Methodenartikel

Een vertraagde inenting model van chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60599

⸱

20 februari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Infectious Diseases, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Immunology, Stanford University, 3Palo Alto Veterans Institute of Research

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een vertraagd inentingsprotocol voor het genereren van chronische wondinfecties bij immunocompetente muizen.

Samenvatting

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is een belangrijke nosocomiale ziekteverwekker van toenemende relevantie voor de menselijke gezondheid en ziekte, met name bij het instellen van chronische wondinfecties bij diabetes en gehospitaliseerde patiënten. Er is dringend behoefte aan chronische infectiemodellen om te helpen bij het onderzoek naar wondpathogenese en de ontwikkeling van nieuwe therapieën tegen deze ziekteverwekker. Hier beschrijven we een protocol dat 24 uur na het voldikte excisional verwonden gebruik maakt van vertraagde inenting. De infectie van de voorlopige wondmatrix die op dit moment aanwezig is, verhindert ofwel snelle klaring of verspreiding van infectie en zorgt in plaats daarvan voor chronische infectie die 7-10 dagen duurt zonder dat er geen vreemde materialen of immuunonderdrukking nodig zijn. Dit protocol bootst een typisch temporele loop van postoperatieve infectie bij mensen na. Het gebruik van een lichtgevende P. aeruginosa stam (PAO1:lux) maakt een kwantitatieve dagelijkse beoordeling van bacteriële last voor P. aeruginosa wondinfecties mogelijk. Dit nieuwe model kan een nuttig instrument zijn in het onderzoek naar bacteriële pathogenese en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor chronische P. aeruginosa-wondinfecties.

Inleiding

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is een gram-negatieve staafvormige bacterie met toenemende relevantie voor de menselijke gezondheid en ziekte. Het is verantwoordelijk voor uitgebreide morbiditeit en mortaliteit in nosocomiale omgevingen, met name met wondinfecties bij immuungecompromitteerde patiënten1,2. De opkomst van multiresistente stammen van deze ziekteverwekker heeft een verdere impuls gegeven voor onderzoek naar factoren die bijdragen aan p. aeruginosa virulentie, mechanismen van P. aeruginosa antibioticaresistentie, en nieuwe methoden voor preventie en behandeling van deze dodelijke infectie3. Als zodanig is de behoefte aan diermodellen van chronische wondinfectie als instrumenten voor het onderzoeken van deze onderzoeksvragen nog nooit zo groot geweest.

Helaas hebben veel diermodellen van P. aeruginosa-infectie de neiging om acute infectie te simuleren met een snelle oplossing van infectie of snelle afname als gevolg van sepsis4,5, die de vaak chronische aard van deze infecties niet voldoende simuleert. Om dit nadeel aan te pakken, maken sommige modellen gebruik van de implantatie van vreemde lichamen zoals agarkralen, siliconenimplantaten of alginaatgels6,7,8. Andere modellen maken gebruik van muizen die immuungecompromitteerd zijn als gevolg van gevorderde leeftijd, obesitas of diabetes, of via farmacologische middelen zoals cyclofosfate-geïnduceerde neutropenie9,10,11,12. Echter, ofwel het gebruik van vreemde materialen of immuun gecompromitteerde gastheren waarschijnlijk verandert de lokale ontstekingsproces, waardoor het moeilijk is om een goed begrip van de pathofysiologie die betrokken zijn bij chronische wondinfecties in gastheren met anders normaal immuunsysteem te krijgen.

We hebben een chronisch model van P. aeruginosa wondinfectie bij muizen die vertraagde inenting met bacteriën na excisional wond impliceert. Vertraagde inenting maakt experimenten met bacteriële last en zich uitstrekt tot ten minste 7 dagen mogelijk. Dit model opent nieuwe mogelijkheden voor het onderzoeken van zowel pathogenese als nieuwe behandelingen van P. aeruginosa chronische infecties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC) van Stanford University.

1. Voorbereiding en groei van bacteriën

  1. Voer al het werk met P. aeruginosa en dieren met BSL-2 voorzorgsmaatregelen volgens de onderzoekers institutionele bioveiligheid comite en dier gebruik comité richtlijnen. Doen alle stappen beschreven hier met Betrekking tot P. aeruginosa, met inbegrip van muis inenting, in een bioveiligheid kabinet.
  2. De lichtgevende PAO1:lux stam van P. aeruginosa is op verzoek verkrijgbaar in ons lab. Streak PAO1, opgeslagen als bevroren glycerol voorraad, op Lysogeny Broth (LB) agar. Voor de lichtgevende PAO1:lux-stam moet LB agar selectieve antibiotica bevatten (100 μg/mL carbenicillin en 12,5 μg/mL kanamycine). Groei 's nachts bij 37 °C in een bacteriële couveuse.
  3. Kies een geïsoleerde kolonie en groei 's nachts bij 37 °C in 3 ml LB medium, pH 7.4. Voor lichtgevende stammen moet bouillon 100 μg/mL carbenicillin bevatten. Groeien onder schudden, aërobe omstandigheden.

