Thermoforese op microschaal verkrijgt snel bindingsconstanten tegen lage materiaalkosten. Gelabelde of labelvrije thermoforese op microschaal is in de handel verkrijgbaar; labelvrije thermoforese is echter niet in staat tot de diversiteit aan interactiemetingen die kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende labels. Wij bieden een protocol voor gelabelde thermoforesemetingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het vermogen om de bindingsaffiniteit van lipiden aan eiwitten te bepalen, is een essentieel onderdeel van het begrijpen van eiwit-lipide-interacties bij membraanhandel, signaaltransductie en cytoskeletale remodellering. Klassieke hulpmiddelen voor het meten van dergelijke interacties zijn oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC). Hoewel krachtige tools, hebben deze benaderingen tegenslagen. ITC vereist grote hoeveelheden gezuiverd eiwit en lipiden, die duur en moeilijk te produceren kunnen zijn. Bovendien zijn ITC en SPR zeer tijdrovend, wat aanzienlijk kan bijdragen aan de kosten van het uitvoeren van deze experimenten. Een manier om deze beperkingen te omzeilen is door de relatief nieuwe techniek van microschaal thermoforese (MST) te gebruiken. MST is snel en kosteneffectief met behulp van kleine hoeveelheden monster om een verzadigingscurve voor een bepaalde bindingsgebeurtenis te verkrijgen. Er zijn momenteel twee soorten MST-systemen beschikbaar. Eén type MST vereist etikettering met een fluorofoor in het blauwe of rode spectrum. Het tweede systeem is gebaseerd op de intrinsieke fluorescentie van aromatische aminozuren in het UV-bereik. Beide systemen detecteren de beweging van moleculen als reactie op gelokaliseerde inductie van warmte van een infraroodlaser. Elke aanpak heeft zijn voor- en nadelen. Labelvrije MST kan niet-gecodeerde inheemse eiwitten gebruiken; veel analyten, waaronder farmaceutische producten, fluoresceren echter in het UV-bereik, wat de bepaling van nauwkeurige KD-waarden kan verstoren. Ter vergelijking: gelabelde MST zorgt voor een grotere diversiteit aan meetbare paarsgewijze interacties met behulp van fluorescerend gelabelde sondes die zijn bevestigd aan liganden met meetbare absorpties in het zichtbare bereik in tegenstelling tot UV, waardoor het potentieel voor storende signalen van analyten wordt beperkt.
Inleiding
Thermoforese op microschaal is een relatief nieuwe techniek voor het bepalen van disassociatieconstanten (KD) en remmingsconstanten (IC50) tussen biochemisch relevante liganden. De toonaangevende commerciële retailer voor MST (bijv. NanoTemper) biedt twee populaire MST-technologieën: 1) Labelvrije MST waarvoor een fluorescerende tag nodig is, en 2) gelabelde thermoforese met behulp van de inherente fluorescentie van eiwitten, afhankelijk van het aantal aromatische residuen in elk eiwit1. Een nadeel van labelvrije thermoforese is dat het in de meeste gevallen niet mogelijk is om eiwit-eiwitinteracties te meten. Het kan echter mogelijk zijn om eiwitten te ontwikkelen zonder aromatische aminozuren zoals tryptofaan voor gebruik in labelvrije thermoforese2.
MST meet de beweging van deeltjes als reactie op de inductie van microscopische temperatuurvelden geïnitieerd door een infraroodlaser in momenteel beschikbare technologieën1. MST kan worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties, eiwit-lipide-interacties, eiwit-klein molecuul, concurrentie-experimenten en zelfs interacties tussen kleine moleculen te meten, zolang men voldoende signaalscheiding kan produceren. Bovendien maakt MST het mogelijk om op membraan en eiwit gebaseerde interacties te meten die zijn ingebed in liposomen of nanodiscs. Gelabelde thermoforese maakt gebruik van het gebruik van fluorescerend gelabelde tags die een chemisch controleerbare scheiding van signaal tussen ligand en analyt mogelijk maken. KD-waarden kunnen worden verkregen met behulp van thermoforese voor interacties waarbij eiwitbinding betrokken is bij lage nanomolaire concentraties, wat in de meeste gevallen een veel lagere eiwitconcentratie is dan wat nodig is voor isotherme calorimetrie (ITC)3. Bovendien heeft MST geen strikte buffervereisten zoals vereist voor oppervlakteplasmonresonantie (SPR)4 en kan gelabelde thermoforese zelfs worden gebruikt om bindingsconstanten van eiwitten van belang te meten uit niet-volledig gezuiverde eiwitoplossingen5 met genetisch ingebrachte fluorescerende tags6. Een nadeel van MST is dat kinetische parameters niet gemakkelijk kunnen worden verkregen voor MST zoals in SPR2.
