Multidimensionaal Coculture System model Long Plaveisel Carcinoom Progressie

Samenvatting

Een in vitro model systeem werd ontwikkeld om weefsel architectonische veranderingen vast te leggen tijdens long plaveisel carcinoom (LUSC) progressie in een 3-dimensionale (3D) co-cultuur met kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs). Dit organoïde systeem biedt een uniek platform om de rollen van diverse tumorcel-intrinsieke en extrinsieke veranderingen te onderzoeken die het tumorfenotype moduleren.

Samenvatting

Tumor-stroma interacties spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van longplaveisel carcinoom (LUSC). Echter, begrijpen hoe deze dynamische interacties bijdragen aan weefsel architectonische veranderingen waargenomen tijdens tumorigenese blijft uitdagend vanwege het ontbreken van geschikte modellen. In dit protocol beschrijven we de generatie van een 3D cocultuurmodel met behulp van een LUSC primaire celcultuur bekend als TUM622. TUM622 cellen werden opgericht uit een LUSC patiënt-afgeleide xenograft (PDX) en hebben de unieke eigenschap om acinar-achtige structuren te vormen wanneer gezaaid in een kelder membraan matrix. We tonen aan dat TUM622 acini in 3D cocultuur de belangrijkste kenmerken van weefselarchitectuur recapituleert tijdens LUSC-progressie en de dynamische interacties tussen LUSC-cellen en componenten van de tumormicroomgeving (TME), inclusief de extracellulaire matrix (ECM) en kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs). We passen ons belangrijkste 3D-kweekprotocol verder aan om aan te tonen hoe dit systeem kan worden gebruikt voor verschillende downstream-analyses. Over het algemeen creëert dit organoïde model een biologisch rijk en aanpasbaar platform dat men in staat stelt om inzicht te krijgen in de cel-intrinsieke en extrinsieke mechanismen die de verstoring van epitheelarchitecturen tijdens carcinoma progressie bevorderen en zal helpen het zoeken naar nieuwe therapeutische doelen en diagnostische markers.

Inleiding

Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte wereldwijd. Longplaveisel celcarcinoom (LUSC), dat is de tweede meest voorkomende vorm van niet-kleincellige longkanker (NSCLC) en is goed voor ongeveer 30% van alle longkanker, wordt vaak gediagnosticeerd in vergevorderde stadia en heeft een slechte prognose¹. Behandeling opties voor LUSC patiënten zijn een grote onvervulde behoefte die kan worden verbeterd door een beter begrip van de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen die LUSC tumorigenese rijden.

Zoals bij de meeste menselijke kankers, wordt de pathogenese van LUSC gekenmerkt door de verstoring van de intacte, goed geordende epitheelweefselarchitectuur². Tijdens dit proces gaan goede apical-basale celpolariteit, celcel- en celmatrixcontacten verloren, waardoor ongecontroleerde groei en invasief gedrag van de tumorcellen mogelijk worden. Het wordt nu algemeen gewaardeerd dat de kwaadaardige kenmerken van kankercellen niet kunnen worden gemanifesteerd zonder een belangrijk samenspel tussen kankercellen en hun lokale tumor micro-omgeving (TME)³. Belangrijke componenten in de TME, waaronder extracellulaire matrix (ECM), kankergerelateerde fibroblasten (CAF's) en endotheelcellen en infiltrerende immuuncellen geven actief vorm aan de TME en drijft tumorigenese⁴aan. Niettemin, onze huidige begrip van hoe de tumorcellen en deze belangrijke componenten in de TME interactie om weefsel architectonische veranderingen rijden tijdens LUSC progressie is zeer beperkt.

Driedimensionale (3D) cultuur is een belangrijk instrument om de biologische activiteiten van cel-intrinsieke en extrinsieke veranderingen in het reguleren van weefsel architecturale veranderingen in zowel normale als zieke weefsels⁵te bestuderen. 3D-culturen bieden de juiste structurele en functionele context die meestal ontbreekt in traditionele tweedimensionale (2D) culturen. De toegevoegde afmetingen van dergelijke systemen bootsen weefsel in vivo nauwer na in vele aspecten van celfysiologie en cellulair gedrag, waaronder proliferatie, differentiatie, migratie, eiwitexpressie en reactie op medicamenteuze behandeling. In de afgelopen jaren hebben inspanningen van verschillende laboratoria geleid tot de ontwikkeling van in vitro 3D-modellen voor zowel de normale long als NSCLC^6,7,8. Echter, een model voor longplaveisel carcinoom dat zowel de dynamische weefsel architectonische veranderingen tijdens tumorigenese kan samenvatten als nemen van belangrijke stromal componenten was niet beschikbaar.

