Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Monoculaire visuele ontbering en oculaire dominantie plasticiteit meting in de muis primaire visuele cortex

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60600

⸱

8 februari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Clinical Hospital of Chengdu Brain Science Institute, MOE Key Lab for NeuroInformation, University of Electronic Science and Technology of China, 2Sichuan Institute for Brain Science and Brain-inspired Intelligence, 3Department of Electronic Engineering, City University of Hong Kong, 4Centre for Biosystems, Neuroscience, and Nanotechnology, City University of Hong Kong

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor monoculaire visuele ontbering en oculaire dominantie plasticiteit analyse, die belangrijke methoden voor het bestuderen van de neurale mechanismen van visuele plasticiteit tijdens de kritieke periode en de effecten van specifieke genen op visuele ontwikkeling.

Samenvatting

Monoculaire visuele ontbering is een uitstekend experimenteel paradigma om primaire visuele corticale respons plasticiteit induceren. In het algemeen is de reactie van de cortex op het contralaterale oog op een stimulus veel sterker dan de respons van het ipsilaterale oog in het verrekijkersegment van de primaire visuele cortex van de muis (V1). Tijdens de zoogdierkritische periode zal het hechten van het contralaterale oog resulteren in een snel verlies van responsiviteit van V1-cellen tot contralaterale oogstimulatie. Met de voortdurende ontwikkeling van transgene technologieën gebruiken steeds meer studies transgene muizen als experimentele modellen om de effecten van specifieke genen op oculaire dominantie (OD) plasticiteit te onderzoeken. In deze studie introduceren we gedetailleerde protocollen voor monoculaire visuele deprivatie en berekenen we de verandering in OD-plasticiteit bij muis V1. Na monoculaire ontbering (MD) gedurende 4 dagen tijdens de kritieke periode, worden de oriëntatiestemkrommen van elk neuron gemeten en worden de stemcurven van laag vier neuronen in V1 vergeleken tussen stimulatie van de ipsilaterale en contralaterale ogen. De contralaterale bias index (CBI) kan worden berekend met behulp van de oculaire OD-score van elke cel om de mate van OD-plasticiteit aan te geven. Deze experimentele techniek is belangrijk voor het bestuderen van de neurale mechanismen van OD plasticiteit tijdens de kritieke periode en voor het onderzoeken van de rollen van specifieke genen in neurale ontwikkeling. De belangrijkste beperking is dat de acute studie de verandering in neurale plasticiteit van dezelfde muis niet op een ander tijdstip kan onderzoeken.

Inleiding

Monoculaire visuele ontbering is een uitstekend experimenteel paradigma om V1 plasticiteit te onderzoeken. Om het belang van visuele ervaring in neurale ontwikkeling te bestuderen, David Hubel en Torsten Wiesel1,2 beroofde kittens van normaal zicht in een oog op verschillende tijdstippen en voor verschillende perioden van tijd. Vervolgens zagen ze de veranderingen in de reactieintensiteit in V1 voor de achtergestelde en niet-achtergestelde ogen. Hun resultaten toonden een abnormaal laag aantal neuronen reageren op het oog dat was gehecht gesloten in de eerste drie maanden. Echter, de reacties van de neuronen in de kittens bleef identiek in alle opzichten aan die van een normale volwassen kat het oog dat werd gehecht gesloten voor een jaar, en de kittens niet herstellen. MD bij volwassen katten kan geen OD plasticiteit veroorzaken. Daarom is de impact van visuele ervaring op V1 bedrading sterk tijdens een korte, goed gedefinieerde fase van ontwikkeling, voor en na welke dezelfde stimuli minder invloed hebben. Een dergelijke fase van verhoogde gevoeligheid voor visuele input staat bekend als de kritieke periode in de visuele cortex.

