Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vivo Infectie met Leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60617

⸱

20 februari 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een samengesteld protocol om de cutane infectie van muizen met Leishmania amazonensiste evalueren. Dit is een betrouwbare methode voor het bestuderen van parasietvirulentie, waardoor een systemische weergave van de gewervelde gastheer respons op de infectie.

Samenvatting

Leishmania spp. zijn protozoan parasieten die leishmaniases veroorzaken, ziekten die een breed spectrum van klinische manifestaties van cutane tot viscerale laesies presenteren. Momenteel, 12 miljoen mensen worden geschat te zijn besmet met Leishmania wereldwijd en meer dan 1 miljard mensen leven op het risico van infectie. Leishmania amazonensis is endemisch in Midden- en Zuid-Amerika en leidt meestal tot de cutane vorm van de ziekte, die direct kan worden gevisualiseerd in een diermodel. Daarom zijn L. amazonensis stammen goede modellen voor cutane leishmaniasis studies omdat ze ook gemakkelijk worden gekweekt in vitro. C57BL/6 muizen bootsen de L. amazonensis-gedrevenziekteprogressie na die bij mensen wordt waargenomen en worden beschouwd als een van de beste muizenstammenmodel voor cutane leishmaniasis. In de gewervelde gastheer bewonen deze parasieten macrofagen ondanks de afweermechanismen van deze cellen. Verschillende studies gebruiken in vitro macrofaag infectie testen om de parasiet infectiviteit te evalueren onder verschillende omstandigheden. De in vitro benadering is echter beperkt tot een geïsoleerd celsysteem dat de reactie van het organisme negeert. Hier compileren we een in vivo murineinfectiemethode die een systemisch fysiologisch overzicht biedt van de interactie tussen gastheer en parasiet. Het gedetailleerde protocol voor de in vivo infectie van C57BL/6 muizen met L. amazonensis omvat parasietdifferentiatie in besmettelijke amastigoten, muizen voetpad cutane inenting, laesie ontwikkeling, en parasiet belasting bepaling. Wij stellen deze gevestigde methode voor als de meest geschikte methode voor fysiologische studies van de gastheer immuun- en metabole reacties op cutane leishmaniasis.

Inleiding

Leishmaniases zijn wereldwijd voorkomende parasitaire infectieziekten die belangrijke uitdagingen in ontwikkelingslanden vertegenwoordigen en worden door de Wereldgezondheidsorganisatie1,2erkend als een van de belangrijkste verwaarloosde tropische ziekten. De leishmaniasen worden gekenmerkt door cutane, slijmvlies, en / of viscerale manifestaties. Cutane leishmaniasis wordt meestal veroorzaakt door L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica en L. aethiopica3. Deze vorm van de ziekte is vaak zelfherstellend bij de mens als gevolg van de inductie van beschermende cellulaire immuunrespons. Echter, de cellulaire immuunrespons kan mislukken, en de ziekte kan vooruitgang boeken om te verspreiden cutane leishmaniasis4,5. Er is geen vaccin beschikbaar vanwege de diversiteit onder Leishmania soorten en gastheer genetische achtergronden6,7. Behandelingsopties zijn ook beperkt omdat de meeste momenteel beschikbare geneesmiddelen duur, giftig en/of langdurige behandeling vereisen8,9. Bovendien zijn er meldingen van resistentie tegen geneesmiddelen tegen de beschikbare behandelingen10,11.

De veroorzaker van leishmaniases is de protozoan parasiet Leishmania. De parasiet presenteert twee verschillende morfologische vormen in zijn levenscyclus: promastigoten, de flagellated vorm gevonden in zandvliegen; en amastigoten, de intracellulaire vorm gevonden in de parasitophoreuze vacuoles van de zoogdiergastheer macrofagen12,13. Amastigotes ' vermogen om binnen te vallen, overleven, en repliceren, ondanks de verdediging mechanismen van de gewervelde gastheer macrofagen zijn onderworpen aan vele studies14,15,16,17. Bijgevolg hebben verschillende onderzoeksgroepen in vitro macrofaaginfectietests beschreven om de impact van specifieke omgevingsfactoren te evalueren, evenals parasiet- en gastheergenen op infectiviteit van parasieten. Deze test biedt verschillende voordelen, zoals het vermogen om studies aan te passen aan een hoog doorvoerformaat, een relatief kortere periode om resultaten te verkrijgen en een verminderd aantal geofferde proefdieren18. De bevindingen van in vitro tests zijn echter beperkt omdat ze niet altijd repliceren in vivo studies14,19,20,21. In vivo testen bieden een systemisch fysiologisch overzicht van de host-parasiet interactie, die niet volledig kan worden nagebootst door in vitro testen. Immunologische studies kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd door middel van immunohistochemische testen van verzamelde delen van het voetpadweefsel of zelfs van popliteale lymfeklieren voor analyse van de teruggewonnen immuuncellen22.