Hier beschrijven we de methoden voor het opzetten van een nieuwe 3-dimensionale (3D) cocultuur systeem met behulp van primaire PDX-afgeleide LUSC cellen (tum622) en CAFs^9,10. Zowel TUM622 als CAFs zijn afgeleid van NSCLC-patiënt met slecht gedifferentieerde tumoren¹⁰. Wanneer ingebed als enkele cellen in ECM, een zeldzame subpopulatie van TUM622 cellen hebben de capaciteit om organoïden te vormen met acinaire-achtige structuren die een goede apical-basale cel polariteit weer te geven. Deze acinar-achtige structuren zijn hyperplastisch, vertonen heterogene expressie van stengel-achtige en differentiatie markers vergelijkbaar met de oorspronkelijke tumor, terwijl de resterende niet-invasieve, en dus na te bootsen de vroegste fase van lusc ontwikkeling. Belangrijk is dat we aantoonden dat de weefselarchitectuur van de acinaire-achtige structuren kan worden veranderd door remming van cel-intrinsieke signaleringstrajecten met kleine molecuulremmers of toevoeging van belangrijke componenten in de ECM, zoals CAFs, waarvan de laatste de acini-vorming verbetert en de acini verder uitlokt om invasief te worden wanneer ze in de nabijheid zijn. Samen suggereren deze gegevens dat dit 3D-cocultuursysteem van LUSC-organoïden een waardevol platform biedt voor het onderzoek naar de dynamische wederkerigheid tussen LUSC-cellen en de TME en kan worden aangepast voor het monitoren van de respons van LUSC-cellen op medicamenteuze behandeling¹¹.

Protocol

1. Passaging en culturing TUM622 Cellen en CAFs in 2D Culturen

1. Het doorgeven en kweken van TUM622 cellen
   1. Warm 3D kweekmedium en celdissociatiereagentia (zie Materiaaltabel) voor TUM622-cellen bij 37 °C.
   2. Passage TUM622 cellen bij 80% samenvloeiing in 2D-kolven. Meestal gebeurt dit 1 week na het passeren.
   3. Gooi oud medium uit een T75-kolf en was eenmaal met 6 mL HEPES-buffer. Vermijd pipetteren direct op de cellen.
   4. De HEPES-buffer aanzuigen. Voeg 4 mL trypsin/EDTA (0,25 mg/mL, zie Materiaaltabel)toe voor een snelle spoeling en gooi de trypsin/EDTA weg.
   5. Voeg 2 mL trypsin/EDTA toe en uitbroed bij 37 °C gedurende 5 min. Haal kolven uit de couveuse en tik op de kolven om de cellen los te maken zonder luchtbellen te maken en de kolven voor nog eens 5 min terug te brengen naar de couveuse.
      OPMERKING: Langdurige blootstelling aan trypsine zal de cellen onomkeerbaar beschadigen en hun fenotype veranderen, dus het wordt aanbevolen om de tijd te beperken die cellen worden blootgesteld aan trypsine.
   6. Bevestig cellen zijn losgemaakt en gescheiden onder een lichtmicroscoop (4x of 10x). Voeg 4 mL neutralisatiebuffer (TNS-buffer) (zie subcultuurreagenasinformatie in de Materiaaltabel)toe, gevolgd door 10 mL 3D-kweekmedium (zie Tabel met materialen).
   7. Pipetteer voorzichtig op en neer om de cellen verder te scheiden met behulp van een 10 mL pipet. Breng de vering via een 40 μm celzeef over in een conische buis van 50 mL.
   8. Tel celnummers met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.
   9. Zaad 0,8 x 10⁶ cellen/T75-kolf in 20 mL 3D kweekmedium (zie Materiaaltabel).
   10. Voer de cellen om de andere dag door het vervangen van de helft van het gebruikte medium met vers medium.
2. Het doorgeven en kweken van CAFs
   1. Passage CAFs wanneer cellen samenvloeiing bereiken. Meestal gebeurt dit na 5 dagen van het kweken van een 1:2 split.
   2. Bereid CAF medium met behulp van RPMI basale medium met 20% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 1% L-Glutamine en 1% Penicilline / Streptomycine. Verwarm het medium tot 37 °C.
   3. Spoel in een T75-kolf CAF's met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) eenmaal toe en voeg vervolgens 2 mL trypsine/EDTA toe en uitbroed bij 37 °C gedurende 5 min.
   4. Observeer onder een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat cellen in de kolf zijn gescheiden (4x of 10x). Zo niet, verleng de incubatie nog 2-3 min.
   5. Zodra cellen zijn losgemaakt en gescheiden, voeg 10 mL 3D-kweekmedium toe om de trypsine/EDTA te neutraliseren en meerdere keren op en neer te pipetomen om de CAF's verder te scheiden.
   6. Breng de celvering over in een conische buis van 50 mL en draai op 300 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
   7. Gooi de supernatant weg en bretel de pellet opnieuw in een passend volume van 3D-kweekmedium (zie Tabel met materialen)en passage in twee nieuwe T75-kolven.