Hoewel de muis is een nachtdier, individuele neuronen in muis V1 hebben vergelijkbare eigenschappen als neuronen gevonden in katten3,4,5. In de afgelopen jaren, met de snelle ontwikkeling van transgene technologie, hebben een toenemend aantal studies in de visuele neurowetenschappen muizen gebruikt als experimenteel model6,7,8. In muis visuele studies, neurowetenschappers gebruiken mutanten en knock-out muislijnen, die controle over de genetische samenstelling van de muizen mogelijk te maken. Hoewel muizen V1 geen OD-kolommen hebben, vertonen enkele neuronen in de V1-verrekijkerzone significante OD-eigenschappen. De meeste cellen reageren bijvoorbeeld sterker op contralaterale stimulatie dan op ipsilaterale stimulatie. Tijdelijke sluiting van één oog tijdens de kritieke periode leidt tot een aanzienlijke verschuiving in de OD-indexverdeling9,10,11. Daarom kan MD worden gebruikt om een OD-plasticiteitsmodel op te zetten om te onderzoeken hoe genen die betrokken zijn bij neurale ontwikkelingsstoornissen corticale plasticiteit in vivo beïnvloeden.

Hier introduceren we een experimentele methode voor MD en stellen we een veelgebruikte methode (elektrofysiologische opname) voor om de verandering in OD-plasticiteit te analyseren tijdens monoculaire visuele deprivatie. De methode wordt al meer dan 20 jaar op grote schaal gebruikt in veel laboratoria12,13,14,15,16. Er zijn andere methoden die worden gebruikt bij het meten van de OD plasticiteit ook, zoals chronische visuele opgeroepen potentieel (VEP) opname17, en intrinsieke optische beeldvorming (IOI)18. Het grote voordeel van deze acute methode is dat het gemakkelijk te volgen is, en de resultaten zijn opmerkelijk betrouwbaar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

In dit protocol werden mannelijke C57Bl/6 muizen verkregen van het Institute of Laboratory Animals van de Sichuan Academy of Medical Sciences en het Sichuan Provincial People's Hospital. Alle dierverzorging en experimentele procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee, University of Electronic Science and Technology of China.

1. Monoculaire ontbering (MD) op postnatale dag 28 bij muizen

  1. Doe de chirurgische gereedschappen, de hechtingsnaald (0,25 mm diameter, snaardiameter 0,07 mm) en wattenstaafjes in een aluminium doos en autoclave ze op 120 °C voor 0,5 uur. Steriliseren van de kap met 75% ethanol. Droog de chirurgische gereedschappen in een droogoven.
  2. Bereid een 2% agarose oplossing, zet het in een waterbad op 75 °C om te voorkomen dat versteviging.
  3. Gebruik isoflurane gemengd met zuurstof om de muis te verdoven (2% inductie en 1,2-1,5% onderhoud). Bevestig de muis op het stereotaxic-apparaat en gebruik een warmteregulerend apparaat om de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C te houden en onderkoeling te voorkomen.
  4. Breng een dunne laag van aardolie-gebaseerde oogzalf aan beide ogen.
  5. Onder de anatomische microscoop met verlichting, hechting van het ooglid op een oog. Laat de naald passeren door beide zijden van het ooglid 2x(figuur 1A)en maak ongeveer vier steken.
  6. Knoop de draad 2-3x en dan trim de draad. Breng 3 μL instant drogende lijm aan op de knoop om de stabiliteit te vergroten. Snijd vervolgens de extra hechtende draad.
  7. Geef de muis een intraperitoneale injectie van buprenorfine (1 mg/kg).
  8. Breng de muis op een verwarmingskussen om zijn lichaamstemperatuur op 37 °C te houden en onderkoeling te voorkomen en te controleren totdat hij weer bij bewustzijn komt.
  9. Wanneer de muis volledig wakker is plaats het in een aparte houdkooi.
  10. Controleer de oogleden dagelijks om ervoor te zorgen dat ze gesloten en onbesmet blijven. Sluit de muis uit als er een ooglidopening wordt gevonden.
  11. Gebruik voor elektrofysiologische opname isoflurane vermengd met zuurstof om de muis te verdoven (2% inductie en 1,2-1,5% onderhoud).
  12. Verwijder de steken met een oogschaar om de oogbol bloot te leggen. Snijd de oogleden zorgvuldig af.
  13. Spoel het oog met lens oplossing en controleer het oog onder een microscoop voor de duidelijkheid. Sluit muizen met hoornvliesopacities of tekenen van infectie uit.