Dieren worden vaak gebruikt als model voor menselijke ziekten in biologisch en biomedisch onderzoek om de onderliggende fysiologische mechanismen van de ziekten beter te begrijpen23. In het geval van leishmaniasis beïnvloedt de route, de plaats of de dosis inenting de uitkomst van de ziekte24,25,26,27. Bovendien worden de gevoeligheid en de weerstand tegen de infectie bij mensen en muizen sterk gereguleerd door de genetische achtergronden van de gastheer en parasiet4,5,22,28,29,30,31. BALB/c muizen zijn zeer gevoelig voor L. amazoneensinfectie, die een snelle ziekteprogressie vertonen met de verspreiding van de parasieten naar de lymfeklieren, milt en lever32. Aangezien de ziekte kan vorderen tot cutane metastasen, kan de infectie fataal zijn. C57BL/6 muizen ontwikkelen daarentegen vaak chronische laesies met aanhoudende parasietbelastingen in L. amazonensis-infectie assays33. Daarbij, L. amazonensis infectie met deze bijzondere muissoort is beschouwd als een uitstekend model om chronische vormen van cutane leishmaniasis bij de mens te bestuderen, omdat het bootst de ziekte progressie beter dan de BALB / c muizen infectie model5,34.

Daarom stellen we voor dat de murine in vivo infectie een nuttige methode is voor Leishmania virulentie fysiologische studies die van toepassing zijn op de menselijke ziekte, waardoor een systemisch beeld van de interactie tussen gastheer en parasiet mogelijk is. Herbezoeken gevestigde assays22, presenteren we hier een gecompileerde stap-voor-stap protocol van de in vivo infectie van C57BL / 6 muizen met L. amazonensis die de parasiet differentiatie in axenic amastigotes, muizen voetpad cutane inenting, laesie ontwikkeling, en parasiet belasting bepaling omvat. Dit protocol kan worden aangepast aan andere muizenstammen en Leishmania soorten die cutane leishmaniases veroorzaken. Tot slot, de hier gepresenteerde methode is cruciaal bij het identificeren van nieuweanti-Leishmania drug doelen en vaccins, evenals in fysiologische studies van de gastheer immuun en metabole reacties op Leishmania infectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn en gebruik van het Instituut voor Biowetenschappen van de Universiteit van São Paulo (CEUA 342/2019), en werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen en het beleid voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de staat São Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) en de Braziliaanse regering (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle stappen beschreven in secties 1-5 moeten aseptisch worden uitgevoerd in laminaire stroomkasten. Persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gebruikt tijdens het hanteren van levende Leishmania parasieten.

1. In Vitro Differentiatie van L. amazonensis Promastigotes in Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

OPMERKING: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) parasiet werd gebruikt in deze test. Afhankelijk van het onderzoeksdoel kan de infectieve parasietvorm worden verkregen door zuivering van de metacyclische vorm met behulp van een dichtheidsgradiënt, zoals eerder beschreven14, of door differentiatie van promastigoten in axenic amastigoten, volgens het volgende protocol.

  1. Kweek La promastigoten in een 25 cm2 celkweekkolf met 10 mL medium voor promastigoten (pro-medium) (pH = 7.0).
  2. Incubeer 3 dagen bij 25 °C.
    OPMERKING: Gebruik promastigote culturen die werden doorgegeven in vitro minder dan 10x om het verlies van virulentie en aneuploïdie veranderingen van parasieten39,40,41,42,43,44.
  3. Pipette 5 mL logaritmische groeifase promastigote cultuur in een nieuwe 25 cm2 kolf.
  4. Voeg 5 mL medium toe voor axenic amastigoten (ama-medium) (pH = 5.2).
  5. Incubeer 34 °C gedurende 3-4 dagen.
  6. Splits de cultuur door te verdunnen met ama-medium bij een verhouding van 1:3 in een nieuwe kolf van 25 cm2.
  7. Incubeer 34 °C gedurende 3-5 dagen.
    OPMERKING: Broed de axenic amastigoten voor maximaal 5 dagen, omdat het het einde van de rijping37vertegenwoordigt.