2. Beplating TUM622 Cellen in de Extracellulaire Matrix voor 3D Culturing

1. De dag voor het experiment, dooi flesjes van kelder membraan matrix in een 4 °C koelkast 's nachts. Cooldown plastic pipetten (2 mL) en tips op -20 °C 's nachts.
   LET OP: Niet alle veel kelder membraan matrix hebben dezelfde capaciteit om de 3D-groei van TUM622 cellen te ondersteunen. Daarom is het noodzakelijk om meerdere partijen keldermembraanmatrix te verwerven en te testen om degenen te identificeren die robuuste acini-vorming ondersteunen. Meestal vereist dit een hogere eiwitconcentratie (16-18 mg/mL) in de matrix.
2. Op de dag van het experiment, warm 3D cultuurmedium, HEPES buffer, trypsin/EDTA en trypsine neutralisatie buffer (TNS) in een waterbad van 37 °C. Neem vlak voor het opzetten van de cultuur de ontdooide keldermembraanmatrix uit de koelkast en zet het flesje op ijs.
3. Koel de weefselkweekplaten af op een metalen platformkoeler die op ijs is geplaatst. Plaats centrifugebuizen op een metalen koelrek op ijs.
4. Met behulp van TUM622 cellen verkregen uit stap 1.1.7, bereken het gewenste aantal cellen die nodig zijn voor beplating. Typisch, 15.000-30.0000 cellen zijn nodig per put van een 24-put plaat. Lagere dichtheid is meer geschikt voor beeldvorming en kwantificering, terwijl een hogere dichtheid de voorkeur heeft bij het verzamelen van cellen voor RNA-extractie of westerse vlekken.
5. Breng celsuspensie over in een gekoelde centrifugebuis (elke buis met cellen voor drievoudbeplating) en spin met 300 x g in een hangende emmercentrifuge bij 4 °C gedurende 5 min.
6. Aanzuigen van de supernatant zorgvuldig met een aspirating pipet bevestigd aan een ongefilterde tip (20 μL), waardoor ongeveer 100 μL van het medium in de buis (gebruik markeringen op de buis als een gids).
7. Tik voorzichtig op de zijkant van de buis om de pellet los te maken en te scheiden voordat u deze terugbrengt naar het koelrek.
8. Met behulp van de 2 mL voorgekoelde pipetten, meng de matrix voorzichtig door een paar keer op en neer te stampen terwijl het flesje in contact blijft met het ijs. Pipetteer met een gelijkmatige en matige snelheid, zodat er geen bellen worden geïntroduceerd in de matrix tijdens deze procedure.
9. Breng het juiste volume van de matrix over in elke centrifugebuis. Voor beplating drievouden in een 24-put plaat, voeg 1,1 mL kelder membraan matrix aan elke buis.
10. Met behulp van voorgekoelde tips, pipet de matrix in elke buis op en neer ongeveer 10 keer om een uniforme cel vering te maken.
11. Breng 310 μL cel/matrixsuspensie over in elke put van een voorgekoelde 24-putplaat. De pipet wordt geplaatst in een hoek van 90° aan het plaatoppervlak en de suspensie toegevoegd aan het midden van de put. De suspensie moet zich verspreiden en de hele put bedekken zonder dat de plaat hoeft te kantelen.
12. Om downstream immunofluorescentie analyse te vergemakkelijken, plaat de cel / matrix suspensie parallel in 2-put kamer dia's. Breng 100 μL cel/matrixvering over naar het midden van een put van 2-putkamerdia (zie Materiaaltabel). Hierdoor kan de matrix een koepelachtige structuur vormen met een veel kleiner volume.
13. Breng de plaat en de kamer terug in een weefselkweekincubator en broed gedurende 30 min in om de matrix te laten stollen. Bestudeer de plaat/glijbaan onder een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat enkele cellen gelijkmatig worden verdeeld binnen de matrix (4x of 10x).
14. Voeg 1 mL voorverwarmde 3D-cultuur compleet medium toe aan elke put en 1,5 mL 3D-kweekmedium aan elke put van de kamerdia en breng ze vervolgens terug naar de couveuse.