Thermoforesemetingen zijn afhankelijk van het lokale temperatuurverschil van een oplossing. Deze warmte kan worden opgewekt uit een infraroodlaser. Het MST-apparaat heeft een fluorescentiedetector gekoppeld aan een infrarood (IR) -straal en kan veranderingen in fluorescentie opvangen van lokale concentratieveranderingen van de fluorescerende moleculen op het punt waar de IR-laser is gericht. Het MST-apparaat maakt gebruik van een IR-gerichte laser die rechtstreeks is gekoppeld aan een fluorescentiedetector die is gericht op hetzelfde punt waarop de warmte in de oplossing wordt gegenereerd. Dit maakt robuuste detectie mogelijk van temperatuurveranderingen die overeenkomen met de uitputting van moleculen op het punt van warmte dat door de IR-laser wordt gegenereerd. Gemeten fluorescentie neemt over het algemeen dichter bij de IR-laser af als reactie op temperatuurstijgingen. De verschillen die als gevolg hiervan worden gemeten, kunnen te wijten zijn aan meerdere factoren, waaronder lading, grootte of solvatie-entropie. Deze verschillen worden gemeten als veranderingen in fluorescentie als reactie op inductie van warmte of beweging van moleculen van warme naar koudere delen van het capillair.
Bij het laden van een capillair met een bepaalde oplossing, is het belangrijk om lucht aan beide uiteinden van het capillair te laten en het capillair niet volledig vol te laden. Het commerciële capillair bevat ongeveer 10 μL oplossing. Men kan nauwkeurige metingen uitvoeren met 5 μL oplossing zolang de oplossing wordt gemanipuleerd naar het midden van het capillair, er geen luchtbellen zijn (mogelijk ontgassen voordat het capillair wordt geladen) en men voorzichtig is met het laden van het rek om de oplossing niet te verdringen vanuit het midden van het capillair, waar de infraroodlaser is gericht. Als de laser niet volledig in contact komt met de oplossing, zal het resultaat hoogstwaarschijnlijk een van de drie onbruikbare uitgangen voor die concentratie zijn: 1) geen of lage fluorescentiedetectie, 2) hogere fluorescentiedetectie (mogelijk met gekartelde piek), of 3) fluorescentiedetectie binnen andere waarden van gegeven titratie, maar met een gekartelde en onbegeleide piek.
Voor gelabelde thermoforese is het optimaal om een fluorescentiesignaal boven 200 en onder 2000 fluorescentie-eenheden te hebben7. Het MST-apparaat maakt gebruik van een bereik van LED-intensiteiten van 0 tot 100, die kunnen worden geselecteerd om een signaal boven 200 of onder 2000 te bereiken. Als alternatief kan men verschillende concentraties van het gelabelde ligand gebruiken om het fluorescentiesignaal tot een optimaal niveau aan te passen. Het is belangrijk om een cap-scan uit te voeren met een bepaalde MST-meting als referentie bij het analyseren van gegevens, omdat een poor cap-scan vaak kan resulteren in een punt waarvan later kan worden vastgesteld dat het een uitschieter is. Elke run duurt ongeveer 30 minuten als u een enkel MST-vermogen meet met een dopscan. De commerciële apparaten maken veranderingen in MST-vermogen mogelijk. In oudere softwareversies kon dit worden ingesteld van 0 tot 100; en in latere versies kan men lage, gemiddelde of hoge MST selecteren. Om robuuste sporen te bereiken, moet een onderzoeker mogelijk elk van deze proberen en beslissen welke MST-instelling resulteert in de meest robuuste gegevens voor een bepaalde interactie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van materialen
- Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 en 2 mM KH2PO4, pH 7,41.
- Bereid NTA-Atto 647 N kleurstof voor. Verdun bouillon NTA-Atto 647 N kleurstof tot 100 nM van een 100% DMSO-oplossing in PBS zonder Tween.
- Druk Vam7-His8 uit – Eiwit als fusie-eiwit in E. coli en zuiver met behulp van Ni-NTA en grootte-uitsluiting chromatografie8.