2. Craniotomie in de muis V1 verrekijker regio na monoculaire ontbering op de 4e dag

  1. Na het verdoven van de muis, controleer op de diepte van anesthesie door het gebrek aan reactie op een teen knijpen.
  2. Plaats en bevestig de muis op het stereotaxic-apparaat. Pas de hoogte van de oorstaaf en tandstaaf aan om de hersenen plat en stabiel te houden.
  3. Gebruik een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te behouden.
  4. Breng een op aardolie gebaseerde oogzalf aan op het oppervlak van de ogen om ze vochtig te houden.
  5. Verwijder het haar op het hoofd van de muis om de huid bloot te leggen. Wrijf de huid met afwisselendscrubs jodium en 70% ethanol 3x.
  6. Inciseer een 8 x 8 mm gebied van de huid tussen de oren om de schedel bloot te leggen en het hoofdhuidweefsel te verwijderen. Verwijder vervolgens het bovenliggende bindweefsel met 30% waterstofperoxide.
  7. Boor een gat van 1 x 1 mm in de schedel boven het cerebellum. Breng een kleine botschroef in het gat als referentie.
  8. Voer een kleine craniotomie van 1 mm in diameter uit in het V1-verrekijkergebied van het contralaterale halfrond tot het achterstandsoog(figuur 1B, A-P: lambda -0,51-lambda +1,67 mm; M-L: -2,6– -3,0 mm; D-V: 0-1 mm). Verwijder voorzichtig het schedelfragment zonder de hersenen te kwetsen.
  9. Bedek het blootgestelde corticale oppervlak met 75 μL van 2% agarose bij 40 °C om uitdroging te voorkomen.
  10. Bevestig een wolfraamelektrode op het stereotaxic frame. Plaats de wolfraamelektrode verticaal op het oppervlak van de blootgestelde cortex, het verrekijkergebied van V1, om ervoor te zorgen dat de cellen die worden geregistreerd op beide ogen reageren.
  11. Gebruik wattenstaafjes om de ooggel te verwijderen en breng siliciumolie om de 2 uur op het oog.

3. Visuele stimulatie en elektrofysiologische opname

  1. Masker het ene oog met niet-transparante plastic plaat. Plaats een LCD-monitor op 23 cm van het oog van de muis.
  2. Verlaag de anesthesie tot 0,5-0,8% wanneer de muis volledig is verdoofd.
  3. Advance de micro-elektrode elektrode langzaam met een olie hydraulische micromanipulator. Stop het wanneer een hoge signaal-ruisverhouding wordt waargenomen en de elektrode wordt doorontwikkeld tot laag 4 (figuur 1C, ongeveer 250-450 μm in de diepte). Zorg ervoor dat de versterkingsfactor is ingesteld op 1.000, het filter op 300-100 Hz en de monstersnelheid op 40 Hz.
  4. Presenteer een full-field bewegende sinusoïdale rooster (Figuur 1D, 12 richtingen, 100% contrast, 2 Hz tijdelijke frequentie, 0,04 cycli per mate van ruimtelijke frequentie) op de LED-monitor.
  5. Meet de respons van de cel door het ipsilaterale en contralaterale oog afzonderlijk te stimuleren. Huidige 3-5x totaal.
  6. Meet de reacties van vijf tot acht cellen in elke penetratie. Voer vier tot zes penetraties in elke muis uit.
  7. Pas na de opname de isofluranestroomsnelheid aan tot 5% of meer, ga gedurende 1 min door met isoflurane blootstelling en voer vervolgens de cervicale dislocatie uit.
    OPMERKING: Afzonderlijke penetraties werden ten minste 200 μm uit elkaar verdeeld in de V1 verrekijkerzone.