2. C57BL/6 Footpad Infectie met L. amazonensis

OPMERKING: Vrouwelijke C57BL/6 muizen (6-8 weken oud) werden verkregen en onderhouden in het Animal Center van het Biomedical Sciences Institute van de Universiteit van São Paulo. Dieren kregen voedsel en water ad libitum.

  1. Tel de cultuur van axenic amastigoten door het overbrengen van een aliquot van de parasiet schorsing verdund in PBS naar een Neubauer kamer (dat wil zeggen, hemocytometer). Tel de niet-flagellated parasieten, die amastigotes vormen vertegenwoordigen.
    OPMERKING: Als alternatief kan Trypan blauw (1:1) worden gebruikt voor het tellen van het aantal levensvatbare amastigoten (d.w.z. die niet bevlekt met Trypan blauw).
  2. Verdun de axenic amastigoten in PBS volgens de gewenste entculumdosis en het aantal beoogde endoortingen (1 x 106 axenic amastigoten in 50 μL PBS wordt aanbevolen).
  3. Laad een tuberculinespuit met een 27 G naald met de voorbereide parasietsuspensie.
  4. Verdoven een C57BL / 6 muis met behulp van 3-5% isoflurane, zoals aanbevolen door Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Beoordeel de verdovingsdiepte door de reactie van de muis op een teensnuifje te testen.
  5. Inenting 50 μL van de gehomogeniseerde parasietsuspensie (1 x 106 axenic amastigoten of de gewenste inoculumdosis) in het subplantaire weefsel van het linker achtervoetpad, met behulp van de eerder geladen tuberculinespuit (stap 2.3).

3. Muis voetpad Laesie Ontwikkeling

  1. Meet de progressie van de laesie één keer per week door de dikte van de linker (geïnfecteerde) en de rechter (niet-geïnfecteerde) voetzolen te meten met behulp van een remklauw.
  2. Bereken het verschil van de dikte tussen de linker en rechter achtervoetkussens per week om laesieprogressie te evalueren.
  3. Plot de berekende verschillen op de Y-as en de tijd van infectie op de X-as en bereken de statistische significantie.
    OPMERKING: In overeenstemming met de aanbevelingen van de Comités voor dierenverzorging en gebruik moeten dieren worden geofferd voordat de besmette laesie wordt zweren, omdat huidzweren kunnen leiden tot secundaire infectie. Zoals blijkt uit aanvullende figuur 1, duurt het ongeveer 10 weken voordat de laesies tekenen van ulceratie vertonen met de parasietdosis (106 axenic amastigoten) en gastheerstam (C57BL/6) die in dit protocol worden gebruikt. De muizen moeten worden geofferd voor laesieextractie voordat de tekenen van ulceratie worden waargenomen.