- Titreer de analyt in PBS-buffer. Als de analyt zich in een andere buffer bevindt, is gelabeld MST niet bijzonder gevoelig voor kleine bufferverschillen met moleculen zoals DMSO, tenzij de inhoud van de analytbuffer interageert met gelabeld eiwit.
2. Voorbereiding van het MST-apparaat
- Schakel de aan/uit-schakelaar aan de achterkant van het apparaat in.
- Open de besturingssoftware en zorg ervoor dat de laptop is ingeschakeld en in de verbindingsstatus staat op de computer die op het apparaat is aangesloten.
- Voer fluorescentie- en MST-instellingen in voor dit experiment. Stel MST Before in op 3 s, MST op 30 s en Fluorescentieherstel (Fluo.) na 1 s. Vóór meet initiële fluorescentie en vereist geen lange tijd; MST is de werkelijke tijd voor evenwicht die moet worden bereikt na warmte-inductie.
- Tabel met capillairen: Voer voor elke capillaire buis de naam van het doel (ligand), de naam van het ligand (analyt), de concentratie van het doel en de hoogste titratieconcentratie in en gebruik de autofill-titratieverhouding. Voer bijvoorbeeld 50 nM in voor de doelconcentratie van Vam7-His8, Vam7-His8 voor doelnaam, (1,2-dioctanoylfosfatidisch zuur) Di-C8 PA voor ligandnaam, en de hoogste concentratie het ligand dat 1:1 selecteert en naar beneden sleept naar automatisch invulsleuven 2-16.
- Voer een Cap Scan uit om de juiste LED (20% LED (preset)) te selecteren op basis van het signaal van het doeleiwit en pas tussen 200 en 2000 fluorescentie-eenheden aan voor gelabelde MST. Cap Scans moeten uniforme afgeronde klokvormige pieken laten zien.
- Selecteer een reeks MST-vermogens en voer waarden in voor elk om te testen op de meest robuuste bindingsfit en druk op Start Cap Scan + Measurement, waarbij verschillende waarden worden gescand om de beste bedrijfsomstandigheden te bepalen voor een bepaalde interactie die wordt getest.
- Bepaal het MST-vermogen met een beste pasvorm met behulp van de analysesoftware en de preset voor thermoforese met Tjump. Analyseer pasvormen volgens de meeste fluorescentiescheiding tussen de laagste en hoogste concentratie in vergelijking met het MST-vermogen met de beste pasvorm en selecteer het MST-vermogen voor replicatieproeven.
- Bepaal of er fotobleaching is opgetreden tussen de eerste en tweede run door naar de analysesoftware te gaan en de analyse over te schakelen naar de expertmodus. Selecteer vervolgens fluorescentie in plaats van thermoforese voor analyse. Selecteer de expertmodus en vervolgens fotobleaching.
3. Voorbereiding van monsters voor geëtiketteerde MST
- Breng de Vam7-His8 oplossing tot een concentratie van 200 nM in PBS zonder Tween.
- Breng de NTA-Atto 647 kleurstof naar 100 nM in PBS zonder Tween.
- Meng de Vam7-His8 en NTA-Atto 647 kleurstof in een volumetrische verhouding van 1:1 en laat 30 minuten op kamertemperatuur zitten die bedekt is met licht. Bepaal de juiste concentratie van doeleiwit zoals in rubriek 2.5 (zie Supplement over het gebruik van KD van Ni-NTA-kleurstof zoals aangetoond in video).
- Centrifugeer het mengsel van NTA-Atto 647 N kleurstof en eiwit gedurende 10 minuten in een donkere ruimte met behulp van een tafelcentrifuge van ongeveer 8.161 x g.
- Bewaar het mengsel bij 4 °C na het experiment of op ijs tijdens het experiment voor hergebruik binnen enkele uren indien nodig om te voorkomen dat eiwitten denatureren.
- Gebruik de NT-concentratiemeter om het concentratiebereik te bepalen dat nodig is voor titratie.
- Breng Di-C8 PA in de juiste maximale concentratie in water.
- Titreer de analyt met behulp van een 1:1 seriële verdunning in PBS-buffer voor 16 concentraties op basis van de vorige stap. In tegenstelling tot SPR is thermoforese niet zo gevoelig voor bufferverschillen.
4. MST van monsters
- Schakel het apparaat en de aangesloten laptop in.