4. Off-line spike sorting en data-analyse

  1. Detecteer pieken wanneer het ruwe signaal een drempelniveau overschrijdt. Lijn gevangen pieken uit op de eerste positieve of negatieve piek. Gebruik software om pieken uit verschillende cellen te detecteren.
  2. Stel twee cursors in: een voor positief en de andere voor negatieve afbuiging. Stel de spikesjabloon in (figuur 2A). Stel het sjabloongebied daarop in met de belangrijkste variatie tussen verschillende klassen spikes.
  3. Gebruik hoofdcomponentanalyse om ze te scheiden in clusters. Clustermethoden kunnen variëren tussen verschillende laboratoria.
  4. Classificeer de piek van een grens met behulp van het K-means algoritme.
  5. Correleer de oriëntatie met de spike firing rate en plot de oriëntatie tuning curven voor de ipsilaterale en contralaterale oog.
  6. Bereken de OD-index voor de eenheid, die de contralaterale/ipsilaterale responssterkteverhouding vertegenwoordigt:
    figure-protocol-1
    waar Rcontra en Ripsi de optimale respons van de cel zijn voor respectievelijk het contralaterale en ipsilaterale oog, en Rspon de spontane activiteit van de cel is.
  7. Wijs OD-scores als volgt toe aan 1-7: − 1 tot −0,75 = 1; −0,75 tot −0,45 = 2; −0,45 tot −0,15 = 3; −0,15 tot 0,15 = 4; 0,15 tot 0,45 = 5; 0,45 tot 0,75 = 6; en 0,75 tot 1 = 7.
  8. Bereken de contralaterale bias-index (CBI):
    figure-protocol-2
    waarbij N het celnummer is en nx gelijk is aan het celgetal met OD-scores gelijk aan x.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier beschreven experimentele resultaten maken succesvolle MD- en OD-plasticiteitsmetingen mogelijk van een beroofde en niet-achtergestelde muis tijdens de kritieke periode (P19-P32). Figuur 1 laat zien hoe single unit opnames uit te voeren in laag 4 van V1 de verrekijker zone voor het vergelijken van reacties in de ipsilaterale en contralaterale oog 4 dagen na MD. Figuur 2 toont de spike sorting en oriëntatie tuning metingen voor het stimuleren van de ipsila...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteren een gedetailleerd protocol voor MD en het meten van OD plasticiteit door single unit opname. Dit protocol wordt veel gebruikt in de visuele neurowetenschappen. Hoewel het MD-protocol niet ingewikkeld is, zijn er enkele kritieke chirurgische ingrepen die zorgvuldig moeten worden gevolgd. Ten eerste zijn er twee belangrijke details die de kwaliteit van de stiksels garanderen. De hechting is voldoende stabiel als de steken geconcentreerd zijn in het mediale gedeelte van het ooglid. Bovendien wordt 3 μL lijm o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81571770, 81771925, 81861128001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
502 lijmM&G Chenguang Stationery Co., Ltd.AWG97028
Acquizition kaartNational InstrumentPCI-6250
AgaroseBiowestG-10
VersterkerA-M systeemModel 1800
AtropineAladdin Bio-Chem Technology Co., LtdA135946-5
Brain Stereotaxic ApparaatRWD Life Science Co.,Ltd68001
Cohan-Vannas veerschaarFine Science Tools15000-02
Contactlenzen oplossingenBeijing Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd.GM17064
WattenstaafjesHenan Guangderun Medical Instruments Co.,Ltd
Fijne naaldhouderSuZhou Stronger Medical Instruments Co.,LtdCZQ1370
Pincet66 Vision Tech Co., Ltd.53320A
Pincet66 Vision Tech Co., Ltd.53072
Pincet66 Vision Tech Co., Ltd.#5
VerwarmingskussenStrykerTP 700 T
VerlichtingMotic China Group Co., Ltd.MLC-150C
IsofluraanRWD Life Science Co.,LtdR510-22
LCD monitorPhilips (China) Investment Co., Ltd.39PHF3251/T3
MicroscoopSOPTOPSZMT1
Niet-invasieve vitale tekenmonitorMouseox
Olie hydraulische micromanipulatorNARISHIGE International Ltd.PC-5N06022
Petrolatum ooggelDezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd.17C801
Spike2Cambridge Electronic Design, Cambridge, UKSpike2 versie 9
Chirurgische schaar66 Vision Tech Co., Ltd.54010
Chirurgische schaar66 Vision Tech Co., Ltd.54002
Naald voor hechtingNingbo Medical Co.,Ltd3/8 boog 2.5*8
Wolfraam elektrodeFHC, IncL504-01B
XylocaineHuaqing