3. 3D Coculturing van TUM622 Cellen en CAF's in de Extracellulaire Matrix

1. Bereid celsuspensen van TUM622 en CAF's voor volgens sectie 2.
2. Tel de CAF-celdichtheid door 10 μL celsuspensie in te nemen en te mengen met 10 μL trypanblauw.
3. Voeg 10 μL van het mengsel toe aan elk van de twee kamers op een hemacytometer om de celdichtheid te tellen en te berekenen.
   OPMERKING: CAF's hebben onregelmatige vormen en kunnen niet nauwkeurig worden geteld op een automatische celteller.
4. Co-inbedding tum622 cellen en CAF's in kelder membraan matrix
   1. Bereken op basis van de celdichtheidsinformatie het gewenste aantal cellen dat wordt gebruikt voor beplating. CAF's worden gezaaid bij een 2:1 verhouding van TUM622 cellen. Voor 30.000 TUM622-cellen die zijn ingezaaid, zijn bijvoorbeeld 60.000 CAF's mede-ingebed.
   2. Breng het juiste volume van TUM622 en CAFs celvering over in dezelfde centrifugebuis en volg stappen 2.5-2.11 voor beplating in 24-well platen. Voor immunofluorescentie mengt 60 μL TUM622/CAFs naar kamerdia's zoals beschreven in stap 2.12).
5. Coculturing TUM622 met bedekte CAF's in keldermembraanmatrix (zie Tabel met materialen)
   1. Opzetten TUM622 mono-cultuur volgens stappen 2.5-2.13.
   2. Breng twee maal het aantal CAFs-suspensie (in vergelijking met het aantal INgezaaide TUM622-cellen) over in een centrifugebuis en spin op 300 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
   3. Aanzuigen van de supernatant en resuspend de CAFs in 1 mL van 3D cultuur medium.
   4. Breng de 1 mL CAFs-suspensie over naar de put die de ingebedde TUM622-cellen bevat.

4. Oogsten TUM622 Acini voor RNA/Eiwitextractie en Fluorescentie-geactiveerde Celsortering (FACS)

1. Bereid de wasbuffer en de celoogstbuffer voor volgens het 3D-celoogstkitprotocol van de vorige dag en chill 's nachts bij 4 °C.
2. Bewaar platen op een plaatkoeler en andere reagentia op ijs voordat u met het extractieproces begint.
3. Aanzuigen media uit 3D-cultuur putten zonder het aanraken van de matrix en voorzichtig wassen de put 3 keer met 1 mL wasbuffer.
4. Aanzuigen van de laatste wasbeurt en voeg 1 mL van de cel oogsten buffer aan elke put.
5. Gebruik een p1000 pipet tip om de matrix af te schrapen van elke put.
6. Pipetteer op en neer om de matrix verder te scheiden.
7. Breng 1 mL van de mix over op een voorgekoelde conische buis van 15 mL. Voeg nog eens 1 mL oogstbuffer toe aan dezelfde put.
8. Herhaal stap 4.5-4.7 en breng alle mix van dezelfde put over in één conische buis van 15 mL.
9. Sluit de buizen af en laat 30 min op 4 °C.
10. Vul elke buis met ijskoude PBS tot 10 mL en centrifugeer vervolgens bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
11. Aanzuigen van de supernatant zonder het aanraken van de pellet. De supernatant moet matrixfragmenten bevatten, maar de sferoïden moeten allemaal worden verzameld aan de onderkant van de buis.
12. Voeg ijskoude PBS toe voor een tweede wasbeurt. Keer de buis een paar keer om de pellet te scheiden. Draai naar beneden op 300 x g voor 5 min.
13. Bereid tijdens het spinnen een lysisbuffer voor voor eiwit- en RNA-verzameling.
14. Trek de supernatant zorgvuldig aan en voeg lysisbuffer toe voor downstream verwerking om eiwitten of RNA te verzamelen. Als alternatief kunnen cellen opnieuw worden opgeschort voor stroomanalyse /FACS-sortering of seriële passaging.