2. Procedurevoorbereiding

  1. Laat al het personeel het uitvoeren van een operatie dragen een schone jurk / Lab jas, gezichtsmasker, haarnet, en handschoenen.
  2. Autoclave alle chirurgische instrumenten, met inbegrip van schaar en tangen. Gebruik aseptische techniek om gereedschappen tussen dieren te steriliseren.
  3. Maak de chirurgische tafel schoon met ethanol en bereid een schoon chirurgisch veld voor.

3. Ontharing

  1. Verdoven 8-12 week oude C57BL/6J muizen met behulp van 1%-3% isoflurane. Onderzoekers moeten volgen hun instelling veterinaire personeel richtlijnen voor anesthesie bij het gebruik van isoflurane.
    1. Begin anesthesie door het leveren van 1%-3% isoflurane en pas de zuurstofstroom snelheid aan 1,5 L /min. Plaats de muis in de inductiekamer.
    2. Knijp de teen van de muis om de diepte van anesthesie te beoordelen. Wanneer de muis niet meer reageert op stimulatie, verwijder het uit de inductiekamer en plaats deze op de chirurgische bank met zijn neus in de isoflurane neuskegel.
    3. Breng oculair smeermiddel aan op beide ogen.
  2. Weeg de muis om een basislijn pre-procedure gewicht te verkrijgen.
  3. Plaats de muis in een gevoelige positie. Injecteer de muis onderhuids met voorverwarmde steriele 0,9% natriumchloride, 250 μL aan elke flank voor een totaal van 500 μL.
  4. Scheer het ruggebied van de muis met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Scheren moet op een andere locatie dan het chirurgische station optreden om haarbesmetting van de wond te voorkomen.
  5. Breng een dun laagje ontharingslotion aan. Laat de lotion zitten voor 20-60 s. Verwijder het haar en overtollige lotion met gaas bevochtigd in warm water. Na ontharing gaat u over tot de excisional eerprocedure.

4. Volledige dikte excisional wondchirurgie

  1. Injecteer aanhoudende afgifte buprenorfine 0,6–1 mg/kg onderhuids met behulp van een 25 G naald in het midden van de rugstreek van de muis. Slow release buprenorfine biedt pijnverlichting over 48-72 uur.
  2. Desinfecteer de chirurgische plaats. Veeg het dorsale oppervlak af met een steriel betadine-wattenstaafje. Veeg overtollige betadine af met een steriel alcoholuitstrijkje. Dit moet 3 keer worden uitgevoerd (afwisselend tussen betadine en alcohol), wattenstaafjes door van het centrum op een cirkelvormige manier naar de rand te gaan. Laat het gebied drogen.
  3. Maak een gordijnen rond de chirurgische site met behulp van steriele gaas of plastic vastklampen wrap.
  4. Rek de huid strak strak. Gebruik een steriele huidbiopsiepunch met een diameter van 6 mm om een eerste incisie te maken via de linker rugopperhuid. Herhaal op de rechter rugopperhuid.
  5. Gebruik tangen om de huid tent vanuit het midden van de linker geschetste wond gebied. Accijnzen de epidermale en dermale lagen met behulp van schaar. Herhaal op het recht geschetste wondgebied om symmetrische excisional wonden te creëren.
  6. Was wonden met 50 μL steriele zoutlijn. Laat de chirurgische plaats en de omliggende huid drogen. Bedek vervolgens de wonden en het dorsum met een transparante filmdressing.
  7. Plaats de muis terug in een schone kooi. Huis 1 dier per kooi.
  8. Plaats de kooi op een verwarmingskussen en monitor tot de muis wakker wordt.
  9. Bij het uitvoeren van de bovenstaande operatie op meerdere dieren, gebruik maken van een hete kraal sterilisator om alle chirurgische instrumenten tussen dieren schoon te maken.
  10. Laat 24 uur voor de muizen om te herstellen van de chirurgische ingreep en voor de vorming van een voorlopige wondmatrix over de wonden voorafgaand aan de procedure inenting met bacteriën.