Referenties

  1. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Effects of monocular deprivation in kittens. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 248 (6), 492-497 (1964).
  2. Daw, N. W., Fox, K., Sato, H., Czepita, D. Critical period for monocular deprivation in the cat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 67 (1), 197-202 (1992).
  3. Guire, E. S., Lickey, M. E., Gordon, B. Critical period for the monocular deprivation effect in rats: assessment with sweep visually evoked potentials. Journal of Neurophysiology. 81 (1), 121-128 (1999).
  4. Wang, L., Sarnaik, R., Rangarajan, K. V., Liu, X., Cang, J. Visual receptive field properties of neurons in the superficial superior colliculus of the mouse. Journal of Neuroscience. 30 (49), 16573-16584 (2010).
  5. Niell, C. M. Cell Types, circuits, and receptive fields in the mouse visual cortex. Annual Review of Neuroscience. 38 (1), 413-431 (2015).
  6. Lee, S. H., et al. Activation of specific interneurons improves V1 feature selectivity and visual perception. Nature. 488 (8), 379-383 (2012).
  7. Cossell, L., et al. Functional organization of excitatory synaptic strength in primary visual cortex. Nature. 518 (2), 399-403 (2015).
  8. Lacaruso, M. F., Gasler, L. T., Hofer, S. B. Synaptic organization of visual space in primary visual cortex. Nature. 547 (7), 449-452 (2017).
  9. Metin, C., Godement, P., Imbert, M. The primary visual cortex in the mouse: Receptive field properties and functional organization. Experimental Brain Research. 69 (3), 594-612 (1988).
  10. Marshel, J. H., Garrett, M. E., Nauhaus, I., Callaway, E. M. Functional specialization of seven mouse visual cortical areas. Neuron. 72 (6), 1040-1054 (2011).
  11. Gordon, J. A., Stryker, M. P. Experience-dependent plasticity of binocular responses in the primary visual cortex of the mouse. The Journal of Neuroscience. 16 (10), 3274-3286 (1996).
  12. McGee, A. W., Yang, Y., Fischer, Q. S., Daw, N. W., Strittmatter, S. M. Experience-driven plasticity of visual cortex limited by myelin and Nogo receptor. Science. 309 (5744), 2222-2226 (2005).
  13. Sawtell, N. B., et al. NMDA receptor-dependent ocular dominance plasticity in adult visual cortex. Neuron. 38 (6), 977-985 (2003).
  14. Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D., Bonhoeffer, T., Hubener, M. Prior experience enhances plasticity in adult visual cortex. Nature Neuroscience. 9 (12), 127-132 (2006).
  15. Crozier, R. A., Wang, Y., Liu, C., Bear, M. F. Deprivation-induced synaptic depression by distinct mechanisms in different layers of mouse visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (4), 1383-1388 (2007).
  16. Tagawa, Y., Kanold, P. O., Majdan, M., Shatz, C. J. Multiple periods of functional ocular dominance plasticity in mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 8 (3), 380-388 (2005).
  17. Lickey, M. E., Pham, T. A., Gordon, B. Swept contrast visual evoked potentials and their plasticity following monocular deprivation in mice. Vision Research. 44, 3381-3387 (2004).
  18. Cang, J., Kalatsky, V. A., Lowel, S., Stryker, M. P. Optical imaging of the intrinsic signal as a measure of cortical plasticity in the mouse. Vision Neuroscience. 22 (5), 685-691 (2005).
  19. Khan, I. U., et al. Evaluation of different suturing techniques for cystotomy closure in canines. Journal of Animal & Plant Sciences. 23 (4), 981-985 (2013).
  20. Weisman, D. L., Smeak, D. D., Birchard, S. J., Zweigart, S. L. Comparison of a continuous suture pattern with a simple interrupted pattern for enteric closure in dogs and cats: 83 cases (1991-1997). Journal of the American Veterinary Medical Association. 214 (10), 1507-1510 (1999).
  21. Heneghan, C. P. H., Thornton, C., Navaratnarajah, M., Jones, J. G. Effect of isoflurane on the auditory evoked response in man. BJA: British Journal of Anaesthesia. 59 (3), 277-282 (1987).
  22. Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomenal. Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Kritieke PeriodeContralaterale Bias indexOri ntatie afstemscurvesElektrofysiologische RegistratieStereotaxisch FramePrincipal Component AnalyseK means Algoritme
Monoculaire visuele ontbering en oculaire dominantie plasticiteit meting in de muis primaire visuele cortex
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.