4. Muizen Voetpad Laesie extractie en parasiet beperken verdunning

  1. Bereid een 96 putplaat (platte bodem) voor de beperkende verdunningstest46,47 door 180 μL pro-medium aan alle putten toe te voegen.
    OPMERKING: Gebruik vier plaatstroken (de helft van de plaat) voor elk dier, wat neerkomt op vierdubbele testen (d.w.z. dier 1 = rijstroken A-D; dier 2 = rijstroken E-H).
  2. Voeg 1 mL pro-medium toe in een glasweefselmolenbuis per laesie en weeg de buis.
    LET OP: De buis moet steriel worden gehouden, dus gebruik een steriel deksel en weeg de buis met het gesloten deksel, bij het wegen buiten de laminaire stroomkast.
  3. Offer het dier op in een CO 2-kamer, volgens de aanbevelingen van de Comités voor Dierenverzorging en Gebruik. Desinfecteer het dier door te spuiten met 70% ethanol.
  4. Accijns de voet van het dier op de hielen om het geïnfecteerde voetpad te extraheren en spray 70% ethanol op het voetpad voor desinfectie. Zorg voor de sterilisatie van scharen en tangen door ze gedrenkt te houden in 70% ethanol.
  5. Plaats het geïnfecteerde voetpad in een steriele petrischaal en ontleed met behulp van steriele tangen en een scalpel om alle zachte weefsels te verzamelen. Gooi de botten weg.
    OPMERKING: Uniformiteit in de dissectie stap wordt aanbevolen om bevooroordeeld weefsel herstel te voorkomen.
  6. Breng de verzamelde weefsels met pro-medium over op de buis van de glasweefselmolen en weeg de buis opnieuw om het laesiegewicht te bepalen.
    OPMERKING: Vermijd het plaatsen van de tangen en scalpel direct in het medium, als kleine volumes kunnen worden verwijderd, wat resulteert in een onderschat weefsel gewicht. Het gewicht van de laesie wordt berekend door het gewicht van de buis die pro-medium bevat met het verzamelde weefsel af te trekken van het gewicht van buis die alleen pro-medium bevat.
  7. Homogeniseren van het weefsel 10x met behulp van de molen voor volledige weefselverstoring.
  8. Laat het mengsel 10 min sediment en verzamel vervolgens 20 μL van het supernatant.
  9. Laad 20 μL van de supernatant in de1e kolom van de1e rijstrook van de 96 goedplaat bereid in stap 4.1. Herhaal dit voor de volgende drie rijstroken om quadruplicaten te hebben voor elk dier (d.w.z. voor dier 1 voeg 20 μL toe aan elke put en label A1, B1, C1 en D1).
  10. Homogeniseren elke put in de1e kolom 10x met behulp van een multichannel pipet. Breng vervolgens 20 μL van de verdunde monsters over van de1e kolom naar de2e kolom.
    OPMERKING: Het is belangrijk om elke put 10x van de ene kolom naar de volgende te homogeniseren.
  11. Herhaal stap 4.10 voor alle resterende kolommen tot de laatste kolom (12e)en gooi de laatste 20 μL verdund monster weg.
    OPMERKING: Verander de tips na elke verdunning om kruisbesmetting te voorkomen.
  12. Sluit de platen 7 dagen lang af met een folie en incubeer bij 25 °C in een vochtige kamer.

5. Laesie Parasiet Load Bepaling

  1. Analyseer de platen na 7 dagen incubatie met behulp van een omgekeerde microscoop om de laatste parasiet-bevattende goed voor elke rijstrook te bepalen.
    OPMERKING: Het is ook mogelijk om een indicatie te hebben van de groei van de parasieten, of celdichtheid, door visuele analyse van de kleurveranderingen en troebelheid van het medium.
  2. Bereken de belasting van het parasietweefsel voor elke rijstrook door de verdunningsfactor per laesiegewicht te delen.
    OPMERKING: In een specifieke rijstrook, als parasieten alleen aanwezig zijn in kolommen 1-5 (d.w.z. putten A1-A5 zijn positief voor de groei van parasieten), betekent dit dat kolom 5 slechts 1 parasiet bevatte, kolom 4 10 parasieten bevatte, enzovoort, in veelvouden van tien. Kolom 1 zou 104 parasieten bevatten, wat het aantal parasieten in de eerste 20 μL supernatant (het niet-verdunde monster in stap 4.7) vertegenwoordigt. Omdat deze 20 μL werd verdund met 180 μL pro-medium, bevatte de initiële buis 5 x 105 parasieten: (1 x 104) / (0,02 mL) = 5 x 105 parasieten/1 mL. Vervolgens kan de parasietbelasting in die laesie worden berekend door de initiële concentratie van de parasiet te delen door het laesiegewicht: (5 x 105) / laesiegewicht (zie stap 4.6).
  3. Plot het gemiddelde van het vierdubbele resultaat voor elk dier met een log Y-schaal.