5. Immunofluorescentie van TUM622 Acini

1. Bereid immunofluorescentiebuffer voor (IF-buffer: PBS met 0,1% runderserumalbumine (BSA), 0,2% Triton X-100 en 0,05% Tween-20), primaire blokkeringsbuffer (IF-buffer met 10% geitenserum), secundaire blokkeringsbuffer (primaire blokkeringsbuffer met 20 μg/mL geitanti-muis F(ab')₂)
2. Aanzuigen medium van 2-goed kamer dia's, spoel een keer met PBS en zet de dia op metalen plaat koeler op ijs. De kamerschuif moet de rest van het protocol op de metalen plaatkoeler blijven.
3. Voeg voorgekoelde 4% PFA toe om de acini te repareren en 20 min op ijs in te broeden.
4. Verwijder 4% PFA en was drie keer met 2 mL voorgekoelde PBS elk gedurende 5 min met zacht rocken op een rocker.
5. Aspirate PBS en permeabilize met 1,5 mL van 0,5% Triton X-100 in PBS (voorgekoeld) gedurende 20 min. Tegen het einde van deze procedure zal de koepelachtige structuur losraken.
6. Trek voorzichtig de permeabilisatiebuffer van de kamerschuif aan om monsterverlies te voorkomen. Dit wordt bereikt door een fijne tip (20 μL) aan de aspirating pipet toe te voegen en de punt naar de hoek van de kamer te drukken.
7. Was drie keer met 2 mL voorgekoelde PBS elk gedurende 5 min met zacht rocken op een rocker.
8. Blokkeer het monster met de primaire blokkeringsbuffer op ijs gedurende 1 uur.
9. Verwijder de primaire blokkeringsbuffer en voeg secundaire blokkeringsbuffer toe en blokkeer gedurende 30 min.
10. Voeg primaire antilichamen toe in de primaire blokkeringsbuffer en bebroed 's nachts bij 4 °C.
    OPMERKING: De concentratie van de hier gebruikte antilichamen moet hoger zijn dan normaal gebruikt voor kleuringscellen in de 2D-cultuur. De meeste primaire antilichamen die in deze studie worden gebruikt, worden verdund bij 1:100 verdunning (zie Tabel met materialen).
11. Verwijder primaire antilichamen en was het monster 3 keer met 2 mL koude IF-buffer.
    LET OP: De monsters kunnen los zijn, extra voorzichtig zijn bij het aspirating.
12. Bebroed de monsters in secundaire antilichamen verdund in primaire blokkeringsbuffer gedurende 1 uur bij RT. De voorkeur secundaire antilichamen moeten zeer cross-adsorbed om achtergrond kleuring te verminderen. De meeste secundaire antilichamen die in deze studie worden gebruikt, worden verdund bij 1:200 verdunning.
13. Verwijder secundaire antilichamen en was het monster 3 keer met 2 mL koude IF-buffer.
    LET OP: De monsters kunnen los zijn, extra voorzichtig zijn bij het aspirating.
14. Voeg PBS met DAPI (1:1.000 verdunning) toe tijdens de laatste wasbeurt om de kern te bevlekken. Het uitvoeren van een andere 2 wasbeurten in PBS.
15. Beeld de monsters op een confocale microscoop binnen 3 dagen.
    OPMERKING: Vanwege de grootte van de organoïden en grenzen in de werkafstand van het doel, worden monsters meestal afgebeeld op 10x of 20x vergroting.

6. 3D-cultuurmonsters voorbereiden op immunohistochemie

1. Aanzuigenmedium van 2-put kamerdia's en één keer spoelen met PBS.
2. Fix 3D culturen in 4% PFA bij 37 °C 's nachts.
3. Verwijder 4% PFA, omring culturen met 2,5 mL histologie monstergel (zie Tabel met materialen) en plaats de dia op 4 °C om te stollen voor ten minste 1 uur.
4. Breng monsters omgeven met histologische monstergel over naar weefselcassettes en 's nachts verwerkt in een geautomatiseerde weefselmonsterverwerker.
5. Insluit monsters in paraffinewas en bereid je voor op het delen^{van 12}.

