencolor		voor LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Si Elastomer Kit; verhardingsmiddel
Spuit (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Spuitnaald	Agani	A228	van 10 tot 30 ml
Spuitpomp 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Dubbele spuitpomp
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Matrijsmateriaal