5. Inenting met P. aeruginosa

  1. Verdun 's nachts PAO1:lux cultuur tot OD600 = 0,05 in 75 mL LB media met 100 μg/mL carbenicillin en laat de bacteriën groeien totdat de cultuur zich in een vroege exponentiële fase bevindt (OD600 ∙ 0,3). Dit duurt ongeveer 2-3 uur.
  2. Verdun PAO1:lux in PBS tot een concentratie van (7,5 ± 2,5) x 102 CFU/mL. Zorg ervoor dat overtollige inoculum voor te bereiden om voldoende volume te garanderen en voor beplating na het experiment. Als het vervoer tussen faciliteiten (d.w.z. van het laboratorium naar het vivarium), gebruik dubbele insluiting in een lek bewijs doos duidelijk gemarkeerd Biohazard.
  3. Voer al het werk uit met P. aeruginosa en muizen met behulp van goedgekeurde persoonlijke beschermingsmiddelen in een dierbioveiligheidsniveau 2 (ABSL-2) goedgekeurde biologische veiligheidskast (BSC). Herbruikbare apparatuur, zoals de weegschaal, moet worden bedekt met kleeffolie om verontreiniging te voorkomen.
  4. Verdovende isoflurane met behulp van 3% isoflurane zoals hierboven beschreven. Weeg de muis en neem het gewicht op. Injecteer de muis onderhuids met voorverwarmde steriele 0,9% natriumchloride, 250 μL aan elke flank voor een totaal van 500 μL.
  5. Als de transparante filmdressing van de muis 's nachts is uitgeschakeld, verwijder dan de resulterende korst voorzichtig en trek een nieuwe dressing aan.
  6. Gebruik een 500 μL tuberculine 27 G veiligheidsdopspuit om 40 μL van de PAO1:lux suspensie te injecteren door de transparante foliedressing in elke wond. Verschillende muizen moeten worden gebruikt voor niet-ingeënte/PBS-wondcontroles om kruisbesmetting van de contralaterale kant te voorkomen.
  7. Plaats de muis terug in de kooi op een verwarmingskussen en monitor totdat hij wakker wordt. Alle muizen moeten individueel in aparte kooien worden ondergebracht om kruisbesmetting te voorkomen.
  8. Zorg voor calorierijke voedingssupplement pasta ingeklemd tussen voedsel pellets op de vloer van de kooi.
  9. Gebruik het resterende inoculum om een LB agar plaat streep. Tel kolonies om het aantal toegediende bacteriën te bevestigen.

6. In vivo beeldvorming van geïnfecteerde wonden

  1. Volg BSL-2 containmentprotocollen voor het vervoer van muizen van en naar het beeldinstrument, inclusief het gebruik van een secundaire container. Zorg ervoor dat geen dierlijk beddengoed wordt overgebracht of laten vallen tijdens de overdracht van de muis naar de inductiekamer of het beeldvormingsinstrument.
  2. Induceer anesthesie van de muis met ingeademde 1%–3% isoflurane in een inductiekamer zoals beschreven in stap 3.1.
  3. Zodra de muis is verdoofd, plaats het in gevoelige positie in de beeldkamer van een optisch beeldvormingssysteem met de neus in de isoflurane neuskegel.
  4. Open het softwareprogramma.
  5. De acquisitieparameters variëren afhankelijk van het aantal dieren dat tegelijkertijd wordt afgebeeld en de intensiteit van bioluminescentie. De basisparameters die moeten worden ingesteld zijn belichtingstijd, binning, f/stop en gezichtsveld (FOV). Onze standaard startinstellingen zijn belichtingstijd 30 seconden, binning low (2), f/stop 1.2 en FOV 25. Pas deze instellingen zo nodig aan, afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker.
  6. Analyseer luminescentiegegevens met behulp van een beeldvormingsprogramma (zie Tabel met materialen). Luminescentie zal worden weergegeven als een pseudocolor beeld bedekt op een kleurenfoto van de muizen.
    1. Maak een regio van belang (ROI) op de wondplaats en meet de gemiddelde flux (fotonen/seconde) gedetecteerd. Houd er rekening mee dat gegevens ook kunnen worden gerapporteerd als uitstraling (fotonen/seconde/cm²/steradian), maar zolang de afstand van het beeldplatform van de camera constant blijft tussen beeldvorming, is flux voldoende.
    2. Meet de achtergrond door een ROI te maken op een willekeurig gebied op het imagingplatform. Trek het achtergrondnummer van fotonen/seconde af.
    3. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet voor verdere analyse.
  7. Voer beeldvorming zoals hierboven beschreven zo vaak als dagelijks om infectie progressie bij te houden.

7. Postoperatief beheer

  1. Monitor muizen volgens richtlijnen die zijn vastgesteld door het IACUC-protocol van de onderzoeker. We monitoren alle muizen dagelijks gedurende de eerste 4 dagen, dan om de andere dag tot het einde van het experiment. Weeg de muizen eenmaal per dag voor de eerste 4 dagen na de operatie in een BSC. Injecteer 250 μL van 0,9% natriumchloride onderhuids op de post-infectiedagen 1 en 2.
  2. Controleer op tekenen van pijn / nood bij de muizen, met inbegrip van gebogen houding, smerig jas, lethargie, moeite met ademhalen, gezichtsgrimas, en gewichtsverlies.
  3. Als dieren tekenen vertonen van een verslechterende gezondheid, neem dan contact op met een dierenarts. Elke muis die lijkt te vertonen verergerende tekenen van pijn / nood en een gewichtsverlies van 20% of meer moet worden geëuthanaseerd.