7. 3D Cytotoxiciteit Test voor Samengestelde Screening (Voorbeeld voor Een 96-well Plate)

1. Zet een 96-put plaat op een plaat koeler, een 25 mL reservoir op een reservoir koeler en een 15 mL conische buizen op ijs voor het starten van het experiment.
2. Bereid celmatrixsuspensen van TUM622-cellen voor in een voorgekoelde polypropyleenconische buis van 15 mL door het juiste volume keldermembraanmatrix aan cellen toe te voegen. De gewenste dichtheid voor TUM622 cellen is 10.000 cellen per 70-75 μL keldermembraanmatrix. Pipetteer een paar keer op en neer om zelfs het mengen van cellen binnen de matrix mogelijk te maken.
3. Verplaats de plaat met plaatkoeler en reservoir met een reservoirkoeler weg van het ijs naar een droog oppervlak om contact van keldermembraanmatrix met ijs tijdens de overdracht te voorkomen.
4. Breng het matrixcelmengsel over naar het koelreservoir zonder bellen te creëren.
5. Breng met behulp van een mechanische meerkanaals pipet (10-300 μL) 70-75 μL van de mengcellen over in elke geschikte put van een 96-put.
6. Incubeer plaat bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 30 min voor de keldermembraanmatrix om te stollen.
7. Voeg 100 μL media toe in alle rijen en breng de plaat terug naar de couveuse.
8. Start samengestelde doseren de volgende dag of later, afhankelijk van het doel van het experiment.
9. Sferoïden kunnen worden opnieuw gevoed en opnieuw gedoseerd om de 2-3 dagen voor maximaal 10 dagen, door het verwijderen van gebruikte media met een 8- of 12-put vacuüm spruitstuk en vervangen door verse media met of zonder gewenste verbindingen.
10. Het aantal TUM622 sferoïden kan worden gekwantificeerd met behulp van 3D imager volgens het protocol van de fabrikant.

Resultaten

TUM622 en CAF's in 2D cultuur
Figuur 1 presenteert de typische morfologie van TUM622 cellen en CAF's in de 2D-cultuur. TUM622 cellen zijn afgerond met grote kernen, terwijl CAFs zijn plat en langwerpig. TUM622 cellen kunnen 80%-90% samenvloeiing in cultuur bereiken. Verdere proliferatie leidt tot meer, maar kleinere cellen samengevoegd in kolonies die niet in direct contact komen. In tegenstelling, CAFs de voorkeur aan groeien bij een hoge...

Discussie

Tumoren zijn heterogene weefsels samengesteld uit kankercellen naast elkaar bestaande met stromalcellen zoals kanker-geassocieerde fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen binnen de ECM. Samen, deze diverse componenten cross-talk en invloed op de tumor micro-omgeving, het spelen van een actieve rol in het stimuleren van tumorigenese, een proces dat progressieve veranderingen in tumorarchitectuur impliceert. Idealiter moet een in vitro model van tumorontwikkeling in staat zijn om de dynamische weefselarchitecturale v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bronchial Epithelial Growth Medium	Lonza	CC-3170	BEGM
Cell Strainer 40um	ThermoFisher	352340	Voor het passeren van TUM622-cellen
Cleaved Caspase 3 antibody	Cell Signaling Technology	9661 (RRID:AB_2341188)	Konijn
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	Voor 3D-cultuur
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	Voor 3D-cultuur
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture)	Bio-Techne	3443-005-01	Voor 3D-cultuur
CXCR4 antibody	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	Konijn
E-cadherin antibody	BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	Muis
GelCount	Oxford Optronix		Voor Acini-tellingen en -metingen
GM130 antibody	BD Biosciences	610822 (RRID:AB_398141)	Muis
Goat Serum	Vector Labs	S1000 (RRID:AB_2336615)	Voor immunofluorescentie
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	Voor CAFs
Histology sample gel	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	Voor immunofluorescentie
Integrin alpha 6 antibody	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID:AB_2128317)	Raad
Involucrin antibody	Abcam	Ab68 (RRID:AB_305656)	Muis
Ki67 antibody	Abcam	Ab15580 (RRID:AB_443209)	Konijn
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155379 (2)	Voor 3D-cultuur
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155409 (8)	Voor 3D-cultuur
L-Glutamine	Gibco	25030-081	Voor CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture)	Corning	356231	Voor 3D-cultuur
p63 antibody	Cell Signaling Technology	13109 (SRRID:AB_2637091)	Konijn
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Voor CAFs
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034	Voor TUM622 celdissociatie
RPMI	ThermoFisher	11875-093	Voor CAFs
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579 (RRID:AB_2195767)	Konijn
TrypLE Express	Gibco	12604-021	Voor CAF dissociatie
Vi-Cell	Bechman Coulter		Automatische celteller
Vimentin antibody	Abcam	Ab92547 (RRID:AB_10562134)	Konijn
β-catenin antibody	Cell Signaling Technology	2677s (RRID:AB_1030943)	Muis