6. Statistische analyse

  1. Vertegenwoordig de gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie met ten minste vijf dieren per experimentele groep als repliceert.
  2. Voer statistische analyse uit met behulp van ongepaarde tweezijdige tests, waarbij een p-waarde < 0,05 als significant wordt gezien.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Leishmania protozoan parasieten bestaan in twee ontwikkelingsvormen tijdens hun levenscyclus in ongewervelde en gewervelde gastheren: promastigoten, de proliferative vormen gevonden in het lumen van de vrouwelijke zandvlieg; en amastigoten, de proliferative vormen gevonden in de parasitophoreuze vacuoles van de zoogdiergastheercellen. Promastigoten hebben een langwerpig lichaam van ongeveer 1,5 μm breed en 20 μm lang, met een flagellum die meestal uit de voorste extremiteit tevoo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De in vivo infectietest beschreven in dit protocol stelt elke onderzoeker in staat om in vivo cutane leishmaniasis te evalueren, gezien de interactie tussen gastheer en parasiet in een systemisch scenario. Deze tests zijn gebruikt door vele groepen22,24,27,29,31,32,34,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

We willen prof. dr. Niels Olsen Saraiva Câmara van het Animal Center van het Biomedical Sciences Institute van de Universiteit van São Paulo bedanken voor de steun en prof. dr. Silvia Reni Uliana voor het leveren van de glasweefselmolen. Dit werk werd ondersteund door Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - MFLS' subsidie 2017/23933-3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well plateGreiner bio-ne655180Een plaat met platte bodem voor beperkende verdunningstests
adenineSigmaA8626Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media
caliperMitutoyo700-118-20Een schuifmaat om de dikte van de voetkussen te meten
cell culture flaskCorning353014Een celcultuurkolf van 25 cm2 om Leishmania parasieten te kweken
centrifugeEppendorf5804REen apparaat gebruikt voor het scheiden van monsters op basis van dichtheid
CO2 incubator 34 °CThermo Scientific3110Een incubator voor amastigotendifferentiatie
ethanolMerckK50237083820Een ontsmettingsmiddel voor algemene items
fetal bovine serumGibco12657-029Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media
glass tissue grinder tubeThomas Scientific3431 E04Een buis om besmet voetkussentissue te verzamelen en te verstoren
glucoseSynthG1008.01.AHAanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media
GraphPad Prism SoftwareGraphPadEen software gebruikt om de gegevens uit te zetten en statistische significantie te berekenen
heminSigmaH-2250Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media
HEPESPromegaH5303Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media
incubator 25 °CFanem347CDEen incubator voor promastigotencultivatie
inverted microscopeNikonTMSEen apparaat gebruikt voor visuele analyse van promastigoot en amastigoot culturen
isofluraneEen inhalatieanestheticum voor muizen (3-5%)
laminar flow cabinetVecoVLFS-09Een bioveiligheidskast gebruikt voor aseptische werkruimte
M199 celcultuur mediaGibco31100-035Een celcultuurmedium voor Leishmania-cultivatie
microcentrifuge tubeAxygenMCT150CEen microbuis gebruikt voor monsterverzameling, verwerking en opslag
multichanel pipetteLabsystemsF61978Een multikanaals pipette gebruikt voor beperkende verdunningstest
NaHCO3Merck6329Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media
NaOHSigmaS8045Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media
Neubauer chamberHBG2266Een hemocytometer om de parasietensuspensie te tellen
optical microscopeNikonE200Een optisch apparaat gebruikt om parasieten te tellen
parafilmBemis349Een flexibele en resistente kunststof om de plaat te verzegelen
penicillin/streptomycinGibco15140122Aanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media
Petri dishesTPP93100Een steriele schaal om het voetkussentissue te dissecteren
pipetman kitGilsonF167360Een micropipetkit met vier pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scaleQuimisBG2000Een apparaat gebruikt om verzamelde voetkussenlaesies te wegen
scalpelSolidor10237580026Een scalpel om voetkussentissue te snijden en te verzamelen
serological pipette 10 mLNest327001Een steriele pipette gebruikt voor het overbrengen van milliliter volumes
tipsAxygenEen pipette tip gebruikt voor het overbrengen van microliter volumes
Trypan blueGibco15250-061Een kleurstof gebruikt om levensvatbare parasieten te tellen
trypticase peptoneMerckAanvulling toegevoegd aan M199 celcultuur media
tuberculin syringeBD305945Een spuit met 27G naald om de parasietensuspensie te inoculeren

Referenties

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671(2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296(2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13(2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300(2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052(2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594(2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165(2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140(2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025(2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22(2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108(2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486(2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022(2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238(2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144(2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80(2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266(2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340(2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279(2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764(2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842(2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980(2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554(2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026(2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

muizenvoetzoolcutane leishmaniasisprogressie van de laesiebepaling van de parasitaire belastingaxene amastigotensubplantaire inoculatielimiterende verdunningsanalyse
In Vivo Infectie met Leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.