8. Wondexcisie

  1. Offer aan het einde van het experiment de muizen op met CO 2-inademing, gevolgd door cervicale dislocatie. Gooi het karkas van het dier weg volgens de ABSL-2-protocollen van de instelling.
  2. Accijns wondbedden met behulp van steriele schaar en tangen in een BSC. Plaats elk wondbed in 1 mL steriel PBS in een polypropyleenbuis van 1,5 mL. Hak het wondweefsel fijn met een schaar. Alle wonden moeten worden behandeld als ASBL-2, zelfs als ze niet als besmet worden beschouwd.
  3. Incubeer op een shaker bij 300 tpm voor 2 uur bij 4 °C. Vortex elke buis voor 10 s en serieel verdunnen van de bacteriële effluent in PBS. Bekeer het verdunde bacteriële effluent op LB agar om de bacteriële last op te sommen.
  4. Overweeg wonden besmet als luminescent signaal in de wond is boven de achtergrond luminescentie en meer bacteriën worden gedetecteerd in de wond effluent dan in wonden ingeënt met PBS als controle.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van een lichtgevende stam van PAO1 met een plasmid codering van de luxABCDE reporter systeem (PAO1:lux), voerden we excisional verwonden op muizen, ingeënt deze wonden met planktonische P. aeruginosa 24 uur later, en gemeten bacteriële last na verloop van tijd(Figuur 1 en figuur 2). Een representatief beeld verkregen met behulp van een imaging optisch systeem toont aan dat dit model resulteert in detecteerbare...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een nieuwe vertraagde inenting P. aeruginosa wondinfectie model. De strategie van het uitstellen van inenting met bacteriën tot 24 uur na excisional wondwond maakt de evaluatie van wondinfecties over een tijdsbestek van 1 week mogelijk. Door gebruik te maken van een lichtgevende stam van P. aeruginosa,is het mogelijk om infectieprogressie tijdens de infectiecursus te volgen. Het langere verloop van de infectie in vergelijking met andere P. aeruginosa infectie modellen zal nieuwe mogel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen bekend te maken.

Dankbetuigingen

De pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 luminescente constructvector was een genadig geschenk van J. Hardy. Schema's zijn gemaakt met BioRender.com. Wij danken het lab van G. Gurtner voor hun advies over het wondinfectie model. We danken T. Doyle van het Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging ook voor zijn technische expertise. Dit werk werd ondersteund door subsidies R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, en subsidies van Stanford SPARK, de Falk Medical Research Trust en de Cystic Fibrosis Foundation (CFF) aan P.L.B. C.R.D. werd ondersteund door T32AI007502. Een Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering en een Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship ondersteund J.M.S.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% Sodium Chloride injectieHospira2484457
18 G x 1 steriele naaldBD305195
25 G x 1 1/5 steriele naaldBD305127
Alcohol wattenstaafjeBD326895
Aura Imaging SoftwareSpectral Instruments Imagingn/a
BetadinePurdue Frederick Company19-065534
Buprenorfine SR LABZoopharmn/a
C57BL/6J mannelijke muizenThe Jackson Laboratory000664
Wegwaarpuns voor wegwerpbiopsie, 6 mmIntegra33-36
Fijne schaar - Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09
Glaskralen DroogsterilisatorHarvard Apparatus61-0183
Gegranuleerde AgarFisher BioReagentsBP9744
VerwarmingskussenMilliard804879481218
Insulinespuit met 28 G naaldBD329461
Lago X Imaging SystemSpectral Instruments Imagingn/a
LB-brothFisher BioReagentsBP1426
Leur-Lok 1 mL-seringBD309628
Mini Arco DierentrimmerWahl Professional919152
Nair Haarverwijderingslotion met Baby OilChurch and Dwightn/aBeschikbaar in elke apotheek
OctagontangFine Science Tools11041-08
PetrischaalFalcon351029
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1xCorning21-040-CV
Press and Seal PlasticfolieGladn/a
SafetyGlide Insulinespuit met 30 G naaldBD305934
Safetyglide Insulinespuit, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TWBD305934
WeegschaalOhaus Scout ProSP202
Supplical voedingssupplementHenry Schein Animal Health29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm3M1624W

Referenties

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85 (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838(2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. , (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363 (6434), (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bioluminescente beeldvormingkolenietellingfull thickness wondcreatiebacteri le lastchronisch infectiemodelgastheer pathogeeninteractiesBSL 2 veiligheid

Gerelateerde artikelen