- Druk op de pijl-omhoog aan de voorkant van de machine en schuif het capillaire rek eruit.
- Laad haarvaten in het rek met de hoogste concentratie op positie 1.
- Selecteer in de besturingssoftware het rode kanaal dat overeenkomt met NTA-Atto 647 N.
- Voer concentratie-, positie- en naaminformatie in voor elk capillair in de tabel met capillairen.
- Voer een capillaire scan uit door op Start Cap Scan te drukken op 20% LED (vooraf ingesteld) en pas aan tussen 200 en 2000 fluorescentie-eenheden met behulp van LED-intensiteitsinstellingen of concentratie van ligand (gelabeld eiwit).
- Selecteer een bereik van MST-vermogen.
- Start Cap Scan + MST-meting.
- Analyseer met behulp van de analysesoftware.
5. Analyse van MST-gegevens
OPMERKING: De analysesoftware die door Nanotemper wordt geleverd, is eigendom en wordt uitgevoerd met behulp van M.O. Affinity Analysis. Er zijn verschillende manieren om bindingsaffiniteiten te meten op basis van fluorescentie of thermoforese. Nieuwere versies van deze software zijn vooraf ingesteld om gegevens automatisch te evalueren met behulp van thermoforese en zijn vooraf ingesteld om Thermophorese te gebruiken waarbij Tjump profiteert van beide metingen. Als alternatief kan men kiezen voor Tjump alleen of Thermophorese alleen. Bovendien maakt de analysesoftware geschatte affiniteitsmetingen mogelijk met behulp van initiële fluorescentie. Deze instellingen zijn alleen toegankelijk in de expertmodus.
- Stel de evaluatiestrategie in de analysesoftware in op expert door op het vakje voor de bliksemschicht naast een gegevensset in het scherm Gegevensselectie te klikken. De analysesoftware is vooraf ingesteld om te analyseren naar MST-analyse; Een onderzoeker kan echter Create New Analysis selecteren en Initial Fluorescence Analysis selecteren om bindingsaffiniteiten te schatten op basis van initiële fluorescentie. Expert-modus is ook beschikbaar voor initiële fluorescentie. In de hieronder beschreven analyse werden thermoforese en Tjump gebruikt om de KD van de gepresenteerde Vam7-His8 met zijn natuurlijke substraat, het lipide fosfatidisch zuur, te bepalen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit is een steekproefuitvoer met behulp van de affiniteitsanalyse. De gelabelde MST werd gebruikt om de bindingsconstante van de Vam7-His8 aan de oplosbare dioctanoyl (DiC8) PA van een van zijn natuurlijke substraten9 te bepalen. Figuur 1 toont de thermoforetische sporen van één proef met een 1:1 titratie van DiC8 PA vanaf 500 μM tegen 50 nM Vam7-His8. Initiële fluorescentie (tijd voordat infraroodlaser werd ingeschakeld), Tjump (tijd in eerste instantie nadat infraro...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De bepaling van Vam7-His8binding aan DiC8-PA leverde een robuust gemonteerde KD op voor de gegeven interactie, die iets lagere affiniteit heeft dan de gemeten KD van Vam7-His8 voor PA-liposomen (ongepubliceerd). Dit verschil is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het ontbreken van een membraan, wat over het algemeen resulteert in een lagere affiniteit voor membraanspecifieke lipidebindingsinteracties en daarom de rol van de liposoommembraansteiger aan deze interact...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen potentiële belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation (MCB 1818310) aan RAF. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Chemical Biology Core Facility / Protein Crystallography Unit in het H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH / NCI: P30-CA076292).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cy5 Maleimide Mono-Reactieve Kleurstof | GE Healthcare | PA23031 | Voor het labelen van eiwitten |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaires (1000 tellen) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaires voor MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | Universitair materiaal | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | Label voor His tags |
| Fosfatidylinositol 3-fosfaat diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipide voor bindingsexperimenten |
Referenties
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
- Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains. Gene. 163 (1), 1-11 (1995).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100(2010).
- Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).
- Starr, M. L., et al. Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).
- Miner, G. L., et al. The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain. Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models. Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).
- Zhao, H., Lappalainen, P. A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions. Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).
- Kaufmann, S. H. Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents. Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).
- le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
- Corradi, V., et al. Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions. Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).
- Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective. SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).
- Sparks, R. P., et al. A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion. Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
